Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59114

⸱

2 maart 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati

In dit artikel

Samenvatting

Visualisatie van de expressie van genen in embryonale Astyanax cavefish kunnen dit protocol. Deze aanpak is ontwikkeld met als doel het maximaliseren van gen expressie signaal, terwijl het minimaliseren van aspecifieke achtergrondkleuring.

Samenvatting

In de afgelopen jaren heeft het genoom van een ontwerp voor de blinde Mexicaanse cavefish (Astyanax mexicanus) vrijgegeven, onthullen de identiteit van de reeks voor duizenden genen. Voorafgaande onderzoek naar deze opkomende modelsysteem gekapitaliseerd op uitgebreide genoom-brede onderzoeken, die talrijke kwantitatieve trait loci (QTL) die is gekoppeld aan verschillende grot-geassocieerde fenotypen hebben geïdentificeerd. De mogelijkheid om de erfelijke basis voor verandering van de fenotypische verbinden met de genen van belang blijft echter een aanzienlijke uitdaging. Een techniek die dieper begrip van de rol van ontwikkeling in de evolutie van de troglomorphic vergemakkelijken kan is geheel-mount kruising in situ. Deze techniek kan worden toegepast om rechtstreeks vergelijken van genexpressie tussen grot - en oppervlakte-woning vormen, kandidaat benoemen genen onderliggende gevestigde QTL, identificeren van genen van belang van volgende-generatie sequencing studies of ontwikkelen van andere ontdekking-gebaseerde benaderingen. In dit verslag stellen we een eenvoudig protocol, ondersteund door een flexibele controlelijst, die wijd aangepast voor gebruik goed buiten het gepresenteerde studie-systeem worden kan. Gehoopt wordt dat dit protocol als een grote bron voor de Astyanax -Gemeenschap en daarbuiten dienen kan.

Inleiding

Kruising in situ is een gemeenschappelijke methode voor de kleuring van vaste weefsels om te visualiseren van gen expressie patronen1. Deze techniek heeft jarenlang in andere traditionele2 - en niet-traditionele3 modelsystemen, voor een verscheidenheid van biologische studies verricht. Er zijn echter verschillende stappen en reagentia moet deze procedure uitvoeren. Voor onderzoekers die deze techniek nog nooit hebt uitgevoerd, kan starten van het proces worden intimiderende als gevolg van de vele stappen. Verder, het langdurige karakter van deze procedure leent zich voor technische fouten, die kunnen lastig zijn om op te lossen.

Het algemene doel van dit artikel is om een eenvoudige en ongecompliceerde methode die zal deze kruising techniek voor een breed publiek toegankelijk te maken. Verklein de invoering van fouten en presenteren we een eenvoudige benadering die levert hoge kwaliteit gen expressie kleuring en minimaliseert aspecifieke achtergrond signaal. Deze procedure is vergelijkbaar met andere benaderingen ontwikkeld in traditionele modelsystemen, zoals Danio rerio4. Hier, streven wij naar het vergemakkelijken van zorgvuldige uitvoering van elke stap met behulp van een downloadbare checklist (aanvullende bestand 1), zorgvuldige uitvoering van het protocol te bevorderen. De reden hiervoor is het vergemakkelijken van de organisatie door middel van de vele stappen die betrokken zijn bij deze procedure. Dit artikel is geschikt voor onderzoekers ook geïnteresseerd in het uitvoeren van geheel-mount kruising in situ in het ontwikkelen van embryo's, maar de procedure nog niet hebben uitgevoerd. Het voordeel van de gekozen aanpak voor Astyanax onderzoekers is dat het is getest en in zowel cavefish en oppervlakte vissen morphs bewezen, teneinde vergelijkende expressie analyses. De onderhavige methode kan worden gebruikt door onderzoekers in studies over Astyanax en andere systemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Cincinnati (Protocol #10-01-21-01).

1. fixatie

  1. Gewenste aantal Astyanax mexicanus embryo's uit een tank van fokken te isoleren en op te lossen ~ 50 embryo's tegelijk. Als embryo's groot en oude zijn, wellicht 25 tegelijk om ervoor te zorgen zelfs fixatie vast te stellen.
  2. Afhankelijk van de leeftijd van het embryo, gebruik maken van de IACUC-goedgekeurde methode van narcose. Voor oudere embryo's met een goed functionerend zenuwstelsel, offeren embryo's via verdoving overdosis. Dienovereenkomstig, plaatst u in een oplossing van ~ 1% tricaïne (gebufferd op een pH van 7,4) embryo's om te minimaliseren van pijn en ongemak voor het organisme.
  3. Zodra de embryo's niet-reagerende te raken, vervang systeem water met tricaïne en voeg ~ 1 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4).
  4. Verwijder de PBS-oplossing en voeg 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA). Repareren van embryo's 's nachts bij 4 ° C.
    Let op: PFA is gevaarlijke (dat wil zeggen, het is brandbaar en is een huid en longen irriterende), voorzichtig behandelen.

2. uitdroging

  1. Uitdrogen van de embryo's, verwijder de kleefpoeders oplossing en spoel met 1 mL PBS. Plaats embryo-bevattende flesjes onder een hoek (tussen 30° en 45°), op een platform shaker tijdens spoelen. Blijven wassen de embryo tweemaal, 5 min per wasbeurt.
  2. Als embryo's nog steeds een chorion, alle embryo 50 's in een 100 x 25 mm petrischaal en hen zorgvuldig te isoleren van de chorions met behulp van twee sets van de horlogemaker verlostang (bijvoorbeeld #5 verlostang) onder een microscoop.
    Opmerking: Tijdens de stappen hieronder, en voor de rest van het protocol, verwijder voorzichtig alle vloeistof uit de vorige stap met behulp van schone, glas Pasteur pipettes alvorens toe te voegen de volgende oplossing
  3. Uitdrogen van de embryo's in een reeks van steeds meer geconcentreerde wasbeurten van methanol (MeOH) die hieronder worden beschreven. De verdunningen zijn gebaseerd op een totaal volume van 1 mL met 500 µL van oplossing gaan op elke 4 mL glazen ampul. Stappen alle uitdroging bij kamertemperatuur (RT) op platform shaker.
    1. Verwijder voorzichtig de PBS-oplossing. Voeg een 25% MeOH oplossing (250 µL van MeOH) + 750 µL van PBS. Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
    2. Verwijder voorzichtig de 25% MeOH-oplossing. Voeg een 50% MeOH oplossing (500 µL van MeOH) + 500 µL van PBS. Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
    3. Verwijder voorzichtig de 50% MeOH-oplossing. Voeg een 75% MeOH oplossing (750 µL van MeOH) + 250 µL van PBS. Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 minuten.
    4. Verwijder voorzichtig de 75%-MeOH-oplossing. Het toevoegen van een 100% MeOH-oplossing (1 mL van MeOH). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min. deze stap 3 keer herhalen.
  4. Op dit punt, gedehydreerd winkel embryo's, zo nodig, in hun glazen flesjes bij-20 ° C (lange termijn). U kunt ook gaan rechtstreeks naar dag 1 van het protocol.

3. dag 1: rehydratatie

  1. Gedehydrateerde embryo's verkrijgen bij-20 ° C vriezer (of gaan direct uit stap 2.5).
  2. Sorteren van de embryo's met behulp van een precisiepipet Pasteur. Een kunt sorteren op basis van morphotype (d.w.z., grot en/of oppervlak), en het aantal genen beoordeeld in elk experiment. Er zijn meestal niet meer dan 12 embryo's per flacon eenmaal gesorteerd. Als u wilt behouden organisatie, door gekleurde lab tape te gebruiken flesjes en pipetten voor elk gen aan te wijzen. Embryo's zal blijven in de dezelfde flacon gedurende het gehele protocol.
    Opmerking: Plaats het topje van de Pipet van Pasteur in 100% EtOH te steriliseren tussen gebruikt.
  3. Stel een schudden waterbad tot 70 ° C te worden gebruikt in een latere stap. Zorgvuldig, trekken uit de MeOH in flesjes van gesorteerde embryo's en vervangen 500 µL van nieuwe 100% MeOH. Wash kort (~ 1 min) op platform shaker.
  4. Hydrateren embryo's in een toenemende concentratie van 1 x PBS met tween-20 (PBT, zie hieronder) op platform shaker. De verdunningen zijn gebaseerd op een volume van 1 mL in de uiteindelijke verdunning met 500 µL gaan op elke flacon.
    1. Voeg een 25% PBT oplossing (250 µL van PBT-, 750 µL van MeOH). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
    2. Verwijder voorzichtig de 25% PBT-oplossing. Voeg een 50% PBT oplossing (500 µL van PBT-, 500 µL van MeOH). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
    3. Verwijder voorzichtig de 50% PBT-oplossing. Voeg een 75% PBT oplossing (750 µL van PBT-, 250 µL van MeOH). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
    4. Verwijder voorzichtig de 75% PBT-oplossing. Voeg een 100% PBT oplossing (1 mL van PBT). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min. deze stap 3 keer herhalen.

4. dag 1: Spijsvertering en fixatie

  1. Bereiden een proteïnase K (PK) oplossing door 1 µL van PK (20 mg/mL) toe te voegen aan 2 mL PBT.
  2. In afwachting van latere stappen, verkrijgen bij bevroren aliquots van hybridisatie buffers (Hyb- en Hyb +; Zie aanvullende bestand 2 en aanvullende bestand 3) en PFA-20 ° C-opslag.
    1. Toestaan PFA te ontdooien op RT.
    2. Plaats aliquots van Hyb- en Hyb + in een roterende 70 ° C waterbad. Plaats alle reagentia en flesjes binnen een kleine "pakking" met een gaas bodem, binnen het zwevende water bad apparaat. Hierdoor is eenvoudige toevoeging en verwijdering van buizen en flesjes uit de roterende 70 ° C waterbad.
  3. Zachtjes toevoegen PK oplossing voor de vial(s) van embryo's te waarborgen van alle weefsels zijn volledig bedekt met een oplossing. Het verteren van embryo's voor ~ 12 min in PK werkende oplossing op het platform schudapparaat.
    Opmerking: De lengte van de spijsvertering kan worden gevarieerd door de onderzoeker voor optimale resultaten.
  4. Zachtjes trekken uit de PK-oplossing, en kort overspoelen de flacon met PBT om te verdunnen van eventuele resterende PK.
  5. Trekken uit de PBT-oplossing en vervangen 500 µL van nieuwe PBT. Laat de oplossing te spoelen in het roteerapparaat platform voor 5 min.
  6. Trekken uit PBT en vervangen 500 µL van ontdooide 4% PFA. Toestaan dat de embryo's Incubeer gedurende 20 minuten op het schudapparaat platform op RT.
  7. Trekken uit de 4% PFA, en kort overspoelen de flacon met PBT om te verdunnen van eventuele resterende PFA. Trekken uit de PBT en vervangen 500 µL van verse PBT. Toestaan dat embryo's te spoelen gedurende 5 minuten op het schudapparaat platform. Herhaal deze stap 4 vaker.

5. dag 1: Prehybridization

  1. Plaats 500 µL voorverwarmde Hyb-oplossing in de flacon. Zorgvuldig plaatst de flacon in de 70 ° C water bad (binnenkant pakkingen) zonder schudden, 5 min.
  2. Trekken uit de Hyb-oplossing en overstroming van de flacon met 500 µL voorverwarmde Hyb + oplossing. Plaats de ampul terug in het waterbad van 70 ° C met schudden (40 rpm). Incubeer gedurende beide 4 h, of 's nachts.
    Opmerking: Een 4 uur incubatie levert een volledige in-situ protocol dat voor 4 dagen in totaal duren zal. Hier, wordt deze stap gepresenteerd als een overnachting incubatie, die een protocol duren 5 dagen in totaal zal opleveren.

6. dag 2: kruising

  1. Plaats een aliquoot gedeelte van Hyb + uit de diepvries van-20 ° C in het schudden bad warm water gedurende 5 minuten.
  2. Trekken uit de Hyb + uit de flacon en vervangen 500 µL voorverwarmde Hyb +. Voor deze oplossing, Voeg aan elke flacon 2 µL van RNA sonde. Zachtjes swirl het flesje om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van de sonde.
  3. Incubeer de oplossing Hyb + (met toegevoegde sonde) in het waterbad van 70 ° C's nachts terwijl het schudden van 40 toeren per minuut.
    Opmerking: Kan men opnieuw gebruiken Hyb + (met sonde) oplossing. Hiervoor meenemen Hyb + sonde uit de eerste run van de vriezer van-20 ° C en plaats het in een waterbad voor 5 min. vervangen Hyb + vanaf de dag 1 protocol met Hyb + met sonde en toestaan dat 's nachts het broeden in warm waterbad.

7. dag 3: Oplossing voorbereiding

  1. Het bereiden van microcentrifuge buizen met het label Hyb + met de "gene-of-interest" RNA-sonde. Maak de reeks verdunningen die zal worden gebruikt tijdens de dag 3.
    1. Met 6 afzonderlijke buizen, maak de volgende reeks verdunningen van Hyb- en zoute Natriumcitraat (SSC, 0 tot 100%) in een volume van 1 mL en plaats hen in de 70 ° C schudden bad het water: 1 = 100% Tube Hyb-(1 mL Hyb-): Tube 2 = 25% 2 x SSC (250 µL van 2 x SSC, 750 µL van Hyb-); 3 = 50% 2 x SSC buis (500 µL van 2 x SSC, 500 µL van Hyb-); 4 = 75% 2 x SSC buis (750 µL van 2 x SSC, 250 µL van Hyb-); Tube van 5 = 100% 2 x SSC (1 mL 2 x SSC); Buis 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
      Opmerking: Waakzaam van de concentratie van SSC, zoals het wordt gewijzigd van 2 x 0,2 x.
    2. Met behulp van 4 aparte buizen, maak de volgende reeks verdunningen van PBT- en WS in een volume van 1 mL, en plaats op RT: Tube 1 = 25% PBT (250 µL van PBT-, 750 µL van 0,2 x SSC); Buis 2 = 50% PBT (500 µL van PBT-, 500 µL van 0,2 x SSC); Buis 3 = 75% PBT (750 µL van PBT-, 250 µL van 0,2 x SSC); Tube 4 = 100% PBT (1mL van PBT).
    3. Een buis met 2 mL maleïnezuur buffer met tween-20 (MABT) werkende oplossing voor te bereiden.
    4. Twee 15 mL conische buizen van het blokkeren van de oplossing voor te bereiden. In elke buis, Voeg 0.2 g van blokkerende reagens tot 10 mL van MABT (Zie aanvullende bestand 4). Plaats beide buizen op een nutating mixer (of platform shaker) tot volledig is opgelost in-oplossing (maximaal 3 h).

8. dag 3: Sonde verwijdering

  1. Trekken uit Hyb + (met sonde) oplossing met een glazen pipet van Pasteur en leg deze in een steriel, met het label microcentrifuge buis. Deze buis in de vriezer van-20 ° C voor toekomstig gebruik behouden (als sonde-labeling is van succesvol).
  2. Voeg voorzichtig 500 µL van de warme WS/Hyb-verdunningen (onderstaande). Incubeer in elk van de volgende oplossingen voor elke 10 minuten in het waterbad van 70 ° C schudden.
    1. Incubeer opeenvolgend met 100% Hyb-(1 mL Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µL van 2 x SSC, 750 µL van Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µL van 2 x SSC, 500 µL van Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µL van 2 x SSC, 250 µL van Hyb-), 100% 2 x SSC (1 mL 2 x SSC) , 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
  3. Na de laatste stap, incubeer in elk van de volgende oplossingen voor elke 10 min. Alle van de volgende incubations plaatsvinden op RT op het schudapparaat platform: 25% PBT (250 µL van PBT-, 750 µL van 0,2 x SSC), 50% PBT (500 µL van PBT-, 500 µL van 0,2 x SSC), 75% PBT (750 µL van PBT-, 250 µL van 0,2 x SSC) , 100% PBT (1 mL van PBT).
  4. Na een 10 min incubatie, verwijderen de 100% PBT-, en voeg 500 µL van MABT in elke flacon. Herhaal deze stap tweemaal voor 5 min.

9. dag 3: blokkeren

  1. Verwijderen MABT uit elke flacon en floodlight met voorgemengde blokkerende oplossing van één van de buizen (bereid in stap 7.1.4). Flacon plaats op een nutating mixer voor ~ 4 h op RT.
  2. Voeg 2 µL van Anti-DIG-AP Fab fragmenten aan de tweede flacon van 10 mL oplossing (bereid in stap 7.1.4) en kort vortex blokkeren.
  3. Elke flacon bijna volledig te vullen met het blokkeren van de oplossing (~ 5 mL) en plaats op nutating mixer overnachting in een koelkast bij 4 ° C.

10. dag 4: MABT gespoeld

  1. Bereiden van een voorraad flacon van 10% normale geit serum (NGS) in MABT (Voeg 100 µL van NGS aan 900 µL van MABT).
  2. Trekken uit de blokkerende oplossing in elk flesje en voeg 500 µL van NGS/MABT mengsel in elke flacon. Toestaan dat de embryo's Incubeer gedurende 25 min op RT op het schudapparaat platform.
  3. Het mengsel van het NGS/MABT vervangen door 500 µL van 100% MABT. Incubeer gedurende 30 min op RT op het schudapparaat platform. Het uitvoeren van deze spoelen 11 vaker gedurende de dag elke 30 min.
  4. Vul de flacon met 100% MABT en op een mixer nutating overnachting in een kamer van het ijskast of inloop bij 4 ° C.

11. dag 5: Sonde visualisatie

  1. Bereiden van een hoeveelheid van 50 mL van alkalische fosfatase (AP) buffer (Zie aanvullende bestand 5). Combineren van de volgende handelingen uit in een conische tube van 50 mL, verpakt in aluminiumfolie om lichte blootstelling te beperken: 5 mL 1 M Tris (pH 9.5), 5 mL 50 mM MgCl2, 5 mL van de 1% Tween 20, 5 mL van de 1 M NaCl, 30 mL ddH2O.
  2. MABT Verwijder en vervang met 1 mL AP buffer (buis gewikkeld in folie). Laat het wassen gedurende 5 minuten. Doe dit twee keer om ervoor te zorgen volledige verwijdering van MABT.
  3. AP buffer te verwijderen en te vervangen met 1 mL van AP buffer met 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BVIE) en 4.5 μL van nitro-blauw tetrazolium (NBT). Vers bereide AP buffer/NBT/BVIE vervangen zodra elk uur tot reactie voltooid is. Volgen, controleren elke 15 min, zodat de verkleuring reactie plaatsvinden totdat het gewenste niveau van kleuring is bereikt. Als neerslag te vormen begint, vervangt u de oplossing vroeg.
  4. Kleuring zet de reactie stop door het spoelen van de embryo's in vers 100% AP buffer (zonder NBT/BVIE) voor 5 min. doorgaan gespoeld in PBT totdat optimale niveaus van signaal (met een minimale hoeveelheid achtergrondkleuring) worden verkregen. Blijven spoelen exemplaren met toenemende verdunningen van PBT in AP Buffer als volgt: 25% PBT (250 μL van PBT-, 750 μL van AP Buffer), spoelen gedurende 5 minuten; 50% PBT (500 μL van PBT-, 500 μL van AP Buffer), spoelen gedurende 5 minuten; 75% PBT (750 μL van PBT-, 250 μL van AP buffer), spoel gedurende 5 minuten.
  5. Spoel de embryo's in de ~ 5 mL 100% PBT op nutating mixer totdat de gewenste minimale achtergrondkleuring is bereikt. Schakel uit met verse PBT meerdere malen. Dit kan enkele dagen duren.
  6. Wanneer spoelen compleet, wassen embryo's in 500 μL van steriele PBS op een platform shaker is. Deze spoel tweemaal voor 5 min uitvoeren. Nadat PBS wast, na correctie van de specimens in 500 μL van 4% PFA gedurende 1 uur bij RT op een platform shaker. Ook 's nachts oplossen in 1 mL 4% PFA in de koelkast bij 4 ° C.
  7. Het fixeer vervangen door verse, steriele PBS. Deze spoelen uitvoeren ten minste tweemaal voor 5 min. plaats de embryo's in ~ 4 mL steriele PBS van 100%, en opslaan van lange termijn bij 4 ° C.

12. imaging

  1. Make-up een imaging plaat in een petrischaal met 3% agarose en TAE-buffer.
    Opmerking: Hoeveelheden afhankelijk van hoeveel platen nodig zijn. Platen kunnen meerdere malen worden hergebruikt. Het wordt aanbevolen dat een ondiepe rechthoekige schimmel in de petrischaal wordt geplaatst, terwijl de gel is koeling om het maken van een depressie bevatten de embryo's op de plaat.
  2. Plaats de embryo's op de plaat in de PBS.
    Opmerking: Het is het beste voorzichtig pour embryo's op het bord in plaats van hen uit pipetteren omdat is gebleken dat ze aan de binnenkant van plastic pipetten vasthouden zullen.
  3. De lichte microscopie van gebruik om het visualiseren van elk embryo. Gebruik een botte sonde te manoeuvreren van embryo's naar de gewenste positie.
  4. Neem een afbeelding wanneer het embryo in de gewenste positie is. Merk op dat het belangrijk is om beelden te nemen van embryo's binnen een paar weken van voltooide kleuring Voorkom mogelijke aantasting van de vlek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit verslag geven wij een eenvoudige en ongecompliceerde benadering standaardinteracties labeling van embryonale Astyanax specimens voor kwalitatief hoogwaardige gen expressie analyse. Deze techniek kan worden uitgevoerd in vier of vijf dagen, en elke belangrijkste stap in de procedure is vertegenwoordigd in een kleurgecodeerde stroomdiagram (Figuur 1). Zodra voltooid, moeten gebeitst embryo's haven een donkere paarse chromatische label in weefsel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vanwege de kwetsbaarheid van RNA voor afbraak betreft een van de belangrijkste stappen in het protocol de steriele synthese van de RNA-sonde. Echter, als een sonde zorgvuldig wordt gegenereerd, met goede resultaten, kan het worden hergebruikt in latere kleuring reacties. Een tweede cruciale stap is de zorgvuldige productie van alle reagentia in het gehele protocol gebruikt. Aangezien dit protocol betrekking heeft op verschillende dagen en veel kleine stapjes, is het essentieel dat alle reagentia nauwkeurig worden geprodu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedank leden van de bruto lab voor nuttige opmerkingen op dit manuscript. Wij willen vier middelbare schoolstudenten die dit protocol tijdens de zomer stages in 2017 en 2018 gebruikt, met inbegrip van Christine Cao, Michael Warden, Aki Li en David Nwankwo erkennen. HL werd gesteund door een UC biologie stam Fellowship in de zomer van 2017. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Science Foundation (DEB-1457630 aan de JBG), en de nationale instituten van tand- en craniofaciale onderzoek (NIH; DE025033 aan de JBG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL Serologische PipetVWR89130-888
1000 mL Filtratie UnitVWR89220-698
15 mL ConischeVWR-Greiner82050-278
25 mL Serologische PipetVWR89130-890
250 mL Filtratie UnitVWR89220-694
5 mL Serologische PipetVWR89130-886
50 mL ConischeVWR-Falcon21008-940
500 mL Filtratie UnitVWR89220-696
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentenSigma-Roche11093274910
BCIPSigma-AldrichB8503-1G1 g
Blocking SolutionSigma-Roche11 096 176 00150 g
CitroenzuurFisher ScientificA104-500500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Sigma-Roche11175025910
Eppendorf TubesVWR20170-577
EthanolFisher-Decon04-355-2231 Gal
FormamideThermo Fisher Scientific17899100 mL
Glazen dram-flesjesVWR66011-0411 Dr
Glazen PipettenFisher Scientific13-678-8A
HClThermal-ScientificPharmco-AAPER284000ACS500 mL
HeparineSigmaH3393-25KU
Magnesium Chloride-kristallijnFisher ScientificM33-500500 g
MaleïnezuurSigmaM0375-100g100g
MethanolFisher ScientificA452-44L
Molecuul-kwaliteit Water (RNase-vrij)VWR7732-18-5500 mL
NaClFisher ScientificS271-33 kg
NaOH-pelletsFisher ScientificS318-500500 g
NBT Substraat poederThermoFisher Scientific340351 g
Normaal GeitenserumFisher-Invitrogen31873
Nutating MixerVWR82007-202
ParaformaldehydeSigma158127-500g500 g
PBS 10xFisher ScientificBP399-2020L
Proteinase K (200mg/10ml)Qiagen1913310 mL
Kunststof PipettenVWR-Samco14670-147
RNAseSigmaR2020-250mL250 mL
Schuddend Waterbad 12 LVWR10128-12612 L
Standaard Analoge ShakerVWR89032-092
TrisSigma Millipore-OmniPur9210-500GM500 g
tRNA GistFisher-Invitrogen1540101125 mg
Tween 20SigmaP9416-50mL50 mL
Vortex-Genie 2Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc50-728-002
Lithium Chloride (LiCl)Sigma-Aldrich203637-10G10 g

Referenties

  1. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
  2. Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
  3. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  5. Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
  6. Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
  7. Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).
  8. Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
  9. Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
  10. Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
  11. Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
  12. Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).
  13. Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Analyse van genexpressieProteinase K-digestiehybridisatiebufferblokkeringsoplossingAP-bufferkleuringlichtmicroscopische beeldvormingholenvis oppervlaktevisRNA-sondedetectie
Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.