Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden

21.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59106

⸱

7 januari 2019

 ,  , 
1Department of Biosystems Engineering, Auburn University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te bouwen van lab-schaal zeepbel kolom photobioreactors en ze gebruiken om cultuur microalgen. Het biedt ook een methode voor de bepaling van de groeisnelheid van de cultuur en de neutrale vetgehalte.

Samenvatting

Er is aanzienlijke interesse in de studie van microalgen voor waterbouwkundige toepassingen zoals de productie van biobrandstoffen, hoogwaardige producten, en voor de behandeling van afval. Zoals de meeste nieuwe onderzoeksinspanningen op laboratoriumschaal beginnen, is er behoefte aan een kosteneffectieve methoden voor het kweken van microalgen op een reproduceerbare wijze. Hier, communiceren we een effectieve benadering van cultuur microalgen in laboratoriumschaal photobioreactors en de groei en de neutrale vetgehalte van die algen te meten. Instructies vindt u ook op het instellen van het photobioreactor-systeem. Hoewel de organismen voorbeeld soorten Chlorella en Auxenochlorella zijn, kan dit systeem worden aangepast om het kweken van een breed scala van microalgen, met inbegrip van co culturen van algen met niet-algen soorten. Stamculturen worden eerst gekweekt in flessen te produceren van entmateriaal voor het photobioreactor-systeem. Algen entmateriaal is geconcentreerd en overgedragen aan photobioreactors voor de teelt in de batchmodus. Monsters worden dagelijks verzameld voor de gemeten optische dichtheid. Aan het einde van de batch-cultuur, cellen worden geoogst door centrifuge, gewassen, en gedroogd tot een droge eindgewicht verwachte concentratie aan bevriezen. De droge eindgewicht concentratie wordt gebruikt voor het maken van een correlatie tussen de optische dichtheid en de concentratie van het drooggewicht. Een gemodificeerde Folch methode wordt vervolgens gebruikt om totale lipiden uittreksel uit de gevriesdroogde biomassa en het extract is vehiculumcontrolegroep haar neutrale vetgehalte met behulp van een microplate-assay. Deze bepaling heeft eerder gepubliceerd maar protocol stappen waren hier om te markeren van kritische stappen in de procedure waar fouten vaak voorkomen. Het systeem van de bioreactor hier beschreven vult een niche tussen eenvoudige kolf teelt en volledig gecontroleerde commerciële bioreactoren. Zelfs met slechts 3-4 biologische repliceert per behandeling, onze benadering van het kweken van algen leidt tot strakke standaarddeviaties in de groei en lipide testen.

Inleiding

De toepassing van microalgen in engineering en biotechnologie heeft aangetrokken veel belangstelling in de afgelopen jaren. Microalgen worden bestudeerd voor gebruik in afvalwater behandeling,1,2,3,4, biobrandstof productie5,6,7,8, en de productie van nutraceuticals en andere hoogwaardige producten9,10. Algen zijn ook wordt genetisch gemodificeerde tegen grotere prijzen in een poging om hun geschiktheid voor specifieke technische toepassingen11,12te verbeteren. Er is dus grote belangstelling voor experimenten met industrieel relevante organismen in gecontroleerde instellingen. Het doel van deze methode is een doeltreffende benadering van cultuur microalgen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving communiceren en voor het meten van de groei en de neutrale vetgehalte van die algen. Verbetering van groei tarieven en neutrale vetgehalte van microalgen zijn geïdentificeerd als twee grote knelpunten richting van commercialisering van algen biobrandstoffen13.

Een breed scala van benaderingen zijn gebruikt om cultuur algen voor experimentele doeleinden. In het algemeen, kunnen deze benaderingen worden verdeeld tussen grootschalige outdoor teelt en kleinschalige binnen kweek. Outdoor teelt in photobioreactors en open vijvers is geschikt voor experimenten gericht op schaalvergroting van processen die reeds hebben bewezen op laboratoriumschaal (bijvoorbeeld voor het testen van schaal-up van een nieuwe hoge-lipide-stam van algen)14. Echter binnen kleinschalige teelt geschikt bij het ontwikkelen van nieuwe of verbeterde algen stammen is of het uitvoeren van experimenten gericht op het begrip biologische mechanismen. In deze laatste gevallen moet een hoge mate van experimentele controle plagen uit subtiele veranderingen in de biologische werking. Te dien einde zijn een culturen vaak nodig om te minimaliseren van de complexe biotische factoren die samenhangen met andere organismen (bijvoorbeeld bacteriën, en andere algen) die onvermijdelijk in grootschalige outdoor systemen groeien. Zelfs bij de studie van interacties tussen algen en andere organismen, die we hebben gevonden dat gebruik van hoogst-gecontroleerde experimentele omstandigheden nuttig is bij de behandeling van moleculaire uitwisseling tussen organismen15,16,17.

Binnen de categorie van kleinschalige indoor algen teelt en een aantal benaderingen zijn gebruikt. Misschien is de meest voorkomende benadering groeien algen in conische kolven op een shaker tafel onder een lichte bank18,19. Uitwisseling van zuurstof en CO2 vindt plaats door passieve diffusie door middel van een stekker schuim in de top van de kolf. Sommige onderzoekers hebben deze set-up via actieve beluchting van de kolven20verbeterd. Een andere aanpak is het kweken van algen in flessen, gemixt door roer bar en actieve beluchting. Ondanks hun eenvoud, hebben we vonden dat het gebruik van flacons en flessen vaak tot een inconsistente resultaten van biologische replicaat-organismen leidt. Vermoedelijk is dit te wijten aan de positie effecten - verschillende posities krijgen verschillende hoeveelheden van het licht, die ook van invloed op interne reactor temperaturen. Dagelijkse rotatie van reactoren naar nieuwe posities kan helpen, maar is niet het probleem verlichten omdat bepaalde fases van de groei van algen (bijvoorbeeld vroeg exponentiële) zijn gevoeliger voor positionele effecten dan anderen (bijvoorbeeld log fase).

Aan de andere kant van het spectrum van technologische geavanceerdheid zijn volledig gecontroleerde commerciële photobioreactors. Deze systemen voortdurend controleren en aanpassen van de omstandigheden in de reactor voor het optimaliseren van de groei van algen. Ze hebben programmeerbare verlichting, real-time temperatuurregeling en pH-control. Helaas, ze zijn duur en typisch kosten duizenden dollars per reactor. Meest wetenschappelijke en technische tijdschriften vereisen biologische replicatie van resultaten, waardoor de aankoop van meerdere bioreactoren. Wij presenteren hier een zeepbel kolom reactor systeem dat de kloof tussen de eenvoudige (kolf) en geavanceerde (volledig gecontroleerde bioreactor) benaderingen voor lab-schaal algen teelt bruggen. Bubble kolommen kunnen stijgende gasbellen gas uitwisseling en meng de reactor. Deze aanpak biedt een zekere mate van controle over de verlichting en de temperatuur, maar doet dit op een manier die rendabel. Bovendien hebben we gevonden dit systeem zeer consistente resultaten van biologische replicaat-organismen, vermindering van het vereiste aantal biologische replicatieonderzoeken noodzakelijk zijn voor het verkrijgen van statistisch significante resultaten in vergelijking met de kolf of fles aanpak. Ook hebben we dit systeem gebruikt te kweken mengsels van algen en bacteriën21. Naast de teelt van algen schetsen we een procedure voor het meten van de neutrale vetgehalte in de gekweekte algen. De laatste methode is gepubliceerd elders22, maar ook hier de procedure om te bieden stapsgewijze instructies voor het met succes gebruiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. installatie van Bubble kolom Photobioreactors

  1. Bouw van een aantal ontlucht deksels van de kunststof deksels die kwam met de 1 L glazen flessen en kruising buizen (Zie Figuur 1 voor schema en foto's). Deksels voor de luchtbevochtiger, mengen elke fles reactor, val en elke air lift photobioreactor te bouwen.
    1. Boorgaten ¼" in het deksel: 2 gaten zijn nodig voor bioreactor en luchtbevochtiger deksels; 3 gaatjes zijn nodig voor de mengen val.
    2. Slip een ¼" O-ring over de draden van een 1/8" panel mount Luer montage en schuif deze in de ¼" gat geboord in het deksel (figuur 1A).
    3. Slip een tweede ¼" O-ring over de draden zodat het deksel is ingeklemd tussen de twee O-ringen. Glijden van een tegenmoer op de draden en draai om op te lossen van het panel mount Luer in plaats.
    4. Magnetisch slot ringen op de blootgestelde mannelijke Luer projecteren vanuit het deksel. Herhaal de stappen 1.1.2-1.1.4 voor elk gat in het deksel.
    5. Voor deksels die zal worden gebruikt op bubble kolom en fles reactoren, hechten 1/8" vrouwelijke Luer aan barb hulpstukken aan 1.5" stukken van 1/8" ID PVC buis. Bevestig deze aan elk van de blootgestelde mannelijke Luer-armaturen op de deksel.
    6. Een terugslagklep (wijzend uit de buurt van de deksel) verbinden met het vrije uiteinde van één van de 1/8" stukken.
      Opmerking: Dit zal dienen als de poort van de uitlaat voor de bioreactor.
    7. Een mannelijke Luer verbinden met Weerhaak passend om het tweede stuk van 1/8" slang projecteren vanuit het deksel. Vastklikken van de roterende lock ring en zet een 0,2 mm luchtfilter daartoe vast.
      Opmerking: Dit zal dienen als de perszijde van de reactor.

figure-protocol-1
Figuur 1. Schema en foto's voor de bouw van de bioreactoren. (A) Schematische voor de bouw van de bioreactor deksels (B) foto van het geassembleerde bioreactor deksel, en (C) foto van het geassembleerde deksel, gebruikt voor de luchtbevochtiger. Merk op dat de luchtbevochtiger-hulpstukken moeten worden gecoat in waterdichte siliconen om een luchtdichte zegel met het deksel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Monteren van het uitvoeringssysteem lucht (Zie figuur 2A en 2B voor een schema en de foto).
    1. 1/8" NPT draad aan barb hulpstukken aan de inhammen en de afzetmogelijkheden op de achterkant van elke rotameter koppelen.
      Opmerking: 200-2.500 cm3/min rotameters zijn voor lucht druk modulatie stroomopwaarts van de luchtbevochtiger, 100 en 1000 cm3/min rotameters zijn voor fles reactoren, 50-500 cm3/min rotameters zijn voor air lift bioreactoren en 5-50 cm3/ min rotemeters zijn voor CO2 stroom verordening. Het is aanbevolen om mount rotameters op een vast oppervlak (bijvoorbeeld plastic folie) zodat ze niet tijdens operatie vallen.
    2. De compressor is uitgeschakeld, dan ¼" ID flexibel PVC buizen verbinden met de bron van samengeperste lucht met een slangklem. De slang diameter aftreden op 1/8" ID PVC flexibele buis met behulp van een ¼" vrouwelijke barb montage en een 1/8" mannelijke barb montage.
    3. Sluit het vrije uiteinde van de buis 1/8"-ID aan de inlaat van een 200-2.500 cm3/min rotameter.
      Opmerking: De uitlaat van deze rotameter zal voeden de luchtbevochtiger fles via ID buis 1/8".
    4. Sluit de 1/8" slang aan een inham aan een geventileerde deksel (gebruik een vrouwelijke Luer aan barb passend om de verbinding te maken). Sluit een tweede bagagestuk van 1/8" slang aan de binnenkant van het panel mount passend.
      Opmerking: Dit stuk zal hangen naar beneden in de luchtbevochtiger en Bel air door het water.
    5. Hechten 1/8" vrouwelijke Luer barb fittingen aan beide uiteinden van een stuk van 1/8" ID buis en gebruiken van dit stuk de uitlaat van de luchtbevochtiger verbinden met de inlaat van de mengen val.
    6. Op dezelfde wijze als 1.2.5, door de uitlaat van de CO2 -regulator te verbinden door een tweede poort op de mengen val.
    7. Bouwen van een variëteit met 1/8" slang en 1/8" meerpoortige barb (Zie Figuur 2 C) lucht worden meegenomen bij de rotameter banken.
      Opmerking: Deze rotameters zal worden gebruikt voor de levering van de bioreactoren. Vermijd bouw van meer dan 6 rotameters in serie. In plaats daarvan gebruik parallelle banken van rotameters uit te breiden van het systeem. Zorgen dat de vraag van de totale stroom voor alle reactoren minder dan 2500 cm3/min is (of anders een grotere rotameter nodig zullen zijn voor de luchtbevochtiger).
    8. De uitlaat (3rd poort) van de mengen val sluit aan op de nieuw gebouwde rotameter banken met behulp van 1/8" buizen en een 1/8" female naar barb Luer.
    9. Sluit van voldoende lange 1/8" slang aan de outlets van elke rotameter in de rotameter bank voor de levering van de lucht naar de bioreactoren. Label de uiteinden van de buis, alsmede de rotameters in de bank.
    10. Toepassing waterdichte siliconen rond alle havens op de luchtbevochtiger en mengen van Val deksels om ervoor te zorgen dat ze worden luchtdicht.

figure-protocol-2
Figuur 2. Schema en foto's voor het samenstellen van de zeepbel kolom systeem. (A) Schematische voorstelling van de beluchting systeem (B) foto van de luchtbevochtiger, mengen van de val, en rotameter bank, en (C) foto van de variëteiten gebruikt de rotameter banken om elkaar te verbinden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Instellen van aquaria, roer platen en licht (Figuur 3).
    Let op: Dit systeem vereist een groot aantal verkooppunten en voldoende circuit capaciteit ter ondersteuning van alle onderdelen. Vermijd rijgen samen meerdere stekkerdozen en verlengkabels in een serieschakeling mode want dit een elektrische gevaren is. Gebruik van GFI type verkooppunten en stekkerdozen wordt sterk aangemoedigd als gevolg van de aanwezigheid van water in het systeem.
    1. Regelen van de laag-profiel Magneetroerders op een vlak oppervlak dat sterk genoeg is om te houden van het gewicht van water gevulde aquaria.
    2. Kleine houten of plastic blokken plaats (die iets groter dan de platen van de roer) rond de omtrek van de roer platen ter ondersteuning van het gewicht van de vissentanks.
      Let op: Vermijd plaatsen de vissentanks rechtstreeks op de platen van de roer als het gewicht hen verpletteren zal.
    3. Plaats de vissentanks over de roer-platen en blokken ondersteuning en de tanks met water vullen.
    4. Knip een stukje van een stijve kunststof blad om te passen op de top van de vissentank zoals een deksel. Gaten in deze dekking te glijden in en uit de kruising buizen snijden. Ook een gat voor de vis tankverwarming.
    5. Schik de fluorescerende licht banken naast de vissentank om horizontale verlichtingssterkte van de bioreactoren. Steek de lichte bank in een lichte timer instellen van een dag/nacht-cyclus.

figure-protocol-3
Figuur 3. Systeem schema voor de fles bioreactoren (links) en de photobioreactors van de kolom van de zeepbel (rechts). Dit cijfer is gewijzigd van Higgins et al. 17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. voorbereiding van microalgen entmateriaal

  1. Microalgen entmateriaal verkrijgen bij een cryo-bewaard, vergulde of vloeibare cultuur.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen dat cryopreserved organismen worden verguld vóór het gebruik als entmateriaal om ervoor te zorgen dat cellen levensvatbaar zijn en dat de resulterende cultuur een is. Agar medium (bv., ATCC #5 Sporulerende agar)21 is een rijk medium dat werkt goed voor de heropleving van de soorten Chlorella en Auxenochlorella uit cryo-opslag.
  2. 2.4 L anorganisch medium die geschikt is voor de soorten met name microalgen voor te bereiden.
    Opmerking: Voorbeelden zijn N8 middellange23 voor soorten Chlorella, N8-NH4 middelgrote21 voor soorten Auxenochlorella. Gebruik van een medium geschikt is voor de algen stam is een van de belangrijkste stappen op weg naar robuuste algengroei waarborgen.
  3. Aliquoot 2.4 L anorganisch medium even in drie 1 L glazen flessen, toevoegen roer bars tot elke fles en monteren van de geventileerde deksels (Figuur 1) voor elke fles. Dubbel te controleren dat de beluchting-buis aan de inlaat kant en elke fles is heeft een roer-bar in.
  4. Autoclaaf de voorraad flessen met behulp van een vloeibare sterilisatie cyclus (121 ° C) voor 30 min. autoclaaf 100 mL gedeïoniseerd water (dH2van O) en sommige 1,5 mL buizen op hetzelfde moment, die later zal worden gebruikt voor de beplating. Toestaan dat de middellange-tot koel 's nachts. Anderzijds de reactor tot kamertemperatuur afkoelen en vervolgens gedurende 2 uur voorafgaand aan de inoculatie beluchten.
  5. Inoculeer microalgen uit een plaat of een vloeibare cultuur in de voorraad flessen in een bioveiligheid kabinet (BSC). Steriele techniek gebruiken om een culturen in de volgende stappen.
    1. Voeg 20 mL gesteriliseerde met autoclaaf dH2O naar een centrifugebuis steriele 50 mL. Gebruik een steriele wegwerp 10 µL-lus om te kiezen van verschillende enkele kolonies van de plaat uit stap 2.1. Dompel de lus in de tube van 50 mL en wassen van de algen-cellen in de 20 mL van gesteriliseerde met autoclaaf dH2O. Shake de tube 50 mL om een homogene microalgen oplossing te maken.
    2. Pipetteer van microalgen 6 mL in elke voorraad fles met een steriele serologische pipet 10 mL. Swirl de fles mixen van de microalgen gelijkmatig in het medium.
  6. Gebruik een 2 mL steriele serologische pipet te trekken 1 mL monsters uit elke voorraad fles en overdracht in steriele 1,5 mL buizen.
    Opmerking: Micropipetten worden niet aanbevolen voor deze stap als gevolg van het risico van besmetting. Draai de geventileerde deksels op voorraad flessen.
  7. Plaats van de voorraad flessen op roer platen (~ 150 rpm) en aanpassen van lucht debiet, CO2en verlichting niveau, afhankelijk van de soort. Draaien de positie van de voorraad fles iedere dag.
  8. Verdun de 1 mL monsters opgehaald tijdens stap 2.6 (100-fold verdunning in steriel water werkt meestal goed) en plaat op een rijke agar medium verspreid.
    Opmerking: Deze platen kunnen worden gebruikt om te controleren voor gevallen van besmetting zo goed als fungeren als een bron van toekomstige algen entmateriaal voor verdere experimenten.
  9. Monsters te nemen van de flessen (in het BSC) om de twee dagen om te controleren de groei van de microalgen.
    Leg monsters in een 96-Wells-microplate in drievoud (200 µL) en meet de optische dichtheid (OD) bij 550 nm en 680 nm elke twee dagen tot OD bereikt 0,2-0,3 (die meestal vereist 5-7 dagen).
  10. Stop de incubatie en plaats van de voorraad flessen op een bankje voor 24-48 h om de cellen van de algen te regelen door de zwaartekracht.
    Opmerking: De vaste cellen zal vervolgens gebruikt worden om te enten van de zeepbel kolom photobioreactors. Indien een snellere cel collectie is gewenst, kunnen cellen worden gecentrifugeerd bij niet meer dan 1.000 x g voor het verzamelen van cellen.

3. teelt van microalgen in Bubble kolom Photobioreactors

  1. Eergisteren bioreactor inoculatie, bereid passende media en transfer 200 mL (of gewenste volume) aan de zeepbel kolom photobioreactor buizen (kruising buizen). Autoclaaf buizen met media en ontlucht deksels in plaats.
    Opmerking: Als afvalwater gebruikt als een groeimedium, autoclaaf de lege bioreactoren en steriele gefiltreerd afvalwater toe te voegen (indien een cultuur is gewenst).
  2. De voorraad vaste microalgen concentreren door het verwijderen van het supernatans dat met behulp van een vacuümpomp. Laat van minder dan 100 mL medium in elke fles maar voorkomen dat vaste algen verwijderen.
    Opmerking: Deze procedure binnen een BSC voeren en volg steriele techniek. Een eenvoudige vacuüm apparaat kan worden geconstrueerd met behulp van een vacuüm kolf of fles. Past een steriele serologische pipet op het einde van de buis.
  3. Schorten en de algen drijfmest overbrengen in steriele 50 mL centrifuge buizen. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min verder concentreren algen.
  4. Verwijder in het BSC, genoeg supernatans dat om een totaal volume van ~ 80 mL van algen concentraten voor 12 photobioreacters. Vermijd stofzuigen uit de pellet. Het concentraat wat over algen overbrengen in een steriele container (of het gebruikte algen voorraad fles).
  5. Voeg 6 mL algen drijfmest in elk photobioreactor met een steriele 10 mL serologische pipet.
  6. Steriele filter (0,2 mm spuit of vacuüm filter) en voeg de juiste bedragen van alle andere stoffen (bijvoorbeeld vitamine voorraden) die niet kunnen gesteriliseerde met autoclaaf worden.
  7. Swirl bioreactoren mixen van algen in het medium.
  8. Een 2 mL monster trekken door elke bioreactor met behulp van een serologische pipet en overdracht aan een tube 2 mL. Verzamelen een 2 mL monster (in een BSC) elke 24 uur om de voortgang van de cultuur. Controleer de steekproef voor het gebruik van pH strips test en pas de reactor, zo nodig met ofwel 3 M NaOH of 3 M HCl.
  9. Draai de bioreactor deksels en plaats alle bioreactoren in het vis tank waterbad. De beluchting, CO2en verlichting naar het passende niveau voor de soorten aanpassen. Draai de bioreactor positie elke dag na bemonstering (stap 3.8).
  10. Breng 200 µL van elk monster cultuur in drievoud wells van een 96 goed microplate. Meten van de optische dichtheid (OD) bij 550 nm en 680 nm.
    1. Op de laatste dag van de periode van de cultuur, meet u OD onder verschillende verdunningsfactoren (bijvoorbeeld een 1 x, 2 x, 4 x, 8 x, 16 x en 32 x) om een correlatie tussen de Franse overzeese departementen en de werkelijke drooggewicht na de oogst (stap 4).
  11. Centrifugeer het monsterbuisje 2 mL bij 12.000 x g gedurende 5 min.
  12. De bovendrijvende vloeistof filteren door 0,2 µm niet-steriele injectiespuit filter en bewaar het supernatant (en pellet indien nodig) op Nee hoger dan-20 ° C voor lange termijn opslag en latere analyses van veranderingen in de samenstelling van de media.

4. oogsten en vriesdrogen van Microalgal biomassa

  1. Meten van een vaste hoeveelheid algen cultuur van elke bioreactor met een gegradueerde cilinder (bijvoorbeeld 160 mL van een bioreactor dat oorspronkelijk ingeperkt 200 mL van medium) en breng in centrifuge flessen. Spoel de gegradueerde cilinder met dH2O tussen elke meting.
  2. Centrifugeer bij 4,696 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant door zorgvuldig stofzuigen het uit.
  3. De pellets overbrengen in gelabelde 50 mL tubes. Spoel de centrifuge flessen met dH2O, en de inhoud van de overdracht aan de 50 mL tubes. Zorg ervoor dat het totale buis-volume niet hoger is dan 45 mL.
  4. Wassen van de algen pellets met dH2O te verwijderen van zouten.
    1. Centrifugeer de 50 mL tubes bij 4,696 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
    2. Voeg 40 mL dH2O toe aan elke buis 50 mL; Vortex te mengen. Centrifugeer nogmaals bij 4,696 x g gedurende 5 min en weggeworpen.
    3. Herhaal nogmaals stap 4.4.2.
  5. Label en weegt leeg 15 mL centrifuge buizen op een 4-decimaal evenwicht (label zowel het deksel en de buis en wegen samen). Weeg één tube per algen cultuur. Weeg elke tube van 15 mL tweemaal om te minimaliseren van de fout.
  6. Na de laatste wash, verwijder het supernatant en 7,5 mL dH2O toevoegen aan elke tube van 50 mL. Vortex en overdracht de algen slurries in de vooraf gewogen 15 mL tubes. Spoel de 50 mL tubes met aanvullende dH2O en transfer van vloeistof naar de 15 mL tubes. Te voorkomen dat meer dan 12 mL voor totale volume in de 15 mL tubes.
  7. Centrifugeer de 15 mL tubes bij 4,696 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie. Het bevriezen van de buizen met pellets bij-80 ° C gedurende ten minste 30 min ter voorbereiding van trekkers.
  8. Freeze droog 's nachts of totdat gedroogd.
  9. Wegen en registreren van de gevriesdroogde 15 mL buisjes met algen.

5. lipide extractie met behulp van een gemodificeerde Folch methode24

  1. Weeg 20 mg gevriesdroogd algenbiomassa in een 2 mL schroefdop polypropyleen buis (selectievakje fabrikant label om ervoor te zorgen dat product is geschikt voor kraal extracties).
  2. Voeg 1,5 mL Folch oplosmiddel (2:1 chloroform/methanol) aan elke 2 mL-buis (die bevat 20 mg gevriesdroogd algen). Giet ~0.5 mL zirconia/kiezelzuur parels (0.5 mm) in elke buis tot vloeistofniveau in buis 2 mL bereikt.
    Let op: Omgaan met chloroform en methanol in een zuurkast en Vermijd inademen van dampen of huidcontact.
  3. Meng de algen monsters in de molen van een kraal voor 20 s met een snelheid van 6,5 m/s. overdracht buizen aan ijs voor 30 s om te relaxen van monsters. Herhaal vijfmaal meer volledig uitpakken lipiden.
  4. Het homogenaat wordt gefiltreerd door een 5 mL-spuit met een roestvrij stalen draad mazen schijf (#60 mesh) stam uit de kralen, verzamelen filtraat op in een tube van 15 mL.
  5. Wassen van de kralen met 1,5 mL Folch oplosmiddel, vloeistof door te duwen met de spuit als dit nodig is. Herhaal deze wassing twee meer tijden en verzamel alle filtraat in de tube van 15 mL, opbrengst een eindvolume van ongeveer 6 mL.
  6. Voeg 1.2 mL 0,9% (m/v) NaCl oplossing aan het Folch extract in de tube van 15 mL en vortex te goed mengen.
    Opmerking: Indien nodig, meer Folch oplosmiddel kan worden gebruikt om te wassen kralen (gebruik 0,2 x het volume van de totale wassen van 0.9% NaCl-oplossing voor het opwekken van fase-separatie zichtbaar).
  7. Centrifugeer de 15 mL tubes bij 6.000 x g gedurende 5 min. Record het onderste chloroform (groen) fase volume tot de dichtstbijzijnde 0,1 mL met behulp van lijnen aan de zijkant van de tube van 15 mL. Overdracht van de fase van de bodem naar een glazen ampul (met het deksel) met behulp van een glazen pipet van Pasteur.
  8. Bewaar de lipide bij-20 ° C of -80 ° C als er plannen bestaan om via dit extract voor analyse van de vetzuren.

6. neutrale lipide Assay met een Microplate-methode (aangepast van Higgins et al. 201422)

  1. Bereiden van stamoplossingen. Bereiden van 10 mL 1 mg/mL plantaardige olie standaard in chloroform en opgeslagen bij-20 ° C.
    Opmerking: Elke plantaardige olie kan worden gebruikt in deze test want het is niet gevoelig voor de soorten vetzuren. 10 mL van 200 µg/mL Nile Red oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) voor te bereiden en op te slaan in het donker bij kamertemperatuur.
  2. Verwarm droge microplate blok tot 55 ° C in een zuurkast. Terwijl dit is Verwarming, Verdun de lipide extracten en plantaardige olie standaard 3 katernen met methanol.
    Opmerking: Deze verdunning kan worden gewijzigd op basis van het vetgehalte van de algen, maar dit niveau werkt goed voor de meeste Chlorella.
  3. Voeg voor elk verdunde monster, 80 µL aan een 96 goed polypropyleen microplate in viervoud.
    Let op: Gebruik van polystyreen plasticware wordt niet aanbevolen voor gebruik met organische oplosmiddelen.
  4. Breng voor de oplosmiddelblanco, 80 µL van 2:1 methanol/chloroform in viervoud. Toevoegen voor normen, 10, 30, 60, 90 en 120 µL van de verdunde plantaardige olie standaard in viervoud.
  5. Plaats de microplate in een dry block kalibrator kachel bij 55 ° C gedurende 20-30 minuten totdat alle oplosmiddel verdampt. Terwijl het oplosmiddel verdampt, bereiden de werking Nile Red oplossing (noodzaak 200 µL van 1 µg/ml oplossing per plaat goed). Als voorbeeld vereist twaalf monsters en een volledige reeks van normen 16 mL 1.0 µg/mL oplossing; bereiden door oplossend 80 µL van de voorraad van 200 µg Mo/mL (in DMSO) in 16 mL dH2O.
  6. Verwijder de microplate uit het blok van de verwarming en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 30 µL van isopropylalcohol aan elk putje en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Controleer alle Pipetteer kanalen zijn de oplossing mengen en resuspending van de lipiden, opbrengst van een homogene groene vloeistof.
  7. Voeg 200 µL van Nijl Red oplossing (1 µg/mL) voor elk goed, Pipetteer omhoog/omlaag 10 keer te mengen. Laat de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Terwijl we wachten, bereid een 50% bleekwater oplossing door het mengen van bleekwater (6% hypochloriet) met dH2O. 20 µL per putje nodig zijn. Voorbereiding van 3 mL 50% bleekwater is voldoende voor 12 monsters en een volledige reeks van normen.
  8. 20 µL van bleekwater oplossing toevoegen aan elke microplate goed en Pipetteer op en neer 5 keer naar meng goed. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Na 30 min, lees fluorescentie in de monsters elke 5-10 min op 530 nm excitatie/575 nm emissie met auto cutoff ingesteld op 570 nm totdat het signaal van algen monsters stabiliseert. 60 min totaal incubatietijd is meestal voldoende.
  10. Maak een ijklijn voor de plantaardige olie-normen (in het bereik van 0-40 ng olie per putje).
    Opmerking: Een lineaire passen geschikt voor lage (< 30 ng/putje) olie concentraties en een veelterm passen mogen worden gebruikt als de standaard groter is dan 30 ng/putje. Gebruik deze correlatie te kwantificeren van de neutrale lipiden in de steekproef putten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze procedure levert een tijdsverloop van algen optische dichtheid gegevens bij OD 550 nm (figuur 4A). De optische dichtheid en het droge gewicht concentratie gegevens kunnen worden gecorreleerd (figuur 4B). Dit wordt bereikt door de eerste berekening van de concentratie van de algen droge eindgewicht na de freeze-drying stap. Vervolgens kan de optische dichtheid van de cultuur seriële verdunning (uitgevoerd op de laatste dag va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De belangrijkste overweging bij het kweken van algen is een goed begrip van de specifieke behoeften van het organisme of groep van organismen. De algen Cultuurstelsel hier beschreven kan worden gebruikt om de cultuur van een breed scala van algen, maar de specifieke abiotische factoren (temperatuur, media, pH, licht intensiteit, CO2 -niveau, beluchting tarief) moeten worden aangepast aan de behoeften van het organisme. Opmerking de hier beschreven parameters werden gebruikt voor de teelt van Chlorella...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Steun voor dit onderzoek werd verzorgd door USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw Hatch Project ALA0HIGGINS en de Auburn University kantoren van de rector, de Vice President voor onderzoek en de Samuel Ginn College of Engineering. Ook werd de steun verleend door NSF verlenen CBET-1438211.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Benodigdheden voor airlift fotobioreactor opstelling
1 L Pyrex flessenCorning16157-191Voor flesreactoren, bevochtigers
1/2" slangklemHome DepotUC953Aof gelijkwaardig
1/4" vrouwelijke luer naar barbNordson biomedicalNordson FTLL360-60051/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveerbare PVC buisThermo-Nalgene63013-24450'
1/4" in O-ringenGrainger1REC5#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Vrouwelijke luer naar barbNordson biomedicalFTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveerbare PVC buisThermo-Nalgene63013-608250'
1/8" mannelijke draaiende luer naar barbNordson biomedicalMLRL013-6005
1/8" multiport barbNordson biomedical4PLL230-60051/8" multiport barb
1/8" NPT naar barbNordson biomedical18230-60051/8" 200 series barb
1/8" paneelmontage luerNordson biomedicalNordson MLRLB230-60051/8", PP
10 gallon vistankWalmart802262Kan tot 8 bioreactoren bevatten, afhankelijk van de lay-out
100-1000 ccm debietmeterDwyerRMA-13-SSVVoor flesreactoren
2 ft fluorescentie lichtbankAgrobriteFLT24 T5
200-2500 ccm debietmeterDwyerRMA-14-SSVVoor luchtregeling stroomopwaarts van bevochtiger
250 mL Pyrex flessenCorning16157-136Voor gasmenging na bevochtiger
50-500 ccm debietmeterDwyerRMA-12-SSVVoor hybridisatiebuisreactoren
5-50 ccm debietmeterDwyerRMA-151-SSVVoor CO2 stromingssnelheidscontrole
Luchtfilters 0.2 µmWhatman/ Fisher09-745-1APolyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
TerugslagkleppenVWR89094-714
Corning deksels voor pyrex flessenVWR89000-23310 GL45 deksels
Vrouwelijke luer dopNordson biomedicalNordson FTLLP-6005Vrouwelijke stabiele PP
HybridisatiebuizenCorning32645-03035x300 mm, pak van 2
LichttimerWalmart556393626
VeiligheidsmoerenNordson biomedicalNordson LNS-31/4", rood nylon
Laag profiel magnetische roerderVWR10153-690Laag profiel magnetische roerder
Mannelijke luer dopNordson biomedicalNordson LP4-6005Mannelijke plug PP
Spinning luer vergrendelingsringNordson biomedicalNordson FSLLR-6005
Roerstaven - langVWR58949-04038.1 mm, voor flesreactoren
Roerstaven - middelVWR58949-03425 mm, voor hybridisatiebuizen
Benodigdheden en reagentia voor het kweken van algen
0.2 µm filtersVWR28145-49113 mm, PTFE, voor het filteren van gebruikt medium uit dagelijkse kweekbemonstering
1 mL spuitenAir-tite89215-216Voor het filteren van gebruikt medium uit dagelijkse kweekbemonstering
1.5 mL buizenVWR87003-294Steriel (of gelijkwaardig)
10 mL Serologische pipettenGreiner Bio-One82050-482Steriel (of gelijkwaardig)
100 mm platenVWR25384-342100x15 mm stapelbare petrischalen, steriele
15 mL buizenGreiner Bio-One82050-276Steriel (of gelijkwaardig), polypropyleen
2 mL Serologische pipetpuntenGreiner Bio-One82051-584Steriel (of gelijkwaardig)
2 mL buizenVWR87003-298Steriel (of gelijkwaardig)
50 mL buizenGreiner Bio-One82050-348Steriel (of gelijkwaardig), polypropyleen
96 well microplaatGreiner Bio-One89089-578Polystyreen met deksel, platte bodem
Inoculatie lussenVWR80094-478Steriel (of gelijkwaardig)
Vloeibare kooldioxide tank en regelaarAirgasCD-50
Benodigdheden en reagentia voor lipide extractie en neutrale lipide assay
2 mL bead buizenVWR10158-556Polypropyleen buis met deksel
96 well microplatesGreiner Bio-One82050-774Polypropyleen, platte bodem
BleekwaterWalmart550646751Gebruik alleen gewoon bleekwater, geen schoonmaakbleekwater
ChloroformBDHBDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxideBDHBDH1115-1LP
Isopropyl alcoholBDHBDH11

Referenties

  1. Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
  2. Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
  3. Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
  4. Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
  5. Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
  6. Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
  7. Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
  8. Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
  9. Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
  10. Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
  11. Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
  12. Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
  13. Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
  14. Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256(2017).
  15. Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
  16. Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
  17. Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
  18. Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
  19. Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
  20. Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
  21. Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807(2014).
  22. Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
  23. Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
  26. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
  27. de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
  28. Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bellenkolom fotobioreactormicroalgenkweekassay voor neutrale lipidenFolch methodemeting van de optische dichtheidvriesdrogen van biomassacentrifugatie oogstNile Red fluorescentiemonitoring van algengroeiChlorella soorten
Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.