Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de bouw van een cel cultuur kamer ontworpen om bloot cellen tot verschillende soorten elektrische stimulatie, en het gebruik ervan bij de behandeling van mesenchymale stamcellen om osteogenic differentiatie.

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen/stromale cellen (MSCs) zijn uitvoerig gebruikt om bot genezing in weefsel engineering benaderingen te bevorderen. Elektrische stimulatie (EStim) heeft aangetoond dat MSC osteogenic differentiatie in vitro verbeteren en bot genezing in klinische instellingen te bevorderen. Hier beschrijven we de bouw van een EStim kamer voor de cultuur van de cel en het gebruik ervan bij de behandeling van bot-merg-afgeleide MSC ter verbetering van osteogenic differentiatie rat. We vonden dat behandeling van MSCs met EStim voor 7 dagen in een aanzienlijke toename van de osteogenic differentiatie resulteert, en bovenal dit pro-osteogenic effect blijft voortbestaan lang na (7 dagen) EStim wordt stopgezet. Deze aanpak van voorbehandeling MSCs met EStim ter verbetering van osteogenic differentiatie kan worden gebruikt om botweefsel engineering behandeling resultaten te optimaliseren en, dus, helpen hen om hun volledige therapeutische potentieel te bereiken. Naast deze applicatie, kunnen deze EStim cel cultuur kamer en protocol ook worden gebruikt te onderzoeken van andere EStim-gevoelige cel gedrag, zoals migratie, proliferatie, apoptosis en steiger bijlage.

Inleiding

Een toename van de trauma's en/of ziekte-geïnduceerde bot gebreken worden behandeld met behulp van verschillende combinaties van celtherapie en regeneratieve geneeskunde technologieën. MSCs zijn de cel van keuze in dergelijke behandelingen, vanwege hun relatief hoge osteogenic activiteit, isolatie en uitbreiding efficiëntie en veiligheid¹. Wilt maximaliseren van hun osteogenic activiteit en, dus, het optimaliseren van hun therapeutische doeltreffendheid, zijn verschillende methoden om te manipuleren MSCs voorafgaand aan het gebruik ervan in deze behandelingen (zoals herzien door Mauney et al.²) bijgekomen. Een dergelijke methode is EStim, waarvan is aangetoond te verbeteren van MSC osteogenic differentiatie in vitro³ en bot in vivo⁴genezing te bevorderen. Ondanks het groeiend aantal studies gericht op de behandeling van MSCs met EStim, moet een optimale regime voor het maximaliseren van de EStim pro-osteogenic effect nog worden gedefinieerd.

Andere methoden in vitro met behulp van EStim gebruiken zout bruggen ondergedompeld in het kweekmedium, die cellen van metalen elektroden⁵scheidt. Het voordeel hiervan is dat de invoering van chemische bijproducten (bijvoorbeeld, corrosie van metalen elektroden) die mogelijk cytotoxisch EStim leveren door middel van zout bruggen elimineert. Ondanks dit voordeel, zout bruggen zijn omslachtig om mee te werken en de EStim zij leveren verschilt van die in geleverde in vivo modellen, waardoor het moeilijk te correleren van resultaten bij het gebruik van de twee systemen. Opstellingen die EStim via metalen of koolstof elektrodes vast binnen de cel cultuur putten leveren simuleren (zoals herzien door Hronik-Tupaj en Kaplan⁶) beter apparaten die worden gebruikt in vivo; echter, deze apparaten zijn moeilijk te reinigen/steriliseren tussen toepassingen en het aantal cellen die kunnen worden bestudeerd per experiment is beperkt. We ontwierpen de EStim zaal gepresenteerd hier specifiek om aan te pakken van de beperkingen van deze andere opstellingen. Terwijl de meeste van onze ervaring met behulp van deze zaal EStim geweest met 2D en 3D culturen met het beenmerg - en adipeus-weefsel-afgeleide MSCs^3,4, een belangrijk voordeel van dit Parlement is dat het is veelzijdig en, met relatief kleine wijzigingen, kunnen worden aangepast aan het bestuderen van andere celtypes onder allerlei verschillende omstandigheden.

Hier beschrijven we de bouw van een EStim vergaderzaal voor de cultuur van de cel; vervolgens tonen wij het gebruik ervan door behandelende MSCs met verschillende regimes van EStim en het meten van het resulterende effect op osteogenic differentiatie. MSC osteogenic differentiatie wordt beoordeeld via afzetting van calcium, alkalisch fosfatase activiteit en osteogenic marker genexpressie. Nog belangrijker is, in verleden experimenten waarmee deze opstelling, we hebben vastgesteld dat deze pro-osteogenic effecten aanhouden lang nadat de EStim behandeling werd gestaakt.

Protocol

1. bouw van elektrische stimulatie cel cultuur kamer

1. Verzamelen om te bouwen de kamer EStim, twee deksels van standaard 6-well cel cultuur platen; 99,99% platina-draad, 60 cm lang met een diameter van 0,5 – 1 mm; zilver gecoat koperdraad, 70 cm lang met een diameter van 0.6 mm; snijden-tangen; soldeerbout kit; één buis van supergeleidende lijm; één draad aansluitblok connector, zes kleine 2.2 V LEDs (facultatief); één buis van noncorrosive siliconen lijm coating (facultatief); een rol van zwarte elektrische isolatietape; standaard, flexibele, geïsoleerd koperdraad elektrische (0,14 mm²), 2 m lengte (tabel van materialen).
2. In de deksel van een 6-well plaat, mark en boor vervolgens twee gaten (met een diameter van ~ 1 mm) wells 25 mm uit elkaar, in de buurt van de buitenste rand van elk van de zes (12 holes in totaal), zoals aangegeven in figuur 1A, B.
3. Gesneden twaalf 5 cm lengtes van platina-draad met snijden-tangen. Buig van elk van de draden handmatig in een L-vorm, waardoor één uiteinde 3 cm lang en de andere 2 cm. Snijd de zilver-gecoate draad in twee lengtes van 35 cm.
4. Steek de langere (3 cm) gebogen uiteinde van een platina draadje (van binnen naar buiten) in elke geboorde gat, verlaten van 1 – 2 mm uitsteekt aan de buitenkant van het deksel, buigen met behulp van de verlostang. Beveilig de platina draden in de gaten van de deksel met supergeleidende lijm en laat ze drogen voor ongeveer 6 h.
5. Soldeer de tips van alle zes platina draden (dat zal later dienen als kathoden, Zie figuur 1A) uitsteken van de deksels op één van de draden zilver gecoat. Herhaal dezelfde procedure, de resterende zes platina draden (die later zal dienen als anoden) solderen met de andere zilver-gecoate draad.
   1. Voeg LEDs in het circuit tussen elk van de zes anode-kathode platina-elektrode paren, functionaliteit tijdens de experimenten (optioneel) bevestigen. Plaats een stuk van zwarte isolatietape onder elk geleid om te voorkomen dat bloot van de cellen in de cultuur-platen aan het LED-licht (Figuur 1 c).
6. Lijm de draad aansluitblok connector naar de linker bovenhoek van het 6-well plaat deksel en beide beklede zilver draden sluit aan op de ingangen, zoals afgebeeld in Figuur 1 c.
7. Knip een gedeelte van de 20 x 20 mm van de linker bovenhoek van een tweede 6-well plaat deksel (figuur 1B, deksel Nr. 2) aan de klemmenstrook-connector op de eerste klep. Betrekking hebben op de eerste klep, uitgerust met de elektroden, met de tweede deksel en tape ze samen met plakband.
   1. Gebruik om te verbeteren de hechting van de twee deksels, siliconen lijm coating (optioneel). Om dit te doen, betrekking hebben op het deksel met de zilveren elektroden met een laag van 3 – 5 mm van silicone, lijm en bedek het met de andere deksel, waardoor 12 h voor de lijm drogen.
8. Sluit het ene uiteinde van de twee standaard geïsoleerde koperen draden aan op de ingangen van de uitvoer van de connector van de draad en de andere uiteinden aan banaan mannelijke connectors (4 mm).
   Opmerking: De lengte van deze draden is afhankelijk van de afstand van de plank in de incubator, waar de cellen zal worden gehouden op de stroomvoorziening, buiten de incubator (Figuur 1 d).
9. Aanpassen van de dosering (spanning) en regime van EStim afgeleverd bij de cellen door het reguleren van de DC voeding.
   1. Schakel de voeding door de ON/OFF -knop op het voorpaneel te drukken. Kanaal 1 activeren door op knop 1te drukken.
   2. Druk op knop Nr. 4 (V-set) om het instellen van de spanning. Druk op knoppen 2, . en 5 om de output van de belasting vastgesteld op 2,5 V. Druk op Enter.
   3. Zorgen dat de output van de belasting van 2,5 V (2500 mV) komt overeen met een EStim van 100 mV/mm, volgens de volgende, vereenvoudigde vergelijking.
      V _EStim = ; of
      V = V_EStim × d
      Hier, V = het netspanningsvoltage uitvoer in millivolts; d = de afstand tussen de elektroden in millimeter; V _EStim = de spanning van de stimulatie in millivolts per millimeter.
      Opmerking: Deze vereenvoudiging geldt alleen in geval van constante gelijkspanning. De weerstand tussen het medium en de cellen is verwaarloosbaar, aangezien elektroden niet in direct contact met de cellen; in plaats daarvan wordt EStim geleverd aan de cellen via het medium.

2. mesenchymale stamcellen cultuur in osteogenic medium

1. Kopen en bewaren van verkrijgbare rat MSCs (Zie Tabel van materialen) in vloeibare stikstof tot de dag van het experiment. Als alternatief, isolaat MSCs van andere dieren volgens protocollen gepubliceerd elders^7,,⁸ volgens lokale institutionele regels voor het gebruik van proefdieren.
2. Op de dag van het experiment, een flesje (1 x 10⁶ cellen) van MSCs verwijderen uit de opslag van vloeibare stikstof, en snel (binnen 1 min) ontdooien de cellen in een waterbad voorverwarmd tot 37 ° C.
   1. Onder steriele omstandigheden in een laminaire flow-kap, de inhoud van de flacon Pipetteer in een tube van 50 mL falcon en voeg 9 mL van normale medium (NM) voorverwarmde tot 37 ° C, bestaande uit Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, 1 x) met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine oplossing. Pellet de cellen gedurende 5 minuten door centrifugeren op 300 x g.
   2. In een laminaire flow-kap, verwijder het supernatant en zorgvuldig resuspendeer de pellet cel in 12 mL NM voorverwarmde tot 37 ° C. De geresuspendeerde cellen overbrengen in een T-75 kolf voor de cultuur van de cel.
3. Cultuur de cellen bij 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ tot ze een samenvloeiing van 80-90% (na ongeveer 3-5 dagen bereikt).
4. Passage van de cellen.
   Opmerking: Alle bewerkingen met uitzondering van centrifugeren en incubatie onder steriele omstandigheden uitvoeren in een laminaire flow-kap.
   1. Ophalen na het bereiken van een samenvloeiing van 80-90%, de cellen met cell detachement oplossing. Het kweekmedium cel gecombineerd, wassen 2 x met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 5 mL 1 x cell detachement oplossing en de cellen terug te keren naar de incubator voor 5 min.
   2. Zodra de cellen zijn vrijstaand, voeg een gelijke hoeveelheid kweekmedium aan de inactivering van het detachement oplossing. Verzamelen van de cellen in een tube van 50 mL falcon en draaien ze bij 300 x g gedurende 5 min.
   3. Negeren van het medium en resuspendeer de cellen in 1 mL verse normale voedingsbodem. Het aantal levensvatbare cellen met trypan blauwe vlek te beoordelen.
   4. Zaad 1 x 10⁶ cellen in een nieuwe T-75 kolf met 12 mL voorverwarmde NM. Cultuur de cellen bij 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ totdat ze een samenvloeiing van 80-90%.
      Opmerking: Cel passaging (stappen 2.4.1–2.4.4) kan worden herhaald een paar keer totdat het benodigde aantal cellen wordt verkregen. Gebruik geen cellen ouder dan passage 8.
5. Zaad 9 x 10⁴ cellen in 3 mL NM (10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 1% penicilline/streptomycine, DMEM) in elk putje van de plaat van een 6-well cultuur. Incubeer de cellen gedurende 1 dag bij 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂.
6. De volgende dag, gecombineerd kweekmedium en 3 mL osteogenic differentiatie voedingsbodem (OM; normale medium aangevuld met 10^-7 M dexamethason, 10 mM β-glycerophosphate en 0.05 mM ascorbinezuur-2-fosfaat) van toepassing.
7. Plaats de 6-well plaat met cellen in de incubator en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ 's nachts.

3. behandeling van de MSCs met EStim

1. Op de dag dat de cellen worden behandeld met EStim, steriliseren de elektroden in 70% ethanol oplossing gedurende 30 minuten; vervolgens droog ze onder UV-licht in een veiligheidskast voor een extra 30 min.
2. In een laminaire flow-kap, afdekplaat de 6-well met de gekweekte MSCs met het deksel voorzien van de elektroden, ervoor te zorgen dat de elektroden zijn volledig ondergedompeld in medium (indien nodig, toevoegen medium). De overdekte 6-well plaat (EStim kamer) met de cellen overbrengen in de incubator en sluit de kabels aan op netspanning.
3. Set de voeding naar 2.5 V uitvoer laden en behandelen van de cellen met EStim voor 1 h^3,9.
4. Na stimulatie, koppel de voeding los en verwijder de EStim zaal uit de incubator. Onder steriele omstandigheden, wisselen de deksel voorzien van elektroden met een standaard 6-well plaat deksel.
5. De cellen terug te keren naar de incubator en laat ze 's nachts. Reinig de elektroden, eerst met PBS en vervolgens met 70% ethanol oplossing. Reinig de producten van de geaccumuleerde corrosie van het oppervlak van de elektrode met fijn schuurpapier.
6. Herhaal stap 3.1-3.5 voor 6 opeenvolgende dagen. Wijzig op dag 4, alvorens EStim en onder steriele omstandigheden, het kweekmedium door zuigen 1,5 mL van medium en te vervangen met 1,5 mL verse OM. voorverwarmde
7. Na het toepassen van EStim gedurende 7 opeenvolgende dagen, gedurende de cellen in de cultuur een extra 7 dagen, uitwisselen van het medium om 3-4 dagen.

4. osteogenic differentiatie metingen

1. Cel morfologie wijzigingen onder een microscoop te analyseren.
2. Om te beoordelen van het effect van EStim op MSC osteogenic differentiatie, maatregel calcium depositie, alkalische fosfatase activiteit en osteogenic marker genexpressie, als beschreven elders^3,9.

Resultaten

Om te evalueren van het effect van 100 mV/mm EStim op de osteogenic differentiatie van MSCs, cellen EStim behandeld voor 3, werden 7, en 14 dagen of nontreated (control) geanalyseerd op dag 14 van kweken door beoordeling van de morfologische veranderingen en calcium afzetting (Figuur 2 ). Dit werd gedaan door imaging cellen met helder-veld microscopie (morfologie wijzigingen) of door de vaststelling van de cellen in 4% paraformaldehyde oplossing, hen met oplo...

Discussie

Hier beschrijven we de bouw van een kamer en een methode voor de behandeling van mesenchymale stamcellen met EStim die tot verbeterde osteogenic differentiatie leidt.

De setup van de EStim gepresenteerd vereist geen speciale apparatuur/kennis en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de biologie/biochemie de cel van de stam van de standaard door junioronderzoekers. Echter wanneer gebouw en met behulp van de zaal EStim, moet speciale zorg men in een paar kritische stappen. Bij de behande...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Estim fabricatie
Banana connector/Jack adapter	Poppstars	1008554	2 stuks
Snijtang	Knipex	78 03 125
DC voeding (0-30V/0-3A)	B&K Precision	Model 9130B	Elk vergelijkbaar model kan worden gebruikt
Geïsoleerde flexibele draden (0,14 mm2)	Conrad Electronic International	604794, 604093	2 stuks
Niet-corrosieve siliconenrubber	Dow Corning	3140 RTV	*kan worden gekocht bij veel winkels
Platinedraad (999,5/1000; 1mm ø)	Junker Edelmetalle	00D-3010	0,6 m nodig voor 1 Estim-kamer
70% ethanoloplossing	alle		Sterilisatie van Estim-kamer
Zilver gecoate koperdraad (0,6 mm ø)	Conrad Electronic International	409334 - 62	≈70 cm nodig voor 1 Estim-apparaat
Loodboutset	Conrad Electronic International	1611410 - 62	Elk vergelijkbaar model kan worden gebruikt
TPP 6-well plaatdeksel	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	2 deksels voor Estim-kamer
2,2V bedrade circulaire LED's	Conrad Electronic International	599525 - 62	6 stuks
UHU Superlijm	UHU GmbH & Co. KG	n/a	*kan worden gekocht bij veel winkels
MSC-cultuur
β-Glycerofosfaat dinatriumzout hydraat	Sigma-Aldrich	G9422	osteogene celcultuur
DMEM, lage glucose, GlutaMAX-supplement, pyruvaat	Thermo-Fischer Scientific	21885025	celcultuur
DPBS, geen calcium, geen magnesium	Thermo-Fischer Scientific	14190144	celcultuur
Dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902	osteogene celcultuur
Fetaal bovien serum	Thermo-Fischer Scientific	10500064	celcultuur
50 ml Falcon-buis	Sarstedt	62.547.004	celcultuur
L-Ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	A4544	osteogene celcultuur
Penicilline/Streptomycine	Thermo-Fischer Scientific	15140122	celcultuur
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymale stamcellen, beenmerg van oorsprong	Cyagen	RASMX-01001	celcultuur
Celdetacheringsoplossing	Thermo-Fischer Scientific	A1110501	celcultuur, celdetachering
TC Flask, T75	Sarstedt	833911302	celcultuur
TPP 6-well platen	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	celcultuur
Trypan Blauw Kleur, 0,4% oplossing	Bio-Rad	1450021	celtelling