Methodenartikel

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

DOI:

10.3791/59113

⸱

10 mei 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om eiwit niveaus te detecteren en te kwantificeren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese door immunokleuring met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Daarnaast beschrijven we een methode voor het bereiden en cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels van jonge muizen voor immunokleuring.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefsel immunokleuring biedt zeer specifieke en betrouwbare detectie van eiwitten van belang binnen een bepaald weefsel. Hier beschrijven we een volledig en eenvoudig protocol om eiwit expressie te detecteren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Het protocol bestaat uit het voorbereiden en cryosnijden van weefsels, indirecte immunofluorescentie, beeld verwerving en kwantificering. Daarnaast wordt een methode beschreven voor de bereiding en het cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels voor immunokleuring, waarbij gebruik wordt gemaakt van craniofaciale weefsels en lange botten als voorbeeld. Deze methoden zijn essentieel om de eiwit expressie en morfologische/anatomische veranderingen in verschillende weefsels te bepalen tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese. Ze zijn ook toepasbaar op andere weefsels met passende modificaties. Kennis van de histologie en hoge kwaliteit van secties zijn van cruciaal belang om wetenschappelijke conclusies uit experimentele uitkomsten te trekken. Mogelijke beperkingen van deze methodologie omvatten maar zijn niet beperkt tot specificiteit van antilichamen en kwantificerings problemen, die hier ook worden besproken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gezicht is een belangrijk onderdeel van de menselijke identiteit, en bestaat uit verschillende soorten weefsels, zoals epitheel, spier, bot, kraakbeen, tand. Deze weefsels zijn afgeleid van alle drie de kiem lagen: Ectoderm, endoderm en mesoderm1,2. Voor een goede patronen en ontwikkeling van craniofaciale weefsels moeten celproliferatie, overlijden en differentiatie sterk worden gecoördineerd en gereguleerd door specifieke signalerings trajecten, zoals WNT-, FGF-, hh-en BMP-trajecten3,4 ,5. Defecten in proliferatie, overleving of differentiatie van cellen zullen leiden tot craniofaciale misvormingen, die behoren tot de vaakst voorkomende aangeboren geboorteafwijkingen. Transgene muizen zijn nuttige hulpmiddelen om mechanismen te bestuderen van craniofaciale morfogenese en pathogenese1,2,3,4,5. Het begrijpen van de veranderingen in craniofaciale structuren tijdens de ontwikkeling en pathogenese zal helpen om de belangrijkste ontwikkelingsprincipes te verduidelijken, evenals de mechanismen van craniofaciale misvormingen1,2,3 ,4,5.

De kleuring van hele Mount of gesectioneerde weefsels met specifieke antilichamen is een onschatbare techniek voor het bepalen van de ruimtelijke verdeling van eiwitten van belang 6. Formeel kan weefsel immunokleuring afhangen van immunohistochemie (IHC) of immunofluorescentie (IF). Vergeleken met het ondoorzichtige reactieproduct dat wordt gegenereerd met een chromogene substraat zoals 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB) door IHC, indien het gaat om het gebruik van fluorescerende conjugaten die zichtbaar zijn door fluorescentiemicroscopie. Daarom, als kan duidelijk onderscheid maken tussen positieve cellen van achtergrondruis, en laat afbeeldingen kwantitatief worden geanalyseerd en verbeterd op een eenvoudige manier door software zoals imagej en Adobe Photoshop7,8. De hele Mount kleuring aanpak werkt op kleine blokken weefsel (minder dan 5 mm dik), die driedimensionale informatie over de locatie van eiwitten/antigenen kan bieden zonder de noodzaak voor reconstructie uit de rubrieken9,10 . Echter, in vergelijking met weefsel secties, hele Mount immunokleuring is tijdrovend en vereist grote hoeveelheden antilichaam oplossingen. Niet alle antilichamen zijn compatibel met de basisbenadering voor hele montage. Bovendien zal de onvolledige penetratie van antilichamen resulteren in ongelijke kleuring of valse negatieve kleuring. Hier zullen we ons concentreren op de immunofluorescentie detectie van eiwitten/antigenen op verdeelde weefsels. Voor harde weefsels (bv, hoofd, tand, lang bot), calcium depositie tijdens ontwikkeling/pathogenese maakt het monster moeilijk om sectie en gemakkelijk afgespoeld tijdens immunokleurings behandeling11,12. De meeste van de momenteel beschikbare protocollen decalcify harde weefsels vóór inbedding te maken snijden gemakkelijker, dat is tijdrovend en kan de morfologie en antigenen van monsters vernietigen als onjuist behandeld11,12. Om de problemen te overwinnen, hebben we een aanpak geoptimaliseerd voor het cryosnijden van harde weefsels zonder decalcificatie, wat leidt tot een verbeterde visualisatie van hun morfologie en verdeling van signalering van eiwitten.

Het hier beschreven protocol wordt gebruikt om de Morfometrische en histologische veranderingen in de craniofaciale weefsels van BMP-transgene muizen te bepalen. In het bijzonder omvat het Protocol (1) het oogsten en ontleden van het hoofd weefsel, (2) sectie en immunokleuring van experimentele markers (Ki67, pSmad1/5/9) samen met TUNEL kleuring, (3) beeldvorming van de secties met behulp van fluorescentiemicroscoop, en ten slotte (4) analyseren en kwantificeren van de resultaten. Het protocol voor de voorbereiding en cryosectie harde weefsels zonder decalcificatie wordt ook beschreven13. Deze methoden zijn geoptimaliseerd voor craniofaciale weefsels. Ze zijn ook toepasbaar op andere weefsels van verschillende leeftijden van monsters met passende aanpassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Michigan met betrekking tot de humane verzorging en het gebruik van dieren in onderzoek. Alle dier procedures die in deze studie worden gebruikt, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Michigan (protocol #PRO00007715).

1. weefsel preparaat

  1. Bereiding van embryonale weefsels
    1. Bereid 1 10 cm schaal en verschillende 3,5 cm gerechten met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1 12-goed kweek plaat met 2 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS in elke put voor elke zwangere muis. Plaats alle Petri schalen en de plaat op ijs.
      Opmerking: Behandel 4% PFA in een rook afzuigkap.
    2. Dissect embryo's van zwangere muizen in ijskoude PBS met een tang en een schaar zoals eerder beschreven14.
      1. Kort, euthanas een zwangere muis met CO2, pak de huid onder het midden van de buik met een tang en snijd door de huid alleen, dan zachtjes trekken op de huid om het te scheiden van de onderliggende buikspier wand.
      2. Vervolgens, snijd in de buikholte na dezelfde lijn van de huid incisie. Verwijder de baarmoeder met een reeks embryo's en verwijder de embryo's door de baarmoederwand voorzichtig weg te snijden. De extraembryonale weefsels zoals de dooier SAC en amnion zullen worden verwijderd.
      3. Snijd en Isoleer het hoofd van elk embryo.
    3. Breng elke kop in elke put van een 12-well plaat met 4% PFA met een plastic Transfer pipet of een tang. Repareer monsters in 4% PFA bij 4 °C gedurende 4 uur. Spoel de monsters in PBS bij 4 °C met voorzichtig schudden gedurende 12 uur.
      Opmerking: Voor embryo's jonger dan embryonale dag 16,5 (E 16.5), Fixeer je embryo hoofden met 4% PFA direct na afzondering. Voor embryo's bij E 16.5 of later, verwijder de huid en vetweefsel van de kop en spoel meerdere malen in ijskoude PBS voordat fixatie.
    4. Cryoprotect hoofden.
      1. Breng elke kop over in een nieuwe 12-put met 2 mL 30% sucrose in PBS met behulp van een plastic pipet of een tang. Schud zachtjes op 4 °C totdat het hoofd naar de bodem van de schaal zakt.
    5. Embed hoofden.
      1. Breng de cryoprotected kop in een mal met optimale Snijtemperatuur (OCT) compound. Voorbeelden in oktober gedurende enkele minuten. Pas de locatie en de richting van de monsters met de Tang aan.
      2. Plaats de mal op droogijs om te bevriezen. Bewaar de resulterende cryomolds in een plastic zak bij-80 °C tot u klaar bent voor cryosnijden.
        Opmerking: De bijgesneden zijde van de monsters moet de bodem van de insluitings mal zien.
  2. Bereiding van postnatale onverdecalcificeerde harde weefsels
    1. Euthanize bij 3-weekse of 3-maand oude muis met CO2. Verwijder de huid en vetweefsel. Knip en Isoleer het hoofd of de lange botten van de muis.
    2. Fix en cryoprotect het hoofd of lange bot van muizen zoals beschreven in stappen 1.1.3 – 1.1.4.
    3. Insluiten in 8% gelatine op een vergelijkbare manier als stap 1.1.5. Houd de cryomolds in een plastic zak bij-80 °C tot cryosectioning.
      Opmerking: Decalcificatie is hier niet nodig. Om 8% gelatine te bereiden, meng 8 g gelatine met 100 mL PBS en kook met behulp van een magnetron. Houd er rekening mee dat het mengsel gemakkelijk kookt.

2. cryosnijden

  1. Stel cryostaat temperatuur in op-18 °C voor zachte weefsels ingebed in OCT of-25 °C en lager voor niet-ontharcificeerde harde weefsels ingebed in gelatine. Houd de monsters in de cryostaat kamer gedurende ongeveer 30 minuten om naar de temperatuur van de cryostaat te gaan.
  2. Verdrijven van het blok van de cryomold. Vries het blok op de preparaat boorkop (tissue houder) via montage met een LGO druppel. Houd de bijgesneden zijde van het monster het verst van de klauwplaat (tegenover de operator).
  3. Laad de op het blok gemonteerde Chuck op de cryostaat-objecthouder. Pas de meshouder aan om de hoek van het blad 3 ° – 5 ° ten opzichte van het monster te maken.
  4. Verzamel 10 μm secties op gecoate Microscoop dia's. Droge delen volledig op RT, dan bewaren ze bij-80 °C.

3. histologische kleuring en microscopische beeldvorming

  1. Immunofluorescentie kleuring
    1. Neem dia's van-80 °C. Houd dia's bij RT voor 1 uur naar lucht-secties. Spoel de glijbanen in 0,1% PBST (0,1% polyethyleenglycol tert-octylfenyl ether in PBS; Zie tabel met materialen) driemaal gedurende 5 min elk om de LGO en permeabilize secties te wassen.
    2. Optioneel, uitvoeren antigeen ophalen (optioneel).
      1. Voorverwarm citraat buffer (10 mM Natriumcitraat pH 6) in de kleurings schaal met stoom-of waterbad tot 95 – 100 °C. Dompel de glijbanen in de citraat buffer, inbroed gedurende 10 min.
      2. Neem de kleurings schaal van Steamer of waterbad naar RT. koel de glaasjes bij RT gedurende 20 minuten of langer15.
        Opmerking: Als alternatieven, gebruik tris-EDTA-buffer (10 mM tris-basis, 1mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) of EDTA-buffer (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) voor het ophalen van warmte-geïnduceerde antigeen. Gebruik een snelkookpan, magnetron of waterbad voor het ophalen van warmte-geïnduceerde antigeen, naast de hete Steamer. Een enzym-geïnduceerde antigeen opvraging met trypsine of pepsine is een ander alternatief. Optimaliseer de concentratie en behandelingstijd van enzymatische opvraging om beschadiging van secties te voorkomen. Optimaliseer de antigeen-Ophaalmethode voor elke antilichaam/antigeen-combinatie.
    3. Inbroed elke dia met 200 μL blokkerende oplossing (5% Donkey serum verdund in 0,1% PBST) bij RT gedurende 30 minuten, en verwijder vervolgens de blokkerende oplossing zonder te spoelen.
    4. Inbroed elke glijbaan met 100 μL primair antilichaam of antilichamen verdund in blokkerende oplossing voor 1 uur bij RT of O/N bij 4 °C. Spoel dia's met PBS driemaal gedurende 10 minuten per RT.
    5. Inbroed elke glijbaan met 100 μL secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing voor 1 uur bij RT. Spoel dia's in PBS driemaal gedurende 10 minuten per RT. Bescherm dia's tegen licht.
    6. Koppel dia's.
      1. Voeg twee druppels anti-fade medium toe met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) op de glijbaan. Dan bedekken met een dekslip.
      2. Bewaren bij 4 °C in het donker tot het beeld klaar is.
        Opmerking: Als alternatief, label de kernen met DAPI of Hoechst 33324 kleurstof verdund 1:2000 in PBS op RT eerste, dan mount met glycerol.
  2. Terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick end labeling (TUNEL) kleuring.
    Opmerking: Dubbel-streng DNA met 3 '-hydroxyl Termini (3 ' OH DNA Termini) zal vormen tijdens apoptosis in de cel. Hier bieden we een protocol dat het gratis 3 ' OH DNA Termini in situ etiketteer via het labelen van DNA fragmenten met de digoxigenin-nucleotide met behulp van terminale deoxynucleotidyl Transferase (TdT) door specifieke kleuring met een commerciële Kit (Zie tabel van materialen ).
    1. Optioneel, vlekken secties met primaire en Alexa Fluor-488 gelabelde secundaire antilichamen voorafgaand aan de TUNEL kleuring. Spoel de dia's in PBS driemaal gedurende 10 minuten per stuk.
      Opmerking: Deze stap is optioneel voor een dubbele kleuring van een eiwit en TUNEL in dezelfde dia.
    2. Inbroed elke dia met 100 μL Proteïnurie K (10 μg/mL in 10 mM tris pH 7,5 en 5 mM EDTA) gedurende 5 min bij RT. Spoel de dia's met PBS driemaal gedurende 10 minuten per RT.
      Opmerking: Pas de incubatietijd en-temperatuur van proteinase K aan voor elk weefseltype. Voor 10 μm delen van de embryo hoofden, vastgesteld op 4% PFA, inbroed gedurende 5 minuten bij RT. In aanvulling op de methode met behulp van proteinase K, gebruik van alternatieve behandelingen indien nodig, met inbegrip van (1) vers bereide 0,1% polyethyleenglycol tert-octylfenyl ether, 0,1% Natriumcitraat, 10 min bij 37 °C; (2) 0,25% – 0,5% pepsine in HCl (pH 2) of 0,25% trypsine, 10 min bij 37 °C; en (3) bestraling van de magnetron met 0,1 M citraat buffer (pH 6).
    3. Breng 200 μL blokkerende oplossing (5% Donkey serum verdund in 0,1% PBST) aan op elke dia, inbroed bij RT gedurende 30 minuten, tik op de blokkerende oplossing zonder te spoelen.
    4. Breng 50 μL van de equilibratie buffer van de kit aan op elke dia bij RT gedurende ten minste 10 sec. Druk de buffer uit zonder te spoelen.
    5. Bereid reactiemengsel (werk sterkte TdT-enzym) door het mengen van TdT-enzym met de reactiebuffer geleverd door de kit bij de verhouding van 3:7. Breng 50 μL van het reactiemengsel aan op elke dia en inbroed bij 37 °C gedurende 1 uur. Druk de buffer uit zonder te spoelen.
    6. Breng 200 μL van de stop buffer (1:30 verdund in ddH2O) die door de kit aan elke dia wordt geleverd, vervolgens INBROED bij RT gedurende 10 min. Spoel DIA'S met PBS drie keer gedurende 10 minuten per stuk.
    7. Etiket met Rhodamine antilichamen.
      1. Breng 50 μL pre-warmed (RT) anti-digoxigenine geconjugeerde (Rhodamine) (1:1 verdund in blokkerende oplossing) aan op elke dia. Inincuberen bij RT gedurende 30 minuten in het donker.
      2. Spoel dia's met PBS driemaal gedurende 10 minuten per stuk. Koppel dia's als stap 3.1.6.

4. Imaging acquisitie

  1. Gebruik positieve controles (weefsels positief voor het doel antigeen) om de signaal etikettering en negatieve controles te controleren (laat het primaire antilichaam, Isotype-controle of weefsel negatief voor het doel antigen weg) om de achtergrond van beelden onder de fluorescerende Microscoop.
  2. Stel de apparatuur en camera condities (belichtingen en andere algemene instellingen) in voorbeeld vorming op basis van de signaalintensiteit van negatieve en positieve controles.
    Opmerking: Deze voorwaarden variëren met (1) camera's en microscopen die worden gebruikt voorbeeld vorming, (2) antilichamen, en (3) weefsels voor elk experiment. Gemeenschappelijke omstandigheden die worden gebruikt voor craniofaciale weefsels zijn ISO 200 met een blootstellingstijd variërend van 1/100 s tot 1 s afhankelijk van de kwaliteit en specificiteit van antilichamen. Passende vergroingen variëren afhankelijk van de grootte van de monsters en het doel van de experimenten.
  3. Verkrijg afbeeldingen met conventionele epifluorescentie Microscoop of confocale Microscoop. Verzamel afbeeldingen (inclusief die van de bijbehorende besturingselementen) in dezelfde omstandigheden voor elk kleurkanaal. Sla afbeeldingen op met dezelfde indeling (TIFF is het beste om informatie te bewaren).

5. fluorescentie kwantificering

Opmerking: Het statistisch vergelijken van de kleuring tussen verschillende groepen zal in veel gevallen meer informatief zijn. Kwantificeer met de immunofluorescentie beelden het relatieve niveau van het eiwit door de signaal dichtheid te meten, positieve cellen te tellen of positieve gebieden te berekenen. Voor statistische analyse is het minimum aantal biologisch onafhankelijke monsters 3. Een typische methode is om ten minste drie secties van elk monster te genereren en afbeeldingen te maken voor ten minste drie representatieve gebieden in elke sectie.

  1. Kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie met ImageJ
    1. Open de software en gebruik analyse ≫ Stel metingen in om te controleren of alleen het gebied en de geïntegreerde dichtheid zijn geselecteerd. Gebruik bestands > geopend om te analyseren afbeeldingen te openen.
    2. Gebruik de werkbalk om het vierkant-of cirkelpictogram uiterst links te selecteren. Selecteer met het gereedschap selecteren het gebied dat u op de afbeelding wilt analyseren. Gebruik analyse > meting om de uitlezen van het geselecteerde gebied en de geïntegreerde dichtheid in het resultatenvenster te verkrijgen. Selecteer een regio naast een positieve cel die geen fluorescentie heeft om de achtergrond te lezen.
    3. Herhaal stap 5.1.2 om andere afbeeldingen te analyseren. Aanpassing van het gebied dat moet worden geanalyseerd om overeen te laten gaan met dat van de eerste afbeelding.
    4. Kopieer alle gegevens in het resultatenvenster en plak deze in een spreadsheet wanneer u klaar bent met analyseren.
    5. Bereken de gecorrigeerde intensiteit van de fluorescentie (CTCF) als geïntegreerde dichtheid — (oppervlakte van de geselecteerde cel x gemiddelde fluorescentie van achtergrond aflezingen). Vergelijk het verschil tussen de gecorrigeerde totale celfluorescentie tussen de monsters en maak een grafiek.
  2. Kwantificering van het aantal positieve cellen van fluorescerende afbeeldingen met ImageJ
    1. Handmatige celtelling.
      1. Gebruik imagej > plug-ins > analyse om de invoegtoepassing voor de celteller te installeren.
      2. Gebruik bestands > geopend om te analyseren afbeeldingen te openen. Gebruik Plugins > analyse > teller om het venster teller en het resultatenvenster te openen.
        Opmerking: De teller van de cel werkt niet op stapels. Voor het tellen van stapels, plugin plot z axis profile, gebruik dan Image ≫ stacks > plot z axis profile om de intensiteit van een bewegende ROI te bewaken met behulp van een deeltje tracking tool. Deze tool kan handmatig of automatisch zijn.
      3. Klikken op een van de knoppen onder in het itemvenster om het tellen te initiëren. Klik direct op een cel/object om te tellen tot de afwerking.
      4. Klik op de knop resultaten in het venster aantal . Het totale aantal cellen dat wordt geteld, wordt weergegeven in het resultaten venster. Sla het resultaatlog op als spreadsheet en analyseer.
    2. Geautomatiseerde celtelling.
      1. Gebruik bestands > geopend om te analyseren afbeeldingen te openen. Converteer de RGB-afbeelding naar een afbeelding in grijstinten voordat u verdergaat.
      2. Gebruik afbeelding > pas > drempel aan om alle gebieden te selecteren die moeten worden geteld.
      3. Gebruik analyseren ≫ deeltjes analyseren om het aantal cellen/deeltjes te krijgen. Stel een bereik in van de geldige deeltjesgrootte (bijvoorbeeld 100-oneindig) in plaats van de standaardwaarde 0-oneindig om cellen/deeltjes binnen een bepaald bereik te tellen. Sla het resultaatlog op als spreadsheet en analyseer.
        Opmerking:         om andere informatie van de afbeelding te krijgen, gaat u naast gebied naar analyseren > metingen instellen en selecteert u het vakje naast de benodigde informatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embryonale craniofaciale weefsel secties
Naar aanleiding van de bovenstaande stappen, hoofden werden ontleed van de controle (P0-CRE) of Mutant (constitutief geactiveerd Bmpr1a in neurale Crest cellen, P0-CRE; caBmpr1a) embryo's op embryonale dag (E) 16,5 of 18,5. Na de fixatie in 4% PFA voor 4 h, werden monsters ingesloten in de in oktober en cryogesectioneerde coronally. De resulteerden waren immunogekleurd met antilichamen tegen pSmad1/5/9 (downstr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van de muis hoofd en undecalcified bot weefsels, en cryosnijden voor immunokleuring van celproliferatie, celdood, en BMP-signalering markers. We geven ook een gedetailleerd beeld van de strategie voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens van immunofluorescentie beelden. Deze methoden kunnen ook van toepassing zijn op andere weefsels met passende aanpassingen.

De voorwaarden voor weefsel bereiding variëren afhankelijk van de groot...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01DE020843 to Y.M.), de International FOP Association (Y.M.), en een subsidie-in-Aid van de National Natural Science Foundation of China (31500788 tot J.Y.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adhesive tapeLeica#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secundair antilichaamInvitrogenA-11034
Antifade Mountant met DAPIInvitrogenP36931
Rundserum albumineSigmaA2153
DekglasjesFisher Brand12-545-E
CryostatLeicaCM1850
EDTASigmaE6758
FluorescentiemicroscoopOlympusBX51
GelatineSigmaG1890
In Situ Cell Death Detection KitMilliporeS7165
MicroscoopglaasjesFisher Brand12-550-15
OCT CompoundFisher Healthcare23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148 
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)SigmaP4417
Polyethyleenglycol tert-octylfenyletherSigmaT9284Triton X-100
Proteinase KInvitrogenAM2542
Konijn anti-Ki67 antilichaamCell Signaling Technology9129Lot#:3; RRID:AB_2687446
Konijn anti-pSmad1/5/9 antilichaamCell Signaling Technology13820Lot#:3; RRID:AB_2493181
NatriumcitraatSigma1613859
SucroseSigmaS9378
TrisSigma10708976001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
  3. Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
  4. Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
  5. Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
  6. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
  7. Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
  8. Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
  9. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561(2016).
  10. Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
  11. Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
  12. González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
  13. Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
  14. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803(2014).
  15. Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
  16. Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
  17. Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
  18. Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
  19. Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tissue PreparationImmunostainingMouse CraniofacialUndecalcified BoneCryosectioningImmunofluorescenceProtein DetectionGelatin EmbeddingAntibody StainingFluorescence Quantification

Gerelateerde artikelen