Methodenartikel

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

8.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59133

⸱

7 maart 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Wake Forest University, 2Center for Molecular Communication and Signaling, Wake Forest University

In dit artikel

Samenvatting

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Samenvatting

Een genetische scherm voor mutant allelen die fenotypische defecten veroorzaakt door een mutatie onderdrukken is een krachtige aanpak om genen die deel uitmaken van nauw verwante biochemische pathways te identificeren. Vorige methoden zoals de synthetische genetische Array (SGA) analyse en willekeurige mutagenese technieken met behulp van ultraviolet (UV) of chemische stoffen zoals ethyl methanesulfonate (EMS) of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), hebben op grote schaal gebruikt, maar zijn vaak kostbaar en moeizaam. Ook deze mutagen gebaseerde screeningmethoden worden vaak geassocieerd met ernstige bijwerkingen op het organisme, inducerende meerdere mutaties die aan de complexiteit toevoegt van het isoleren van de suppressors. Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve protocol ter identificatie van de suppressor mutaties in mutanten die een defect van de groei in de Schizosaccharomyces pombe verlenen. De geschiktheid van cellen met een deficiëntie van de groei in standaard rijke vloeibare media of synthetische vloeibare media kan voor herstel met behulp van een geautomatiseerde 96-Wells-afleesapparaat over een langere periode worden gecontroleerd. Zodra een cel een mutatie suppressorgenen in de cultuur verwerft, outcompete de afstammelingen die van de ouderlijke cellen. De herstelde cellen die een concurrerende groei voordeel opzichte van de ouderlijke cellen ten kunnen vervolgens worden geïsoleerd en backcrossed met de ouderlijke cellen. De suppressor mutaties worden vervolgens geïdentificeerd met behulp van geheel-genoom sequencing. Met behulp van deze aanpak, hebben wij meerdere suppressors die verlichten van de ernstige groei defecten veroorzaakt door verlies van Elf1, een AAA + familie ATPase dat is belangrijk in nucleaire mRNA transport en onderhoud van genomic stabiliteit met succes geïsoleerd. Er zijn momenteel meer dan 400 genen in S. pombe met mutanten toekenning van een defect van de groei. Zoals velen van deze genen genfunctieonderzoek, stellen wij voor dat onze werkwijze de identificatie van nieuwe functionele interacties met deze gebruiksvriendelijke, hoge-doorvoer aanpak zal bespoedigen.

Inleiding

De basis van het begrip functionele banden tussen genen, is afhankelijk van het vermogen om te identificeren van de moleculaire mechanism(s) waarmee complexe genetische eigenschappen afwijken om te produceren verschillende fenotypes1. In de kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), zijn de meerderheid van de eiwit-codeert genen overbodig voor levensvatbaarheid2. Dit resultaat spreekt niet aan de unimportance van deze genen, maar eerder aan de ingewikkelde compenserende mechanismen ten grondslag liggen aan de biochemische trajecten die dergelijke genen behoren. Ontrafeling van deze compenserende mechanismen heeft geleid tot Epistasie kaarten, die hebben ontdekt uitgebreide genetische interacties en verbreed van ons begrip van functionele biochemische pathways,3,4.

High-throughput methoden (bijvoorbeeld synthetische genetische matrix analyse of SGA) zijn ontwikkeld om te identificeren van genoom-brede genetische interacties in de ontluikende gist, en hebben uitgebreid voor gebruik in kernsplijting gist5,6. Dergelijke benaderingen vaak afhankelijk van een bibliotheek van stammen met alle haalbare één eiwit-codeert genen verwijderingen (ongeveer 3300 haploïde schrapping mutanten die betrekking hebben op meer dan 92% van het genoom van de gist kernsplijting), en vereisen een robotachtig wapen voor het uitvoeren van de genetische kruisen tussen de stam van belang en alle mogelijke stammen in de library6. Further, SGA technieken afhankelijk van de mogelijkheid van bibliotheek stammen om adequate en doeltreffende paring, een fenotype dat abnormale tot 444 momenteel gekenmerkt genen in S. pombe2.

Ondanks de complexiteit van genetische interacties, vergelijken van het fenotype van een stam mutaties in twee genen aan het fenotype van twee stammen, uitvoering van individuele mutaties van elk gen draagt annuleerteken zijn men van twee opmerkelijke resultaten: 1) het dubbele mutant fenotype is erger dan de verwachte multiplicatieve ouderlijke fenotypen in de vorm van de ziekte of, in het meest extreme geval letaliteit. Dit wordt aangeduid als een negatieve genetische interactie, en is over het algemeen een teken dat de twee genen in parallelle biologische trajecten handelen. 2) het dubbele mutant fenotype is beter dan de verwachte combinatie van ouderlijke fenotypen, ook bekend als een positieve genetische interactie. Een positieve genetische interactie is bijzonder interessant omdat het aangeeft dat deze genen in hetzelfde proces functioneren. Twee positieve interactie genen hebben drie potentiële relaties: een gemuteerde gen kan de expressie van het andere gen in een parallelle weg omhoog-regelen, de twee genen kunnen werken in onderling overleg binnen de zelfde pathway stroomafwaarts van elkaar of de twee genen coderen eiwitten die directe interactie met elkaar. Daarom kunnen positieve interacties van genetische kaart gene regelgevende knooppunten te classificeren genfunctieonderzoek genen in biochemische pathways7,8worden gebruikt.

Een suppressor is een mutatie die kan verlichten het fenotype van de ziekte van de mutatie van een gen, meestal vertegenwoordigt een positieve genetische interactie tussen de twee genen9,10. Suppressor mutaties op een verschillende locus van die van de mutatie die ze onderdrukken staan bekend als extragenic suppressors. Ze zijn vooral waardevol analyse van niet-levensvatbare genetische mutaties door middel van synthetisch redden van de dodelijke fenotype (ook bekend als het Lazarus effect)11. Ze hebben ook potentiële therapeutische toepassingen bij de behandeling van erfelijke ziekten12,13.

Om al deze redenen, is de identificatie van de suppressor mutaties in verschillende modelorganismen wijd gebruikt om ons begrip van de verschillende biochemische pathways14,15,16. Screening voor suppressors is meestal gebaseerd op het fenotype van de mutatie in kwestie en is vereist voor het uitvoeren van willekeurige mutagenese om te isoleren van de mutaties die het fenotype verlichten zou. Bijna alle modelorganismen hebben gevestigde willekeurige mutagenese methoden. Bijvoorbeeld, N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) en ethylmethanesulfonate (EMS), twee mutagene agentia die staat inducerende punt mutaties in DNA, algemeen werkzaam zijn in diverse modellen van bacteriën tot muizen17,18,19 . Bovendien, is mangaan chloride lang gebruikt in gisten voor het vermogen van de mangaan catie voor de remming van de DNA repair pathways20. Een andere gemeenschappelijke benadering is UV-geïnduceerde mutagenese, die genoom-brede mutagene pyrimidine-Dimeren21,22 genereert.

Hoewel het gebruik van chemische mutagenese te identificeren suppressor mutaties zijn populair geweest, heeft de methode veel nadelen, met inbegrip van het gebruik van gevaarlijke chemische stoffen, zeer variabel slagingspercentages en de invoering van extra storende variabelen gepresenteerd door de negatieve bijwerkingen van de mutagene stof op meerdere cellulaire processen23,24. Bovendien, induceert chemische mutagenese vaak meerdere mutaties in het genoom die wordt toegevoegd aan de complexiteit van het gebruik van genetische en sequencing technieken om te identificeren van de exacte mutaties die het fenotype van de suppressor in het organisme25 verleende.

Om de tekortkomingen van de huidige aanpak van de mutagenese, presenteren we een methode om scherm voor spontane suppressor mutaties in kernsplijting gist die niet afhankelijk is van een mutageen of een bibliotheek verwijderen. De methode isoleert suppressors via een positieve selectie assay. Het uitgangspunt van deze methode is gebaseerd op het voordeel van de groei van de gemuteerde suppressor subpopulatie in de vloeibare cultuur, die kan worden gecontroleerd door een geautomatiseerde afleesapparaat. Paring en meiose worden alleen gebruikt als men willen zou opruimen van de genetische achtergrond of de aanwezigheid van monogeen allelen van suppressors voor geheel-genoom sequencing bevestigen. Als de onderdrukking fenotype wordt veroorzaakt door een enkele mutatie, zal het fenotype suppressor 2:2 scheiden na backcrossing met de ouderlijke stammen. De suppressor mutaties kunnen vervolgens worden vastgesteld met behulp van geheel-genoom sequencing. Wij stellen voor dat deze methode is van toepassing voor het screenen van suppressors in alle micro-organismen die tot een grote populatie in vloeibare cultuur groeien kunnen.

Protocol

1. bouw en voorbereiding van de stam

  1. Genereer een mutatie of een schrapping van het gen (yfm, uw favoriete mutatie) met behulp van standaard plaats-geleide mutagenese (SDM) zoals eerder beschreven26.
  2. Voordat u begint het scherm, backcross (optimaal) de gemuteerde stammen met een stam van de wild-type te reinigen van de genetische achtergrond en genereren van vers komaf mutantcellen als de ouderlijke stammen. De ouderlijke stam streak naar afzonderlijke kolonies op standaard rijke media platen. Acht tot zestien onafhankelijke koloniën (biologische wordt gerepliceerd) willekeurig te halen met de gewenste mutaties voor de plaat lezer assay (zie punt 3.1).
    Opmerking: Dit protocol is effectief alleen wanneer de ouderlijke stammen hebben een afwijking in vloeibare media (minimale of rijk, met of zonder drugs of met temperatuur verschuivingen, waardoor de groei gebrek) groei. Alle ouders stammen moeten haploïde en dus kunnen genetisch worden gekruist met andere haploïde stammen met een aanvullende paring type zijn.

2. plaat lezer assay

  1. Met een steriele applicator, neem een kleine hoeveelheid van elk van de kolonies bereid in stap 1.1 (geen exacte bedrag dat nodig is om te enten de begin cultuur) en plaats in een 96-Wells polystyreen microplate. Opschorten van elk van de kolonies in 200 µL van passende vloeibare media (rijke of minimale, met of zonder drugs). Omvatten een lege goed voor elke rij op de plaat met 200 µL van hetzelfde medium (geen cellen).
  2. Run het volgende protocol op een plaat software voor de detectie van de lezer aan een geautomatiseerde microplate-reader verbonden: een kinetische programma voor 24u en temperatuur ingesteld bij 30 ° C, met continue snel orbitale schudden (425 cpm, 3 mm amplitude). Stelt het optische luidt voor het meten van licht scatter bij een golflengte van 600nm voor optische dichtheid, en het licht om te lezen onder de plaat duikt met een frequentie van de lezing van 2 min (721 totaal leest over een periode van 24 uur per putje).
  3. Na 24 h, opnemen van de definitieve gewiste extinctie lezingen (gewiste OD600) en gebruik de volgende formule om te bepalen van het benodigde aan elk van de monsters naar od verdund volume = 0.1:
    figure-protocol-1
    Opmerking: Exporteren van de gegevens van de software van de lezer van de plaat en gebruik van een spreadsheet-software om de bovenstaande formule invoegen, zoals een functie aan batch verwerken de verdunningsvolume elk experimentele putje worden gebruikt.
  4. Elke 24 h, Verdun elk van de monsters met behulp van dezelfde media als dag 0 tot od = 0.1 (ongeveer 1.5 x 106 cellen/mL) met behulp van de formule in stap 2.3 aangegeven. Opslaan van alle groei curves dagelijks gegenereerd en noteer elke individuele kolonie waarin een grotere groei, beoordeeld door een definitieve od dat aanzienlijk hoger is dan de rest van de cohort met dezelfde genetische achtergrond of door een groeicurve die vergelijkbaar is met die van wild-type kolonies.
    Opmerking: Deze test duurt meestal ongeveer 7-14 dagen. Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden.

3. selectie van de suppressor kolonies en bevestiging van fenotype.

  1. Vanaf de laatste dag van de plaat lezer test (stap 2.4), sla de liquid culturen die een merkbaar herstelde groeitempo op jaarbasis, vermoedelijk door het verkrijgen van een mutatie suppressorgenen dat het fenotype van de ouderlijke mutatie kan verlichten. Breng en meng 250 µL vloeibare cultuur tot een cryotube met 250 µL 50% glycerol. Flash bevriezen van de cellen in vloeibare stikstof en sla de stammen in - 80oC voor onbepaalde tijd.
  2. Om te bevestigen dat de mutatie suppressorgenen een genetisch erfelijke element is, standaard genetische kruising methoden te gebruiken om te kruisen yfm P (voor ouderlijke, de stam gebruikt aan het begin van de plaat lezer assay) met yfm S (voor suppressor, de stam opgeslagen aan het einde van de plaat lezer assay). Als de mutatie suppressorgenen inderdaad een genetisch erfelijke element is, moet yfm P × yfm S tetrads waarin twee kolonies hebben het fenotype van de ziekte van de ouderlijke stam en twee kolonies hebben de herstelde groeitempo op jaarbasis van de suppressor opleveren stam.
  3. Kies uit het Kruis van stap 3.2, drie kolonies met het fenotype van de suppressor (S-stam) en drie kolonies met het ouderlijke fenotype (P-stam) van hetzelfde genetische Kruis (3 biologische replicatieonderzoeken voor elk), en ga verder met de genomic DNA-extractie en volgorde onderstaande stappen.
    Opmerking: Stap 3.2 en 3.3 zijn sterk aanbevolen, maar zijn niet verplicht. Anderzijds kan men herstelde vloeibare cultuur verzameld van 3.1 op de drager van de rijke in één kolonies verspreid, dan willekeurig kiezen drie koloniën als biologische triplicates voor geheel-genoom sequencing zonder verdere genetische bevestiging. In dit geval moeten drie biologische triplicates van ouderlijke stam voor genomic sequencing vergelijking worden gebruikt.

4. Genomisch DNA winning, productie van de bibliotheek en rangschikken.

  1. Voor DNA-extractie, bibliotheek voorbereiding en sequencing, willekeurig drie biologische replicatieonderzoeken per yfm P stam kiezen, en drie biologische van elk individueel ontstane yfm S stammen van de genetische kruisen (stap 3.2) of van repliceert de platen die hebben verspreid om te verkrijgen van enkele kolonies van de S-stam (Let op stap 3.3).
  2. Stammen in 10 mL culturen in rijke media groeien tot halverwege log fase (OD = 0,5 – 0,8, over 0,75-1.2 x 107 cellen/mL), en gebruiken van een schudden incubator to grow liquid culturen bij 30 ° C met voortdurend schudden bij 250 omwentelingen per minuut. Het verzamelen van cellen door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 5 minuten op 1000 x g.
  3. Schorten Ingehuld cellen in 400 µL van DNA-extractie-buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM nb2-EDTA), voeg vervolgens 400 µL van glasparels en 400 µL van 25:24:1 fenol: chloroform: Isoamylalcohol. Vortex krachtig gedurende 2 min bij 4 ° C.
  4. Voeg een extra 200 µL van de DNA-extractie-buffer en meng door het omkeren van meerdere malen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 4 ° C bij 20.000 x g.
  5. De waterfase overbrengen in een schone buis, 20 µg voor RNase A/T1 mix toevoegen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
  6. Voeg een gelijk volume 25:24:1 fenol: chloroform: Isoamylalcohol, spin voor 5 min bij 4 ° C bij 20.000 x g, dan de waterfase overbrengen in een schone buis.
  7. Voeg een gelijke hoeveelheid chloroform toe, Meng door meerdere keren, omkeren spin voor 5 min bij 4 ° C bij 20.000 x g, vervolgens de waterfase overbrengen in een schone buis.
  8. Overhaaste DNA met twee volumes van 100% ethanol plus 10% volume van 3 M NaOAC (pH 4.3) bij-20 ° C gedurende ten minste 2 h, draai vervolgens gedurende 5 minuten bij 4 ° C op 20.000 x g en verzamelen de pellet.
  9. Pellet (geprecipiteerde DNA) tweemaal met gekoeld 70% ethanol (Centrifuge op 20.000 x g, 5 min, 4 ° C) wassen en Suspendeer de pellet in 50 µL van 10 mM Tris Buffer (pH 7.4).
  10. Gebruik een bibliotheek prep kit (Zie Tabel van materialen) per fabrikant aanbevelingen ter voorbereiding van de bibliotheek geheel-genoom sequencing.
    Opmerking: wij raden de kit vermeld in de Tabel van materialen , omdat daardoor de bouw van de genomic bibliotheek zonder PCR versterking, die mutaties van de fout gegenereerd tijdens de PCR versterking minimaliseert. Bovendien, tijdens de voorbereiding van de genomic bibliotheek, laat niet de kralen aan volledig droog door verkorting van de droogtijd aan 1-2 min kraal.
  11. Gebruik voor het schuintrekken parameters tijdens de voorbereiding van de bibliotheek, een gerichte ultrasoonapparaat (Zie Tabel van materialen) en instellen van de factor van de plicht tot 20%, piekvermogen 175 W, met 200 cycli per burst, en frequentie vegen modus bij 5.5oC tot en met 6 ° C gedurende 45 s. als alternatief, gebruik een DNA en chomatin schuintrekken systeem (Zie Tabel van materialen) met de volgende instellingen: 50% amplitude bij 4 ° C met pulse modus, 15 s op en 15 s uit voor 10 minuten, met een totale verwerkingstijd van 20 min.
  12. Het is essentieel om de gevaarlijke materialen gebruikt in deze stap met zorg. Raadpleeg de geschikte materiaal Safety Data Sheets en instelling van milieu en gezondheid en veiligheid kantoor voor de behandeling van NaOAC, ethanol, 25:24:1 fenol: chloroform: Isoamylalcohol en chloroform.
  13. Het volgnummer van de resulterende genomic bibliotheken. De hele volgorde leest moeten betrekking hebben op ten minste driemaal van het gehele genoom met de resolutie op een bereik van één nucleotide. Sequencing gekoppeld-eindigde (of nieuwste technologie) wordt aanbevolen.

5. Bioinformatics analyse voor de identificatie van de suppressor mutaties

  1. De analyses van de bio-informatica te concentreren op de genomische veranderingen die consequent zijn vastgesteld tussen ouderlijke uit te voeren en onderdrukte yfm stammen in alle biologische repliceert.
    Opmerking: Het proces van volledige pijpleiding wordt hieronder beschreven, maar daarnaast twee BASH-script tekstbestanden, fastq_to_vcf.sh en vcfprocess.sh, worden opgenomen als aanvullende materialen te tonen voorbeelden van de werkstroom uit verwerking van leest aan VCF variant bestanden en de verwerking en de doorsnede van de VCF bestanden, respectievelijk.
  2. Trim korte-leest met behulp van SHEAR (https://github.com/jbpease/shear) na de opdrachtregels (alle andere opties standaard):
    shear.py--fq1 $FASTQ1--fq2 $FASTQ2--out1 $OUTFQ1--out2 $OUTFQ2 \
    --barcodes1 $BARCODE--TruSeq--trimqual platform 20:20 \
    --trimpolyat 0--trimambig--filterlength 50--filterunpaired
  3. Kaart leest aan de S. pombe referentie genoom v2.30 verkregen uit PomBase (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) met behulp van de BWA v0.7.1527. Gebruik de volgende opdrachtregel (alle andere opties standaard):
    BWA mem -t 8 $GENOME $OUTFQ1 $OUTFQ2 > $SAM1
  4. Beste praktijken gebracht uitlijning SAM bestanden door middel van GATK-pijplijn28 voor variant roepen met GATK v3.629, PicardTools v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard) en SAMtools v1.3.130. Gebruik de volgende opdrachtregels en parameters (alle andere opties standaard):
    Java-Xmx30g-jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups-INPUT = $SAM1 \
    UITVOER = $BAMMARKED RGID = 1 RGLB = lib01 RGPL = illumina \
    RGPU = $BARCODE RGSM = $SAMPLENUMBER
    samtools fixmate - O bam $BAMMARKED $BAMFIXED
    samtools sorteren - O bam -o $BAMSORTED -T /home/peasejb/tmp $BAMFIXED
    samtools index $BAMSORTED
    Java-Xmx30g-GenomeAnalysisTK.jar -T jar HaplotypeCaller \
    -R $GENOME-ik $BAMSORTED--genotyping_mode ontdekking \
    -stand_emit_conf 10 - stand_call_conf 30 -o $VCFRAW
  5. Comprimeren en index VCF bestanden met behulp van tabix:
    bgzip $VCFRAW.vcf
    tabix $VCFRAW.vcf.gz
  6. VCF bestanden onder ouderlijke vergelijken en suppressor stammen sequencing wordt gerepliceerd met behulp van BCFtools v1.3.127. Gebruik de volgende opdrachtregels en parameters (alle andere opties links standaard):
    bcftools isec - n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \
    $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list
    Opmerking: Deze opdracht leverde een bestand gecodeerd met binaire patronen waar varianten van de reeks verschijnen in de eerste mutant alleen zou binair gecodeerde als "000100", de tweede mutant alleen als "000010", alle drie mutanten als "000111," enz. Deze bestanden zijn gegenereerd voor elke set van ouderschapsverlof en mutant VCF bestanden repliceren.
  7. Compileer de variant snijpunt lijst bestanden samen met de naam van het bestand toegevoegd aan elke regel met behulp van het UNIX grep commando:
    grep "." *.list > all.list
  8. Kruisverwijzing van de complete variant lijst met de huidige GFF3 aantekening bestand (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) met behulp van een aangepaste Python script (variant_characterize.py) omgaan met consistente SNP sites in eiwit-codeert gebieden (synoniem en niet-synoniem), 5 ' en 3 ' UTRs en ncRNA.
    python3 variant_characterize.py--lijst common_variants.list \
    --gff schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \
    --fasta Schizosaccharomyces_pombe. ASM294v2.30.DNA.Genome.FA \
    --patroon 000100--uit all.list.filter.000100
    Herhaal dit script wijzigen de--patroon en het achtervoegsel van het uitvoerbestand (--out) met behulp van de binary
    patronen: 000010, 000001, 000110, 000011, 000101 en 000111
  9. Het combineren van de uitvoer van deze script wordt uitgevoerd in een door tabs gescheiden bestand, kunnen worden beschouwd als een werkblad. De geannoteerde inhoudsopgave varianten bevat die worden weergegeven in één of beide mutant strain(s) ten opzichte van de achtergrond. De binaire markeringsveld geeft beide verschijning in een enkele gemuteerde stam (000100, 000010, 000001), twee gemuteerde stammen (000011, 000101, 000110), of alle drie gemuteerde stammen (000111).
  10. De lijsten van de uitvoer van aantekeningen voorzien van varianten niet aangetroffen in de ouderlijke monsters, maar in een, twee of alle drie mutant monsters analyseren. De aantekening geeft zowel de genomic locatie en de klasse van variant (synoniem/niet-synoniem regio een codering, 3/5' UTR, niet-coderende, enz.). Uit deze lijst van kandidaat-mutaties, zou een voorbeeld van een sterk relevante kandidaten kunnen een niet-synoniem codering variant verschijnen consequent in alle drie stammen. Een ander soort sterke kandidaat zou een accumulatie van verschillende niet-synoniem of vermeende regelgevende mutaties in de gemuteerde stammen, die dicht bij elkaar of binnen hetzelfde gen verschijnen.

Resultaten

Langzaam groeiende mutanten weergeven fenotypische herstel in vloeibare cultuur
We geselecteerd drie mutanten betrokken in een verscheidenheid van biologische trajecten met een zieke, traag groeiende, fenotype: AAA familie ATPase Elf1, Histone Deacetylase Clr6 en Exon Junction Complex onderdeel Fal1. Een wild-type stam en stammen uitvoering mutaties van deze drie genen die had zijn backcrossed met wild-type stammen waren streaked aan afzonderlijke kolonies en 16 één kolonies werden willekeurig geselecteerd om te worden gekweekt in rijke vloeibare media met behulp van de 96-wells-plaat als hierboven beschreven. Groeicurven van afzonderlijke kolonies werden opgetekend op het oorspronkelijke tijdstip (dag 0) en voor 6 dagen met continue monitoring met behulp van de-afleesapparaat. Zoals verwacht, vertonen wild-type kolonies geen merkbare veranderingen hun groeicurven in de experiment31 (Figuur 1). Met name Toon vier kolonies met de achtergrond van elf1∆ en een fal1∆ kolonie een dramatische verschuiving in de groei van het langzaam groeiende aantal uiteenlopende niveaus van groei soortgelijke of dicht bij die van wild-type kolonies. Alle clr6-1 mutanten Toon dramatisch, een consistente fenotypische herstel, groeit in een sneller tempo door het einde van de test31 (Figuur 1). De verschillende fenotypes karakteriseren, verwijzen we naar de oorspronkelijke stammen die langzaam groeiende als "P stammen" (of ouderlijke stammen) en met de strains fenotypische herstel als "S stammen" (of onderdrukte spanningen) weergegeven. Houd er rekening mee dat de Figuur 1 een voorbeeld van een ronde van het experiment van de screening is, en vertegenwoordigt niet de totale niet-complementaire suppressors geïdentificeerd en sequenced in de volgende representatieve resultaten.

Fenotypische herstel wordt toegeschreven aan erfelijke eigenschappen
S. pombe kan groeien als een haploid in rijke media, maar twee haploïde stammen met complementaire paring typen mate onder stikstof honger. Meiosis in kernsplijting gist leidt tot een ronde van duplicatie gevolgd door twee rondes van de celdeling. De seksuele cyclus resulteert in de vorming van vier haploïde sporen uitvoering van het genetisch materiaal van de ouderlijke stam met 2:2 segregatie van genetische eigenschappen, volgens de regels van de klassieke Mendelian genetica (figuur 2A). Als volwassen op de dezelfde plaat voor de zelfde hoeveelheid tijd, bevestigd we de segregatie 2:2 toen terugkruising all onderdrukt stammen (S stammen) met hun ouderlijke stammen (P stammen), wat in 2 kleine (groei defect) en 2 grote (suppressor fenotype resulteerde) kolonies. Individuele voorbeelden voor onderdrukte elf1∆, clr6-1 en fal1∆ cellen zijn weergegeven in figuur 2B. Wij hebben bevestigd dat alle geïsoleerde S stammen dragen een monogeen genetische element dat de langzaam groeiende fenotype van hun P-stammen (gegevens niet worden weergegeven onderdrukt).

Geheel-genoom sequencing identificeert met succes suppressor mutaties
Zo hebben we gekoppeld-end hele genoom sequencing gebruikt om de genetische elementen die verantwoordelijk zijn voor het herstel van fenotypische elf1∆ S stammen te identificeren. Een uitgebreidere beschrijving van gegevensanalyse is beschikbaar online31. Kortom, wij werkzaam biologische triplicates van twee onafhankelijk gegenereerde elf1∆ P -stammen en biologische duplicaten van vijf niet-complementaire groepen van elf1∆ S stammen, die elk verschillende suppressors bevat. Nadat we een lijst van geannoteerde varianten verkregen in bioinformatics analyse (6.1-10), geprioriteerd we bepaalde klassen van varianten die relevant zijn voor onze analyse. We gericht op de identificatie van consistente genomic veranderingen die identiek in alle van de biologische replicatieonderzoeken van individuele elf1∆ S stammen in vergelijking met hun ouderlijke stammen van de elf1∆ P (Figuur 3 en aanvullende tabellen 1-4 waren ). Wij vijf nonsynonymous veranderingen op cd's regio's in alle vijf verschillende elf1∆ S stammen, en rli1 +, SPBPJ4664.02, cue2 + rpl2702 +geïdentificeerd. Zowel S-A1 en S-A2 bevatten gemuteerde SPBPJ4664.02, hoewel de mutaties bij verschillende aminozuren optreden. Omdat SPBPJ4664.02 een lange gen (11,916 nucleotiden) met honderden herhalingen, de mutaties niet konden worden bevestigd door het uitvoeren van PCR, gevolgd door sequentiebepaling. S-A3 bevat een schrapping mutant in rli1 die consistent is in beide biologische duplicaten. De mutant heeft echter niet samen scheiden met het fenotype van de S in elf1∆ achtergrond. We geïdentificeerd een cue2 mutant (cue2-1) in S-B1, met de aminozuren 396-400 ontbreekt. S-B2 bevat een mutant rpl2702 (rpl2702-1), waardoor aminozuur op positie 45 uit Glycine is aspartaat31gewijzigd. Zowel cue2-1 en rpl2702-1 werden bevestigd als elf1∆ suppressors zoals hieronder getoond.

Genetische bevestiging van geïdentificeerde suppressor mutaties controleert de erfelijkheidsgraad van het fenotype van herstel
Twee van de geïdentificeerde nonsynonymous veranderingen, cue2-1 en rpl2702-1, werden gereconstrueerd in het lab gebruikt standaard protocollen voor plaats-geleide mutagenese. Dubbele mutant stammen cue2-1 elf1∆-P en rpl2702-1 elf1∆-P werden gekruist met de gratis elf1∆ P stam31 (Figuur 4). Als de nonsynonymous mutaties, vastgesteld door middel van dit scherm volstonden om te onderdrukken elf1∆ P, zou dan de resulterende tetrads tonen een 2:2 kleine tot grote verhouding in de koloniën die voortvloeien uit de 4 sporen in elke tetrad. Inderdaad, genetische kruising bleek dat de geïdentificeerde suppressor mutaties succesvol zijn bij het onderdrukken van het langzaam groeiende fenotype van elf1∆ P en erfelijk zijn.

figure-results-1
Figuur 1: fenotypische herstel kan worden gecontroleerd door het opnemen van groeicurven in een afleesapparaat. Zestien enkele kolonies van wild-type (WT), elf1∆, clr6-1en fal1∆ werden geplaatst in een 96-wells-plaat. Groeikrommes werden opgenomen over een periode van 24 uur en kolonies werden opnieuw verdunde dagelijks in rijke media. De groei gebrek is duidelijk door de lage extinctie (OD) aan het einde van de periode van 24 uur per dag op dag 0. Fenotypische herstelde stammen zijn die weer een groeicurve vergelijkbaar, of dicht bij dat van wild-type in de periode 24 uur op dag 6. Vier kolonies van elf1∆, een kolonie van fal1∆en alle kolonies van clr6-1 liet zien van verschillende niveaus van fenotypische herstel na 6 dagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: genetische kruising kan bevestigen dat de fenotypische herstel wordt toegeschreven aan een enkele erfelijke allel. (A) wanneer kernsplijting gist cellen zijn onderworpen aan stikstof honger, twee haploïde cellen met een aanvullende paring type een zygote die sporulates voor het genereren van een tetrad van 4 sporen kunt genereren. De ouderlijke genetische materialen zullen scheiden tijdens de meiose volgens de regels van Mendelian genetica. (B) hersteld fenotypische koloniën (met het label S, voor onderdrukt) met aangegeven ouderlijke genotypen werden teruggekruist met hun gratis ouderlijke kolonie (waaruit blijkt geen fenotypische herstel, P, gelabeld voor ouderlijke). Genetische kruisen weergegeven: 2:2 kleine (arme fitness) naar groot (herstelde fitness) koloniën aantonen dat de fenotypische herstel erfelijk is en kan worden toegeschreven aan een enkel genetische element. Rode vakken zijn kolonies met de suppressor-allel, en blauwe dozen zijn kolonies met de ouderlijke allel. Dit cijfer is van Marayati et al., 201831gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: analyse van sequentiebepaling van het genoom-brede gegevens om genetische elementen verantwoordelijk van fenotypische herstel te identificeren. Drie biologische repliceert van twee ouderlijke stammen van de "P" (P-A en P-B), en twee biologische replicatieonderzoeken van vijf fenotypische hersteld overgeschakeld "S" stammen (S-A1, S-A2 en A3 S - verhaald P-A; S-B1 en S-B2 van P-B), sequenced waren en de mutaties werden georganiseerd als een lijst van elke mutatie in de herstelde spanning ten opzichte van het genoom van de ouderlijke stam het is afgeleid van (bijv. P-A vs. S-A1, enz.). Het totaal aantal gedetecteerde mutaties in het hele genoom van alle dergelijke paarsgewijze vergelijkingen was 660. Een totaal van 44 mutaties werden geïdentificeerd als enige mutaties die in beide biologische replicaat-organismen van dezelfde stam "S voorkomen" waren geselecteerd. Van de 44 mutaties waren 12 mutaties invoegen/verwijderen (INDEL) of niet - synoniem mutaties. Uit de 12 INDEL of niet-synoniem mutaties, vijf is opgetreden in het eiwit sequentie codering. De vijf mutaties mogelijk correleren met het enkele genetische element verantwoordelijk voor de fenotypische herstelde stammen: een niet-synoniem mutatie in SPBPJ4664.02 gevonden in S-A1 en S-A2, INDEL in rli1 gevonden in S-A3, INDEL in cue2 gevonden in S-B1, en niet-synoniem mutaties in rpl2702 gevonden in S-B2. Gedetailleerde reeks informatie over de mutaties en de gefilterde achtergrond is opgenomen in de aanvullende tabellen 1-4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4: bevestiging van de suppressors vastgesteld door middel van geheel-genoom sequentiebepaling. Resultaten van geheel-genoom sequencing werden bevestigd door zelfstandig genereren van de mutaties en uitvoeren van genetische kruist om te bevestigen het fenotypische herstel door overschrijding van een stam van de elf1∆ cue2-1 met een stam van de elf1∆ P , en elf1∆ rpl2702-1 met elf1∆ P stam. Drie representatieve verticale tetrads staan. Rode dozen zijn dubbel-mutant koloniën (elf1 cue2-1, of elf1 rpl2702-1); blauwe dozen zijn elf1∆ kolonies. Dit cijfer is van Marayati et al., 201831gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende tabel 1. Klik hier om te downloaden van deze tabel. 

Aanvullende tabel 2 . Klik hier om te downloaden van deze tabel. 

Aanvullende tabel 3 . Klik hier om te downloaden van deze tabel. 

Aanvullende tabel 4 . Klik hier om te downloaden van deze tabel. 

Aanvullende bestanden coderen . Klik hier om de bestanden te downloaden. 

Discussie

Het protocol beschreven hier vertegenwoordigt een roman en eenvoudige scherm voor spontane suppressor mutaties aantoonbaar door fenotypische herstel van mutaties overdracht van trage groei in kernsplijting gist, een fenotype karakteristiek van meer dan 400 genen in S. pombe, de functie van veel van die blijft onbekend2,-32. Vorige methoden hebben andere benaderingen te screenen voor suppressor mutaties in micro-organismen, met inbegrip van het gebruik van mutagenen21, of de toepassing van een verschuiving van de temperatuur in temperatuurgevoelige mutant achtergronden33genomen. In tegenstelling, blijkt dit protocol dat fenotypische herstel treedt op zonder extra milieu/chemische inmenging en hoogtepunten van het voordeel van de geschiktheid van de opkomst van onderdrukking mutaties uiteindelijk op de overname van de beschikbare middelen in vloeistof cultuur. Dit scherm staat de isolatie van zowel bypass suppressors of interactie suppressors, omdat het is effectief voor beide mutaties van de verlies-van-functie zoals elf1∆ of fal1∆ en puntmutaties zoals clr6-1, zolang de mutanten fitness gebreken in vloeibare cultuur tonen.

Alle herstelde S stammen die we hebben onderzocht gebleken tot nu toe wisselend van fenotypische herstel. Opgespoord door middel van genetische kruising, het herstelde fenotype is toe te schrijven aan een enkel element van de genetische en erfelijke (voorbeelden afgebeeld in Figuur 2). Dit is een van de belangrijkste voordelen van deze methode ten opzichte van chemische-gebaseerde of op basis van UV suppressor schermen, die vaak meerdere genomic loci richten. Het is gebruikelijk om het observeren van een of twee kolonies teruggewonnen uit 16 kolonies/stam (ongeveer 10%) binnen een week. Nochtans, merkte we dat bepaalde mutanten, zoals de verlies-van-functie van Rrp6, de nucleaire-specifieke exosome subeenheid, nooit hersteld tot de groei van bijna wild-type in elf1Δ cellen31 waargenomen. Het is waarschijnlijk dat de functie van Rrp6 kan alleen worden gedeeltelijk gecompenseerd door suppressors, in tegenstelling tot de functie van de andere mutanten getest, met inbegrip van fal1∆, die bleek te veroorzaken een ernstige Meiotische defect door haar belangrijke functie in regelgevende splicing34. Wij zijn van mening dat alternatieve suppressor screeningmethoden zou onderworpen aan hetzelfde probleem als yfg unieke, niet-vervangbare rollen in celgroei heeft.

Voordat u genomic volgorde uitvoert, is het optimaal aan rug-cross de fenotypische herstelde kolonies, geïdentificeerd uit de plaat-lezer, met de ouderlijke stammen om de genetische achtergrond en verkrijgen van biologische wordt gerepliceerd. Daarnaast geeft diep geheel-genoom sequencing honderden één nucleotide wijzigingen, waarvan de meeste zijn niet identiek tussen biologische wordt gerepliceerd die van weinig belang voor de screening. Bijvoorbeeld, vonden we een totaal van 660 genomic veranderingen over alle drie chromosomen tussen de twee elf1Δ P en de vijf verschillende S stammen (Figuur 3). Wij deden niet algemeen respecteren identiek mutaties tussen gesequenceerd biologische repliceert van elke stam, suggereren dat nieuwe mutaties voordoen tijdens het kweken van elf1Δ cellen vóór genomic bibliotheek bouw of willekeurige fouten kunnen worden tijdens de bouw van de bibliotheek en sequentiebepaling geïntroduceerd. Vandaar, isoleren van mutaties die over biologische replicatieonderzoeken stroken is een belangrijk aspect bij het succesvol identificeren van suppressors met behulp van geheel-genoom sequencing.

We geïdentificeerd en twee suppressors in vijf gesequenceerd S stammen regio cd's bevestigd. Hoewel mutaties in SPBPJ4664.02 werden ontdekt in zowel S-A1 en S-A2 stammen, is het onwaarschijnlijk dat SPBPJ4664.02 een geldige suppressor is omdat S-A1 en S-A2 niet een suppressor op hetzelfde gen bevatten als ze niet met elkaar (complementaire gegevens niet worden weergegeven). Wij deed ook niet bevestigen rli1 in S-A3, die niet samen met het fenotype van S scheiden deed als backcrossed met elf1Δ. Anderzijds vonden we specifieke mutaties in niet-codeert gebieden in S-A1, S-A2 en S-A3. Het is mogelijk dat deze veranderde niet-coderende genomic regio's verlichten het fenotype van de elf1Δ , die zal worden behandeld in onze toekomstige studies. In vergelijking met traditionele methoden, zoals een koppeling assay, die jaren duren kan om een genetische mutatie kaart, we twee suppressors geïdentificeerd binnen twee maanden nadat u hebt bevestigd dat een monogeen element het fenotype S veroorzaakt. Met de snelle ontwikkeling van geheel-genoom sequencing technologie zijn we optimistisch dat deze methode efficiënter te identificeren van consistente genetische mutaties in de nabije toekomst zal zijn.

Kortom biedt dit protocol stapsgewijze instructies voor het succesvol identificeren van mutaties van de suppressor voor een gen van belang met een langzaam groeiende gebrek in vloeibare cultuur. De eenvoud van deze test zorgt voor het grootschalig onderzoek van meerdere genetische achtergronden van belang met weinig hands-on opleiding. Er is ruimte om het proces verder te automatiseren met behulp van een liquid handling robot uit te voeren van de dagelijkse verdunningen. Aangezien laboratorium manipulatie van micro-organismen vereist onvermijdelijk groei in vloeibare cultuur, een proces dat is inherent selectief voor fitness, stellen wij voor dat dit protocol in grote lijnen kan worden toegepast op andere grote-populatie modelorganismen zoals bacteriën en andere soorten gist.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen goedkeuringen door de fabrikanten van de instrumenten die worden gebruikt in deze methode, en geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de National Institute of General Medical Sciences, subsidies 1R15GM119105-01 tot en met K.Z. Wij danken Alle reviewers voor inzichtelijke commentaar. Wij danken ook James Tucker, Alicia Anderson, Elizabeth zwart en Glen Marrs voor de discussie en commentaar op dit manuscript.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adenine, PowderAcros Organics147441000Gebruik op 75 mg/L om vloeibaar en vast rijk media (YEA) te maken
Bacteriologie PetrischaalCorning, FalconC351029100 ×15 mm, gebruik om stammen te laten groeien tot enkele kolonies op vast rijk media
D-Glucose Watervrij, PoederFisher ChemicalD16-1Gebruik op 30 g/L om vloeibaar en vast rijk media (YEA) te maken
Difco Agar, GegranuleerdBecton, Dickinson and Co.214530Gebruik op 20 g/L om vast rijk media (YEA) te maken
DNA extractie buffer2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA
Gefocuste ultrasoneCovaris Inc.S220Alternatief, gebruik QSonica Q800R sonicator/DNA en chromatine scheersysteem
Gen5 Data Collectie en Analyse SoftwareBiotek, Inc.GEN5SECUREOf gelijkwaardig, moet compatibel zijn met de microplaatlezer, gebruik om gegevenslezingen van de microplaatlezer te exporteren
Zoutzuur 1N, VloeibaarFisher ChemicalSA48-4Gebruik om pH aan te passen op 5,5 in vloeibaar en vast rijk media
Vloeibaar Rijk Media (vloeibaar YEA)30 g/L D-Glucose, 5 g/L Gist Extract, 75 mg/L Adenine, pH aangepast op 5,5 met 1 M HCl
Microplaatlezer, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode ReaderBiotek, Inc.BTH1MGOf gelijkwaardig, moet zichtbaar licht lezen bij 600 nm golflengtebereik
Rijk media agar platen (YEA platen)30 g/L D-Glucose, 5 g/L Gist Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH aangepast op 5,5 met 1 M HCl.
RNase A/T1 mixThermo Fisher ScientificEN0551Gebruik volgens aanbeveling van de fabrikant
Steriele Polystyreen Inoculating LoopCorning, Inc.OS101Of gelijkwaardig, gebruik om kolonies van agar platen over te brengen naar 96-well plate
Steriele werkruimte en branders
Weefsel Cultuur Plaat, 96-well Optisch Platte Bodem met Laag Vloeistofverlies DekselCorning, FalconC353072Of gelijkwaardig, moet een optisch platte bodem hebben voor klaar gebruik in microplaat
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep KitIllumina, Inc.20015962Gebruik om de volledige genoom sequencing bibliotheek voor te bereiden
Gist Extract, PoederFisher ChemicalBP1422-500Gebruik op 5 g/L om vloeibaar en vast rijk media (YEA) te maken

Referenties

  1. McKay, J. K., Latta, R. G. Adaptive population divergence: Markers, QTL and traits. Trends in Ecology and Evolution. 17 (6), 285-291 (2002).
  2. Wood, V., Harris, M. A., et al. PomBase: A comprehensive online resource for fission yeast. Nucleic Acids Research. 40 (D1), (2012).
  3. de Visser, J. A. G. M., Cooper, T. F., Elena, S. F. The causes of epistasis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1725), 3617-3624 (2011).
  4. Sailer, Z. R., Harms, M. J. Detecting high-order epistasis in nonlinear genotype-phenotype maps. Genetics. 205 (3), 107911088(2017).
  5. Kuzmin, E., Costanzo, M., Andrews, B., Boone, C. Synthetic genetic arrays: Automation of yeast genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 326-332 (2016).
  6. Tong, A. H. Y., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 313 (1), 171-192 (2006).
  7. Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B., Boone, C. Systematic Mapping of Genetic Interaction Networks. Annual Review of Genetics. 43 (1), 601-625 (2009).
  8. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  9. Bai, X., Yang, Z., Jiang, H., Lin, S., Zon, L. I. Genetic suppressor screens in haploids. Methods in Cell Biology. , 129-136 (2011).
  10. Manson, M. D. Allele-specific suppression as a tool to study protein-protein interactions in bacteria. Methods. 20 (1), 18-34 (2000).
  11. Motter, A. E., Gulbahce, N., Almaas, E., Barabási, A. L. Predicting synthetic rescues in metabolic networks. Molecular Systems Biology. 4, 168(2008).
  12. Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature Biotechnology. 22 (5), 595-599 (2004).
  13. Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, S. C., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nature Genetics. 37 (5), 526-531 (2005).
  14. Forsburg, S. L., Patton, E., et al. The art and design of genetic screens. Nature reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  15. Johnston, D. S. The art and design of genetic screens. Genetics. 3 (March), 176-188 (2002).
  16. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  17. Gocke, E., Müller, L. In vivo studies in the mouse to define a threshold for the genotoxicity of EMS and ENU. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 678 (2), 101-107 (2009).
  18. Suzuki, T., Hayashi, M., et al. A comparison of the genotoxicity of ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta(TM)Mouse). Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 395 (1), 75-82 (1997).
  19. Uttam, J., Alberico, C., De Stasio, E. ENU Mutagenesis. International C. elegans Meeting. , (1995).
  20. Putrament, A., Baranowska, H., Ejchart, A., Prazmo, W. Manganese Mutagenesis in Yeast. Methods in Cell Biology. 20, 25-34 (1978).
  21. Bose, J. L. Chemical and UV mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 1373, 111-115 (2016).
  22. Ikehata, H., Ono, T. The Mechanisms of UV Mutagenesis. Journal of Radiation Research. 52 (2), 115-125 (2011).
  23. Shrivastav, N., Li, D., Essigmann, J. M. Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation. Carcinogenesis. 31 (1), 59-70 (2010).
  24. De Stasio, E. A., Dorman, S. Optimization of ENU mutagenesis of Caenorhabditis elegans. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 495 (1-2), 81-88 (2001).
  25. Probst, F. J., Justice, M. J. Mouse mutagenesis with the chemical supermutagen ENU. Methods in Enzymology. 477 (C), 297-312 (2010).
  26. Bähler, J., Wu, J. Q., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  27. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows – Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  28. Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., et al. From fastQ data to high-confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  29. Mckenna, A., Hanna, M., et al. The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research. 20, 1297-1303 (2010).
  30. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Marayati, B. F., Drayton, A. L., et al. Loss of Elongation-Like Factor 1 Spontaneously Induces Diverse, RNase H-Related Suppressor Mutations in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 209 (4), 967-981 (2018).
  32. Harris, M. A., Lock, A., Bähler, J., Oliver, S. G., Wood, V. FYPO: The fission yeast phenotype ontology. Bioinformatics. 29 (13), 1671-1678 (2013).
  33. Xu, X., Wang, L., Yanagida, M. Whole-Genome Sequencing of Suppressor DNA Mixtures Identifies Pathways That Compensate for Chromosome Segregation Defects in Schizosaccharomyces pombe. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (3), 1031-1038 (2018).
  34. Marayati, B. F., Hoskins, V., et al. The fission yeast MTREC and EJC orthologs ensure the maturation of meiotic transcripts during meiosis. RNA. 22 (9), 1349-1359 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Whole genome sequencingautomatische plaatlezergenetische kruisinggroeistoornissite directed mutagenesecryopreservatieMendeliaanse genetica

Gerelateerde artikelen