Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Samenvatting

Acute graft-versus-host ziekte (GVHD) is een significante beperking voor patiënten die hematopoietische stamceltransplantatie ondergaan als therapie voor Hematologische tekortkomingen en maligniteiten. Acute GVHD treedt op wanneer donor cellen gastheer weefsels als een vreemd antigeen herkennen en een immuunrespons op de host monteren. Huidige behandelingen omvatten toxische immunosuppressieve geneesmiddelen die patiënten vatbaar voor infectie en herhaling. Zo, er is lopend onderzoek naar een acute GVHD therapie die effectief kan richten op donor T cellen en het verminderen van bijwerkingen. Veel van dit pre-klinische werk maakt gebruik van de xenogene GVHD (xenoGVHD) Murine model dat het mogelijk maakt voor het testen van immunosuppressieve therapieën op menselijke cellen in plaats van murene cellen in een in vivo systeem. Dit protocol schetst hoe xenoGVHD te induceren en hoe te blind en standaardiseren klinische scoring om consistente resultaten te garanderen. Daarnaast wordt in dit protocol beschreven hoe u digitale PCR gebruikt om menselijke T-cellen in muizen weefsels te detecteren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van geteste therapieën te kwantificeren. Het xenoGVHD-model biedt niet alleen een model om GVHD-therapieën te testen, maar elke therapie die menselijke T-cellen kan onderdrukken, die vervolgens kan worden toegepast op veel ontstekingsziekten.

Inleiding

Allogene hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) is een routine behandeling geworden voor patiënten die lijden aan hematologische maligniteiten zoals leukemie met een slechte prognose. Een significante complicatie van HSCT is acute graft-versus-hostziekte (GVHD). In een 2012-studie werd gemeld dat acute GVHD werd ontwikkeld in 39% van de HSCT-patiënten die transplantaties kregen van broer of zus en 59% van de patiënten die transplantaties ontvingen van niet-verbonden donoren¹. Acute GVHD treedt op wanneer de donor afkomstige T-cellen de organen van de geadresseerde aanvallen. De enige succesvolle therapie voor GVHD is behandeling met zeer ....

Protocol

Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming, en met goedkeuring van, de Universiteit van Kansas Medical Center institutionele dierenverzorging en gebruik Comité. Alle gezonde menselijke bloedmonsters werden verkregen onder geïnformeerde toestemming en met goedkeuring van de institutionele Review Board aan de Universiteit van Kansas Medical Center.

1. bestraling van NSG-muizen

1. Een dag voorafgaand aan PBMC injectie, bestralen 8 – 12 weken oude NSG muizen (beide geslacht kunnen worden gebruikt). Plaats in een steriele bioveiligheidskast muizen in een gesteriliseerde cirkel kooi of micro-isolator. Bestraleren van muize....

Resultaten

Sublethally bestraalde 8-12-week oude NSG-muizen van beide geslachten die menselijke PBMC ontvingen begonnen met het weergeven van klinische symptomen van GVHD rond dag 10 na injectie in vergelijking met negatieve controle muizen die alleen PBS ontvingen (Figuur 1a). XenoGVHD muizen hadden een mediane overleving van 23,5 dagen (Figuur 1b). Met digitale PCR kunnen CD3 Epsilon positieve menselijke T-cellen worden gedetecteerd in de.......

Discussie

Ziekteprogressie is over het algemeen consistent in het xenoGVHD-model, zelfs met een injectie van PBMC van verschillende donoren, zodat meerdere experimenten kunnen worden gecombineerd. De belangrijkste stappen die nodig zijn om deze consistentie te behouden, zijn goede i.v.-injectietechniek, blindering en consistente scoring. Een studie van Nervi et al.²⁵ toonde aan dat in vergelijking met intraveneuze staart ader injectie, retro-orbitale injecties van PBMC resulteerden in een consistentere engr.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL eppendorf tubes	Fisher	05-408-129
10 mL serological pipet	VWR International	89130-898
10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin pipette tips	Rainin	17001118	Gebruik geen andere pipetten of pipettips voor druppelgeneratie
50 mL conical tube	VWR International	89039-656
96-Well ddPCR plate	Bio-Rad	12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Optioneel
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	6818
Anesthesia Chamber	World Precision Instruments	EZ-178	Verstrekt door dierenfaciliteit
Anesthesia Machine	Parkland Scientific	PM1002	Verstrekt door dierenfaciliteit
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set	Becton Dickinson	367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O	Life Technologies	1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
Insulin Syringe	Fisher Scientific	329424
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	Verstrekt door dierenfaciliteit
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mouse Irradiator Pie Cage	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	Ruimte voor maximaal 11 muizen
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 pipetman	MidSci	A-1000
P200 pipetman	MidSci	A-200
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805	Gebruik geen andere pipetten of pipettips voor druppelgeneratie
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506
qPCR plates	VWR International	89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	12001925	Inclusief druppelgenerator, druppellezer, laptopcomputer, software, bijbehorende verbruiksartikelen, voor EvaGreen of sonde-gebaseerde digitale PCR-toepassingen
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad	1864033
RNase and DNase-free plate seal	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640	Life Technologies	12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)	Fisher Scientific	67522
Sterile Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	21040CV
Sterile reservoir	VWR International	89094-662
Surgical Scissors	Kent Scientific	INS600393-4
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650914-4