Method Article

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

DOI:

10.3791/59113

⸱

May 10th, 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om eiwit niveaus te detecteren en te kwantificeren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese door immunokleuring met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Daarnaast beschrijven we een methode voor het bereiden en cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels van jonge muizen voor immunokleuring.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefsel immunokleuring biedt zeer specifieke en betrouwbare detectie van eiwitten van belang binnen een bepaald weefsel. Hier beschrijven we een volledig en eenvoudig protocol om eiwit expressie te detecteren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Het protocol bestaat uit het voorbereiden en cryosnijden van weefsels, indirecte immunofluorescentie, beeld verwerving en kwantificering. Daarnaast wordt een methode beschreven voor de bereiding en het cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels voor immunokleuring, waarbij gebruik wordt gemaakt van craniofaciale weefsels en lange botten als voorbeeld. Deze methoden zijn essentieel om de eiwit expressie en morfologische/anatomische veranderingen in verschillende weefsels te bepalen tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese. Ze zijn ook toepasbaar op andere weefsels met passende modificaties. Kennis van de histologie en hoge kwaliteit van secties zijn van cruciaal belang om wetenschappelijke conclusies uit experimentele uitkomsten te trekken. Mogelijke beperkingen van deze methodologie omvatten maar zijn niet beperkt tot specificiteit van antilichamen en kwantificerings problemen, die hier ook worden besproken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gezicht is een belangrijk onderdeel van de menselijke identiteit, en bestaat uit verschillende soorten weefsels, zoals epitheel, spier, bot, kraakbeen, tand. Deze weefsels zijn afgeleid van alle drie de kiem lagen: Ectoderm, endoderm en mesoderm1,2. Voor een goede patronen en ontwikkeling van craniofaciale weefsels moeten celproliferatie, overlijden en differentiatie sterk worden gecoördineerd en gereguleerd door specifieke signalerings trajecten, zoals WNT-, FGF-, hh-en BMP-trajecten3,4 ,5. Defecten in prolifera....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Michigan met betrekking tot de humane verzorging en het gebruik van dieren in onderzoek. Alle dier procedures die in deze studie worden gebruikt, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Michigan (protocol #PRO00007715).

1. weefsel preparaat

  1. Bereiding van embryonale weefsels
    1. Bereid 1 10 cm schaal en verschillende 3,5 cm gerechten met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1 12-goed kweek plaat met 2 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS in e....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embryonale craniofaciale weefsel secties
Naar aanleiding van de bovenstaande stappen, hoofden werden ontleed van de controle (P0-CRE) of Mutant (constitutief geactiveerd Bmpr1a in neurale Crest cellen, P0-CRE; caBmpr1a) embryo's op embryonale dag (E) 16,5 of 18,5. Na de fixatie in 4% PFA voor 4 h, werden monsters ingesloten in de in oktober en cryogesectioneerde coronally. De resulteerden waren immunogekleurd met antilichamen tegen pSmad1/5/9 (downstr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van de muis hoofd en undecalcified bot weefsels, en cryosnijden voor immunokleuring van celproliferatie, celdood, en BMP-signalering markers. We geven ook een gedetailleerd beeld van de strategie voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens van immunofluorescentie beelden. Deze methoden kunnen ook van toepassing zijn op andere weefsels met passende aanpassingen.

De voorwaarden voor weefsel bereiding variëren afhankelijk van de groot.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01DE020843 to Y.M.), de International FOP Association (Y.M.), en een subsidie-in-Aid van de National Natural Science Foundation of China (31500788 tot J.Y.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive tapeLeica#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibodyInvitrogenA-11034
Antifade Mountant with DAPIInvitrogenP36931
Bovine serum albuminSigmaA2153
CoverslipsFisher Brand12-545-E
CryostatLeicaCM1850
EDTASigmaE6758
Fluorescence microscopeOlympusBX51
GelatinSigmaG1890
In Situ Cell Death Detection KitMilliporeS7165
Microscope slidesFisher Brand12-550-15
OCT CompoundFisher Healthcare23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148 
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl etherSigmaT9284Triton X-100
Proteinase KInvitrogenAM2542
Rabbit anti-Ki67 antibodyCell Signaling Technology9129Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibodyCell Signaling Technology13820Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrateSigma1613859
SucroseSigmaS9378
TrisSigma10708976001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue PreparationImmunostainingMouse CraniofacialUndecalcified BoneCryosectioningImmunofluorescenceProtein DetectionGelatin EmbeddingAntibody StainingFluorescence Quantification

Related Articles