Methodenartikel

Bereiding van de monsters voor Proteomics-analyse op basis van massa-spectrometrie van oogbeschadigingen en/of Microvessels

DOI:

10.3791/59140

⸱

22 februari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteoom karakterisering van oogbeschadigingen en/of microvasculaire bedden is cruciaal voor diepgaand inzicht in de vele oogbeschadigingen en/of pathologieën bij de mens. Deze studie toont aan dat een doeltreffende, snelle en robuuste methode voor eiwit extractie en bereiding van de monsters van kleine bloedvaten met de varkens korte posterieure Ciliaire slagaders als model vaartuigen voor proteomics massa spectrometrie-gebaseerde analyses.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van geïsoleerde oogbeschadigingen en/of bloedvaten in vitro te ontcijferen van de pathofysiologische staat van het oog met behulp van geavanceerde technologische benaderingen heeft ons begrip van bepaalde ziekten sterk uitgebreid. De Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde proteomics heeft ontpopt als een krachtig instrument te ontrafelen van veranderingen in de moleculaire mechanismen en eiwit signalering trajecten in de vasculaire bedden in gezondheid en ziekte. Monster voorbereiding stappen voorafgaand aan MS analyses zijn echter cruciaal om reproduceerbare resultaten en diepgaande opheldering van de complexe Proteoom te verkrijgen. Dit is vooral belangrijk voor bereiding van oogbeschadigingen en/of microvessels, waar de hoeveelheid monster beschikbaar voor analyses is vaak beperkt en dus een uitdaging voor optimale eiwit extractie. Dit artikel probeert te zorgen voor een efficiënte, snelle en robuuste protocol voor de bereiding van de monsters uit een voorbeeldige retrobulbaire oogbeschadigingen en/of vasculaire bed de varkens korte posterieure Ciliaire slagaders in dienst. De huidige methode richt zich op eiwit extractie procedures van zowel de bovendrijvende substantie en de pellet van het monster na homogenisering, sample reiniging met centrifugaal filter implantaten vóór eendimensionale gel elektroforese en peptide zuivering stappen voor het label-vrije kwantificering in een vloeibare chromatografie-electrospray ionisatie-lineaire ion trap-Orbitrap MS systeem. Hoewel deze methode is speciaal ontwikkeld voor proteomics analyses van oogbeschadigingen en/of microvessels, hebben we ook een overtuigend bewijs dat het kan ook gemakkelijk aangewend worden voor andere monsters van weefsel gebaseerde verstrekt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vooruitgang op het gebied van proteomics, welke vergunningen geïntegreerd en onovertroffen gegevens collectie macht, heeft sterk hervormd ons begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan bepaalde ziekten zo goed zoals in als gevolg van de fysiologische toestand van een bepaalde cel bevolking of weefsel1,2,3,4. Proteomics heeft ook bewezen als een belangrijk platform in ophthalmic onderzoek wegens hun gevoeligheid en onbevooroordeelde analyse van verschillende oogbeschadigingen en/of monsters, dat vergemakkelijkt de identificatie van potentiële ziekte markers voor de uiteindelijke diagnose en prognose, als blijkt elegant door vele studies in de afgelopen jaren, waaronder enkele van onze1,5,6,7,8,9,10. Het is echter vaak moeilijk te verkrijgen van menselijke specimens voor proteomic analyses ethische redenen, vooral gezien de behoefte aan controle materiaal uit gezonde individuen voor betrouwbare vergelijkende analyses. Aan de andere kant, is het ook uitdagend om te verkrijgen van voldoende hoeveelheid monsters voor optimale en betrouwbare massaspectrometrische analyses. Dit is met name cruciaal voor massa-beperkte biologische materialen zoals de micro-bloedvaten van het oog. Een dergelijke grote retrobulbaire bloed vaartuig dat cruciale rol in de regulatie van de bloedstroom oogbeschadigingen en/of speelt is de korte posterieure Ciliaire slagader (sPCA). Elke verstoring of afwijkingen in dit vasculaire bed kunnen leiden tot ernstige klinische gevolgen, die tot de pathogenese van diverse zicht-bedreigende ziekten, zoals glaucoom en nonarteritic anterieure ischemische optische neuropathie (NAION)11 leiden kunnen , 12. er is echter een gebrek aan studies ophelderen van de Proteoom veranderingen in dit arteriële bed als gevolg van de bovengenoemde nadelen. Daarom, in de afgelopen jaren het huis zwijn (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) heeft ontpopt als een goede diermodel in ophthalmic onderzoek als gevolg van de hoge morfologische en fylogenetische gelijkenissen tussen mens en varkens13, 14,,15. Varkens oogbeschadigingen en/of monsters zijn eenvoudig verkrijgbaar en bovenal zijn meer accurate weergave van menselijke weefsels.

Gezien de belangrijke rol van deze bloedvaten in het oog, evenals het gebrek aan methodologie verzorgd voor efficiënte eiwit extractie en analyses van deze microvessels, hebben wij eerder het proteoom van de varkens sPCA met behulp van een in-house gekenmerkt protocol dat in de identificatie van een groot aantal proteïnen16 resulteerde. Op basis van deze studie, we verder geoptimaliseerd en diepgaand beschreven onze methodologie in dit artikel, waarmee Proteoom analyse van minieme hoeveelheden van monsters met behulp van de varkens sPCA als model weefsel. Zij het belangrijkste doel van deze studie was om een MS-compatibele methodologie voor massa-limited oogbeschadigingen en/of bloedvaten, hebben wij aanzienlijke experimenteel bewijs dat de beschreven werkstroom ook worden in grote lijnen op verschillende monsters van weefsel gebaseerde toegepast kan verstrekt.

Het is voorzag dat deze werkstroom dienstig zijn voor de voorbereiding van hoogwaardige MS-compatibele monsters van kleine hoeveelheden materialen voor uitgebreide Proteoom analyse zal worden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures met behulp van dierlijke monsters werden uitgevoerd in strikte naleving van de Association for Research in visie en oogheelkunde (ARVO) instructie voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en visie onderzoek en door institutionele richtsnoeren. Deze studie werd uitgevoerd en goedgekeurd op de afdeling oogheelkunde, Universiteit medisch centrum Mainz.

Opmerking: Varkens ogen samen met de oogzenuw en extraocular weefsels werden verkregen vers van de plaatselijke slachthuizen onmiddellijk na het slachten. Enucleated ogen werden vervoerd naar het laboratorium in een ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en onmiddellijk gebruikt. Het schematisch overzicht van de workflow die werkzaam is als afgebeeld in Figuur 1.

1. oplossingen

  1. Te bereiden Krebs-Henseleit (K-H) buffer, weeg de volgende chemische stoffen (27.68 g NaCl, 8,4 g van NaHCO3, 1.4 g van KCl, 1,18 g van MgSO4en 0.64 g van KH2PO4) in een droge en schone 50 mL conische centrifugebuis en , 1,47 g CaCl2 en 8,0 g glucose in een andere buis.
    Opmerking: Het poeder mengsel van deze chemische stoffen moet worden opgeslagen in een koele en droge plaats. De CaCl2 en glucose poeder mengsel is best vers bereid om te voorkomen dat de absorptie van vocht en samendoen.
  2. Te bereiden 200 µL van extractie buffer 2A per pellet monster, mix 100 µL van extractie buffer 2 en 100 µL van het reagens A bij de winning van transmembraan eiwit kit (Zie B6 in de Tabel van de materialen).
    Opmerking: Aliquot de componenten van de transmembrane eiwit extractie kit bestaande uit extractie buffer 2, reagens A en proteaseinhibitor cocktail in werkende delen en opslag bij-20 ° C voor langdurig gebruik. Vermijd het herhaaldelijk bevriezen en ontdooien. Ontdooi de reagentia tot kamertemperatuur (RT) voorafgaand aan het begin van de pellet-extractiemethode.
  3. Los op te stellen (ABC, 100 mM) ammoniumbicarbonaatoplossing, 0.39 g ABC in 50 mL gedeïoniseerd water.
  4. Ter voorbereiding van 10 mM los 1, 4-dithiothreitol (DTT) oplossing, 30 mg van DTT 20 ml 100 mM ABC.
  5. Los om te bereiden 55 mM Iodoacetamide (IAA) oplossing, 200 mg IAA in 20 mL 100 mM ABC.
    Opmerking: IAA moet worden bewaard in het donker. Gebruik een aluminiumfolie laten teruglopen van de buizen met lichtgevoelige oplossingen.
  6. Bereiden van trypsine buffer met 10 mM ABC en 10% (vol / vol) acetonitril (ACN). Voeg 1,5 mL trypsine buffer in een flesje van 20 µg trypsine te ontbinden de inhoud hiervan op een 13 ng/µL trypsine werkende oplossing voor te bereiden.
    Opmerking: Volgorde van rang bewerkt trypsine wordt geleverd gelyofiliseerde vorm en moeten worden opgeslagen in de-20 ° C tot gebruik.
  7. Ter voorbereiding van peptide extractie buffer, meng 1:2 (v/v) van 5% mierenzuur bij ACN.
    Opmerking: Alle oplossingen in stappen 1.3-1.7 vers vlak voor gebruik bereiden en gooi een ongebruikte volume.
  8. Ter voorbereiding van 0,1% trifluorazijnzuur (TFA), meng 10 µL van TFA met 10 mL gedeïoniseerd water.

2. isolatie van korte posterieure Ciliaire slagaders

Opmerking: De varkens oog is fundamenteel verdeeld in deanterior (Figuur 2)en de achterste secties (Figuur 2B).

  1. Plaats de oog-wereld in een cupje van de dissectie met ijskoude K-H buffer. Zorgvuldig weg gesneden omringende spieren en weefsels met een scherpe schaar van Mayo.
  2. Maken van een sneetje met een scalpel en snijd de hele wereld langs de evenaar met een scherpe schaar van de Mayo tot het oog in de voorste en achterste helften is verdeeld. Verwijder zo veel glasvocht lichaam mogelijk vanaf de achterste helft van het oog met behulp van een paar standaard patroon pincet.
    Opmerking: Scheiding van de oog-wereld in twee helften vergemakkelijkt het isolement van sPCA met gemak zonder een bewegend oog in de dissectie schotel. Deze stap is echter niet verplicht. De schepen kunnen ook worden geïsoleerd zonder opening van de bol van het oog.
  3. Dissectie pinnen aan zorgvuldig pin omlaag de achterste helft van het oog met het netvlies zijde naar beneden en de oogzenuw naar boven richting de experimentator gebruiken.
  4. Zachtjes weggesneden van het bindweefsel rond de oogzenuw om de onderliggende retrobulbaire therapieën met een Student Vannas voorjaar schaar bloot te stellen.
  5. De sPCA kan worden gezien als korte takken van schepen (tussen de 5-8 takken) die de sclera doordringen en omtrek rond het hoofd van de oogzenuw (Figuur 2C). Het isoleren van de paraoptic en de distale sPCA samen met het omliggende bindweefsel met een paar van type 5 precisie pincetten en scharen van de capsulotomy Vannas (Figuur 2D).
    Opmerking: Ervoor zorgen dat de buffer K-H ijskoud gedurende de hele procedure isolatie blijft. Het is sterk aanbevolen om het wijzigen van de buffer elke 20-30 min, afhankelijk van de omgevingstemperatuur.

3. de monstervoorbereiding

  1. Zachtjes bindweefsels verwijderen uit de arteriële segmenten met behulp van extra boete-tipped type 5 precisie pincetten en Vannas capsulotomy scharen onder een stereomicroscoop en spoel de geïsoleerde slagaders in ijskoude PBS verwijderen contaminanten en residuen bloed.
    Opmerking: Als monsters niet aan de volgende stappen onmiddellijk onderworpen zijn, module-freeze ze in vloeibare stikstof en winkel in-80 ° C tot verder gebruik.
  2. Zwembad slagaders van twee ogen te verkrijgen van een biologische repliceren, ze vervolgens overbrengen naar 1,5 mL microcentrifuge buizen en wegen van de monsters met behulp van een analytische balans.
  3. Voeg een mengsel van 0.5 mm en 1,0 mm kralen van zirkonium oxide, gevolgd door weefsel extractie eiwitreagens aan elke buis, (T-PER; Zie B7 in de Tabel van de materialen).
    Opmerking: Het volume van de T-PER is afhankelijk van het gewicht van de monsters in elke buis, met een verhouding van 1 mL reagens tot 50 mg van monster. Een algemene regel van de duim te volgen bij het laden van buizen voor homogenisering een volumeverhouding van 1 is: 1:2 = monster: kralen: T-PER (Figuur 3A). Gebruik niet te groot van een volume van de winning buffer en te weinig van een hoeveelheid kralen ter voorkoming van inefficiënt homogenisering.
  4. Laden van de monster-buizen in een blender homogenizer (Zie D6 in de Tabel van de materialen). Stel de timer in op 2 min en snelheid niveau 6 en homogenisering beginnen. Na het lopen, check de monsters voor volledige homogenisering en herhalen van de cyclus tot monsters volledig zijn gehomogeniseerd (Figuur 3B).
    Opmerking: Een totaal van 24 monster buizen kan worden gehomogeniseerd in één punt. Het is belangrijk dat de monsters koud tijdens de homogenisering procedure te minimaliseren denaturatie van eiwit. De bullet blender homogenizer gebruikt in deze studie heeft een inherente koeling functie die de monsters koud houdt. In gevallen waar geen interne koeling functie beschikbaar in de homogenizer is, kunnen de monsters worden bewaard op ijs tussen elke uitvoering.
  5. Pipetteer zorgvuldig homogenaat in verse microcentrifuge buizen. Centrifugeer steekproeven bij 10.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C tot pellet onoplosbare eiwitten en aparte supernatant oplosbare eiwitten bevattende diervoeders. Pipetteer zorgvuldig uit het supernatant in verse microcentrifuge buizen zonder te raken de pellet laag (Figuur 3C).
    Opmerking: Zowel de bovendrijvende substantie als de pellet kunnen worden opgeslagen in de-80 ° C tot verder gebruik.

4. pellet spijsvertering

  1. 200 µL van extractie buffer 2A en 5 µL van proteaseinhibitor cocktail toevoegen aan elk monster pellet. Opschorten van de pellet verschillende malen met een pipet.
    Opmerking: Meng de extractievloeistoffen goed voordat u aan de pellet toevoegt. Extractie buffer 2A op ijs en de proteaseinhibitor bij RT gedurende de extractie procedure houden.
  2. Gebruik een ultrasone homogenizer om volledig Meng de pellet.
    1. Stel de amplitude op 60 en fiets naar 1. Gebruik een sonde gemaakt van titanium (Ø 0,5 mm, 80 mm lang), die geschikt is voor de homogenisering van de monsters met kleine hoeveelheden (10-500 µL).
    2. Dompel de sonde in de pellet en extractie buffer mengsel en druk op de startknop om het monster te ultrasone golven bloot te stellen.
    3. Bewerk ultrasone trillingen ten het monster totdat de pellet klontjes zijn volledig gehomogeniseerd. Wacht een paar seconden tussen elke ultrasoonapparaat.
    4. Controleer voor voltooid homogenisering visueel. Meng het homogenaat meerdere malen met een pipet om ervoor te zorgen dat er geen klontjes.
      Opmerking: De pellet extractie procedure moet worden uitgevoerd op het ijs om te voorkomen dat het denatureren van eiwit als gevolg van warmte gegenereerd tijdens de homogenisering (Figuur 4).

5. proef schoonmaken en Buffer van Exchange

  1. Centrifugaal filter-apparaten gebruiken met 3 kDa cutoff (Zie D3 in de Tabel van materialen) voor deze procedure volgens de instructies van de fabrikant met wijzigingen indien van toepassing. Voegt eerst, de filter-eenheid in een microcentrifuge buis (verkrijgbaar in de filter pack).
  2. Pipetteer 200 µL van monster homogenaat naar één filter apparaat en voeg 200 µL van gedeïoniseerd water in de zelfde filter. Veilig het kapje (Figuur 5A).
  3. Plaats de filter eenheid in een centrifuge en spin voor 14.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
  4. Verwijder het apparaat van de centrifuge en de eenheid van de filter met monster concentraat uit de buis van de microcentrifuge met het filtraat. Het negeren van het filtraat (Figuur 5B).
  5. Het reconstrueren van het concentraat door 400 µL van gedeïoniseerd water in de filter-eenheid toe te voegen. Herhaal stap 5.3 en 5.4 driemaal. Pipetteer zorgvuldig het concentraat 'schoongemaakte' monster in een schone microtube.
    Opmerking: Typisch, een ruwe monster van 200 µL ~ 50-70 zal opleveren µL van concentraat na filtratie.
  6. Herhaal stap 5.1-5.5 voor de resterende monster homogenates.

6. eiwit meting

  1. Gebruik de bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit (Zie B5 in de Tabel van materialen) om de concentratie van het eiwit van de bovendrijvende substantie en pellet breuken van de PEAC monsters op een afleesapparaat.
  2. Maak de albumine standaard (BSA) verdunningen (laatste BSA concentraties bereik tussen 25 tot 2.000 µg/mL) van een 1 mL ampul bestaande uit 2 mg/mL BSA, volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Pipetteer 10 µL van elke standaard verdunning van BSA en monster gerepliceerd (zowel supernatant en pellet) in elk putje van een 96-Wells flat-onderkant microplate.
  4. Voorbereiden van de BCA reagens werken door de toevoeging van 50 delen van BCA reagens A 1 deel van BCA reagens B.
    Opmerking: Berekenen van het totale volume van de reagens van de werken nodig zijn voor elke meting voorafgaand aan de voorbereiding en vers bereiden voldoende volume op basis van het aantal monsters en standaard verdunningen te worden bepaald.
  5. Zorgvuldig Pipetteer 200 µL van het BCA reagens werken in elk putje. Bedek de microplate en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na afkoeling de plaat aan RT, meet de extinctie op 562 nm op een afleesapparaat (Zie D13 in de Tabel van de materialen).
  6. Op basis van de standaard curve gegenereerd voor elke standaard concentratie van BSA (µg/mL), bepalen de eiwit-concentratie van de monsters.

7. dimensionale gelelektroforese (1DE)

  1. Voorbereiden op de monsters 1DE zoals weergegeven in tabel 1 (voor een voorbeeld). Het mengsel van monster goed mengen met een pipet. Verwarm de monsters bij 70 ° C gedurende 15 minuten en koel aan RT.
  2. Bereiden 1 x Running Buffer door toevoeging van 50 mL MES SDS uitvoeren Buffer tot 950 mL gedeïoniseerd water. Meng goed.
  3. Bereiden geprefabriceerd 4-12% Bis-Tris eiwit gels (Zie B4 in de tabel van materialen).
    1. Opengesneden het plastic zakje om te verwijderen van de gel cassette en de cassette met gedeïoniseerd water spoelen.
    2. Verwijder de kam uit de gel-cassette in één vloeiende bewegingen, verzorgen niet te beschadigen de putten.
    3. Spoel zachtjes de putjes laden 2 - 3 keer met 1 x Running Buffer met behulp van een precisiepipet. Omkeren en schud voorzichtig de gel cassette Schakel de buffer, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de putjes.
    4. Verwijder de witte tape aan de onderkant van de gel-cassettes.
  4. Gels (maximaal twee cassettes) invoegen in de gel lopende tank en zodra volledig geassembleerd, vergrendelen van de gel spanning wig.
  5. Vul de bovenste (kathode) buffer kamer met 200 mL Buffer uitvoeren totdat de putten zijn volledig gedekt. Controleer op eventuele lekkage.
  6. Voeg 500 µL van antioxidant (Zie A14 in de Tabel van materialen) aan de Buffer uitvoeren.
    Opmerking: De antioxidant is een fatsoen reagens dat moet worden gebruikt met monsters verminderd met reducerende agent (Zie tabel 1) voorwaarden te handhaven de vermindering tijdens elektroforese en om te voorkomen dat re-oxidatie van de gevoelige aminozuren zoals tryptofaan en methionine.
  7. Zorgvuldig laden 50 µg van monster per rijstrook met behulp van een precisiepipet. Vervolgens laadt de standaard vooraf gebeitst eiwit als een moleculaire massa marker (Zie A18 in de Tabel van de materialen).
  8. Vul de tweede (anode) buffer kamer met 600 mL Buffer uitgevoerd.
  9. De gels voor ~ 60 min op een constante spanning van 175 V uitvoeren. Aan het einde van de termijn, verwijder voorzichtig de gel van de plaat van de cassette met een mes van de gel.
  10. Breng zorgvuldig de gels in een gel kleuring vak.
    1. Bereid de fixing oplossing vers op basis van het totale aantal gels die worden gekleurd moeten, volgens de instructies van de fabrikant zoals wordt beschreven in tabel 2.
    2. Schud de gel(s) in de fixing oplossing voor 10 min op RT op een rockende platform.
  11. Negeren van de fixing oplossing en vlekken van de gels met colloïdaal blauw kleuring kit.
    1. De kleuring vers van oplossingen op basis van het totale aantal gels die worden gekleurd moeten, bereiden volgens de aanwijzingen van de fabrikant zoals wordt beschreven in tabel 3.
    2. Eerst meten het juiste volume en meng direct de onderdelen gemarkeerd met een sterretje (*) in het vak kleuring gel. Schud de gel(s) in de kleurstofoplossing zonder Stainer B gedurende 10 minuten op RT op een rockende platform.
    3. Voeg Stainer B direct in de kleuring vak bevat de * kleurstofoplossing. Zorg ervoor dat schudden Stainer B goed voorafgaand aan gebruik.
      Let op: Voorbereiding stap 7.10.1 en 7.11.1 onder een zuurkast verrichten.
  12. Schud de gel(s) in de kleurstofoplossing 's nachts voor het beste eindresultaat.
    Opmerking: De gekleurde banden zal worden zichtbaar binnen 10 minuten na de toevoeging van Stainer B. kleuring een minimum van 3 h vereist en de intensiteit niet verandert als de links voor meer uren in de kleurstofoplossing.
  13. Zorgvuldig de kleurstofoplossing decanteren en vervangen met 200 mL gedeïoniseerd water. Schud de gel(s) gedurende ten minste 7-8 uur in water om te wissen van de achtergrond.
    Opmerking: Gedeïoniseerd water moet meerdere malen worden gewijzigd tijdens de destaining procedure beter buitensporige vlek verwijderen. De gel(s) kan ook worden overgelaten in water voor maximaal 3 dagen zonder afbreuk te doen aan de intensiteit van de band eiwit. Als de gel(s) niet onmiddellijk aan de volgende stappen onderworpen wordt, kan het worden opgeslagen in 20% ammoniumsulfaat oplossing bij 4 ° C voor langdurige opslag.

8. in-gel al spijsvertering

Opmerking: Dit protocol is volgens de methode van Shevchenko et al.17, met lichte wijzigingen. Deze procedure moet worden uitgevoerd in een laminaire flow hood en toegewijde pipetten, tips, buizen en glaswerk gebruiken speciaal voor dit doel. Draag handschoenen en passende lab kleding te allen tijde keratine en andere verontreiniging te voorkomen. Alle oplossingen en reagentia gebruikt in deze procedure kort vóór gebruik voorbereiden.

  1. Accijnzen het eiwit bands uit de gel met schone, nieuwe microtoom bladen. Snijd de band in kleine stukjes (ongeveer 1 mm x 1 mm tot 2 x 2 mm). Breng zorgvuldig de gel stukken in 1,5 mL microcentrifuge buizen.
    Opmerking: Stukken die te klein Pipetteer tips kon verstoppen en grotere brokken peptide herstel zal verminderen. Wees voorzichtig bij het gebruik van de microtoom bladen, die uiterst scherp zijn.
  2. Destaining
    1. Voeg 500 l destaining oplossing met 100 mM ABC oplossing/ACN (1:1, v/v) en monsters op RT voor 30 min met af en toe schudden of vortexing uit te broeden.
    2. Pipetteer zorgvuldig uit de destaining oplossing. Controleer visueel voor alle buizen met resterende vlek. Herhaal stap 8.2.1 als gel stukken zijn nog steeds blauw gekleurd.
  3. Vermindering en alkylatie
    1. Voeg ~ 400 µL van vers bereide oplossing van DTT en Incubeer bij 56 ° C voor 30 min. ervoor te zorgen dat de oplossing volledig bedekt de gel stukken. Zorgvuldig Pipetteer uit de reducerende oplossing en gooi deze weg.
    2. Voeg ~ 400 µL van vers bereide oplossing van de IAA en broeden in het donker bij RT voor 30 min. verwijderen de alkylerende buffer met een pipet en gooi deze weg.
  4. Spijsvertering
    1. Voeg 500 µL van nette ACN op RT gedurende 10-15 minuten totdat de gel stukken krimpen en ondoorzichtig geworden. Pipetteer uit ACN en luchtdroog gel stukken voor 5-10 min onder de motorkap.
    2. Pipeteer 50 µL van trypsine oplossing in elke buis te volledig dekken de gel stukken. Incubeer de buizen in de 4 ° C gedurende 30 minuten.
    3. Controleer na 30 min, elke buis als alle trypsine oplossing is geabsorbeerd door de gel stukken. Voeg voldoende hoeveelheid trypsine buffer (50-100 µL, afhankelijk van het volume in de buis) toe om het volledig bedekt de gel stukken, indien nodig. Incubeer de monsters 's nachts bij 37 ° C.
  5. Peptide extractie
    1. Pipetteer zorgvuldig de uitgepakte peptide-oplossing van de buizen en overdracht aan de slangen schoon. Droog de bovendrijvende substantie in een centrifugaal vacuümverdamper.
      Opmerking: Gooi niet de overige stukken van de gel.
    2. Voeg 100 µL van extractie buffer (zie stap 1.7) aan elk tube en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met schudden.
    3. Pipetteer het supernatant in de dezelfde slangen met de uitgepakte peptiden volgens de respectieve bands en droog naar beneden in een vacuüm centrifuge.
      Opmerking: Als niet onmiddellijk wordt gebruikt, kunnen gedroogde peptide extracten worden opgeslagen in de-20 ° C tot enkele maanden tot verder gebruik.

9. peptide zuivering

Opmerking: Dit peptide ontzouten en zuivering voorbeeldprocedure wordt uitgevoerd met het gebruik van C18 Pipetteer tips (Zie C15 in de Tabel van de materialen). Gebruik een nieuwe tip voor elk monster.

  1. Voorbereiden op de volgende oplossingen fresh in conische centrifuge buizen en aliquot in 2 mL microcentrifuge buizen de peptide zuivering procedure, zoals aangegeven in tabel 4. Een samenvatting van de buizen voor peptide zuivering is als volgt: een (monsteroplossing), buis buis B (bevochtigende oplossing), buis C (oplossing), buis D (wassen oplossing), buis E (elutie oplossing), buis F (een lege 2 mL of 5 mL microcentrifuge buis, afhankelijk van het aantal monsters worden schoongemaakt, voor afvalverwerking), en buis G (een schone, lege microtube, capaciteit 0,2 mL).
  2. Reconstrueren van gedroogde peptide uittreksels uit stap 8.6.3 met 10 µL van 0,1% TFA. Deze buis is aangewezen buis A.
  3. Bewerk ultrasone trillingen ten buizen A in het ultrasoonbad met ijs gedurende 5 minuten.
  4. Spin naar beneden van de monsteroplossing in een centrifuge benchtop bij 1.000 x g voor 1 min.
  5. Een P10 micropipet ingesteld op de maximale volume-instelling van 10 µL en een C18 pipette uiteinde veilig hechten.
  6. Het uiteinde van de pipet onderdompelen in de bevochtigende oplossing (buis B) en zorgvuldig gecombineerd in het verpakkingsmateriaal. Langzaam afzien het afval in de buis F. Herhaal deze stap ten minste 7 - 8 keer.
    Opmerking: Pipetteer plunjer naar een dode stop drukken en langzaam loslaten of afzien van de stoter tijdens de gehele procedure. Het nemen van voorzorgsmaatregelen niet om luchtbellen in de tips tijdens pipetteren om ervoor te zorgen maximale peptide binding aan de C18-kolom.
  7. De tip voor peptide bindende equilibreer door zuigen 10 µL oplossing in buis C. negeren van de oplossing en herhaal deze procedure 3 tot 4 keer.
  8. Vervolgens gecombineerd en afzien van de monsteroplossing in buis A meerdere malen (afhankelijk van de overeenkomstige gel band dikte) als u wilt koppelen de peptiden aan het uiteinde van de kolom.
    Let op: De aspiratie en verstrekking stappen tijdens de bindende procedure (stap 9,8) worden uitgevoerd binnen buis A. Niet afzien van de monsteroplossing te verspillen.
  9. Wassen het C18 pipette uiteinde door aspirating de wassen oplossing in buis D en het afval (buis F) 4 tot 5 keer te verwijderen.
  10. Ten slotte elueer de afhankelijke peptiden door pipetteren de elutie oplossing (Tube-E) en verstrekking van de eluant in buis G.
  11. Herhaal de hele stappen 2 tot en met 3 cycli per monster te verhogen van monster herstel.
  12. Negeren van de tip na één monster zuivering en gebruik van een nieuwe tip voor de volgende steekproef.
  13. Droog de eluaten gezuiverde peptide in een vacuüm concentrator.
    Opmerking: De gezuiverde monsters zijn nu klaar voor LC-MS/MS analyses in de LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS-systeem. De gedroogde monsters worden opgeslagen in-20 ° C tot verder gebruik.

10. vloeibare chromatografie-electrospray ionisatie-MS/MS Analyses

Opmerking: Label-vrije kwantitatieve proteomics analyse wordt uitgevoerd op een systeem van vloeibare chromatografie-electrospray ionisatie-lineaire ion trap-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap) MS. De LC is samengesteld uit Rheos-Allegro quaternaire pomp uitgerust met een online degasser (gekoppeld aan een autosampler HTS PAL, en het systeem bestaat uit een 30 x 0.5 mm C18 pre kolom aangesloten op een 150 x 0.5 mm C18 kolom. Gebruik omgekeerde fase waterige oplosmiddel A bestaande uit LC-MS rang water met 0,1% (v/v) mierenzuur en organisch oplosmiddel B bestaande uit LC-MS rang acetonitril met mierenzuur van 0,1% (v/v). Gebruik het verloop met een looptijd van 60 min per gel band, zoals in detail beschreven in onze eerdere studies6,16.

  1. Los van de gezuiverde peptide monsters in 10 µL van 0,1% TFA. Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters op ijs gedurende 5 minuten.
  2. Pipetteer 10 µL monsters in een V-bodem 96-wells-plaat en verzegelen met een duidelijk en zelfklevende film.
  3. De plaat aan de autosampler overdragen.
  4. Gebruik het volgende verloop voor elke looptijd van 60 min: 0-35 min (15-40% oplosmiddel B), 35-40 min (40-60% oplosmiddel B), 40-45 min (60-90% oplosmiddel B), 45-50 min (90% oplosmiddel B), 50-53 min (90-10% oplosmiddel B) en 53-60 min (10% oplosmiddel B).
  5. De volgende massaspectrometrische gebruiksvoorwaarden van het instrument: positief ion electrospray ionisatie modus, spray spanning (2.15 kV), capillaire temperatuur (220 ° C), gegevens-afhankelijke overname modus, automatische overname schakelen tussen Orbitrap-MS en LTQ MS/MS, orbitrap resolutie (30.000), m/z-bereik (300-1600), doel automatische versterkingsregeling (AGC, 1.0 x 106 ionen), interne herijking (polydimethlycyclosiloxane [PCM] op m/z 445.120025 ionen in echt-tijd), sluis massa optie ingeschakeld in MS modus, tandem gegevens die zijn verkregen door het selecteren van de top vijf meest intense voorloper ionen, verdere versnippering door botsing-geïnduceerde dissociatie (CID), genormaliseerd botsing energie (NCE, 35% met activering tijd van 30 ms met herhaling telling van 3) en dynamische uitsluiting duur (600 s).
    Opmerking: De resulterende gefragmenteerde ionen worden opgenomen in de LTQ.
  6. Voer ten minste drie biologische replicatieonderzoeken voor elk monster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beperkte steekproef beschikbaarheid is één van de grote nadelen ophthalmic onderzoek. Dienovereenkomstig, extractiemethoden voor optimale eiwit opbrengst van kleine hoeveelheden van monsters, zoals oogbeschadigingen en/of bloedvaten zijn vaak aanvechtbaar. Tot op heden is er een schaarste van methoden die met name voorzien eiwit extractie van retrobulbaire bloedvaten. Daarom, als een eerste stap in de optimalisering van de methode en als een bewijs-van-principe te vergelijken van de werkz...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitgebreide Proteoom profilering van een breed scala aan oogbeschadigingen en/of monsters is een belangrijke en onmisbare eerste stap het ophelderen van de moleculaire mechanismen en signaalroutes betrokken bij gezondheid en ziekte. Om hoogwaardige gegevens te verkrijgen en te garanderen van de reproduceerbaarheid van de resultaten van deze analyses, de voorgaande monster voorbereiding stappen zijn cruciaal, zoals benadrukt in een recensie door Mandal et al., die diepgaand besproken de Voorbeeldprocedures voor de verwerk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Manicam wordt ondersteund door de interne Universiteit onderzoeksfinanciering (Stufe 1) van het universitair medisch centrum van de Johannes Gutenberg Universiteit Mainz en een beurs van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A. Chemicaliën
1, 4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
Calciumchloridedihydraat (CaCl2)  Carl Roth 5239.12,5 mM 
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) Thermo Fisher Scientific14190169
Mierenzuur (CH2O2)AppliChemA0748
HPLC-kwaliteit acetonitril (ACN, C2H3N)AppliChemA1605
HPLC-kwaliteit methanol (CH3OH)Fisher ScientificM/4056/17
HPLC-kwaliteit water AppliChemA1589
Iodoacetamid (IAA)Sigma-AldrichI6125
Kaliumchloride (KCl)  Carl Roth 6781.14,7 mM 
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) Carl Roth 3904.21,2 mM 
LC-MS-kwaliteit azijnzuur Carl Roth AE69.1
Magnesiumsulfaat (MgSO4)   Carl Roth 261.21,2 mM 
NuPAGE AntioxidantThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS Running Buffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000220x
NuPAGE Sample reducing agent Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 voorgekleurde eiwitstandaard Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC5925
Sequencing grade gemodificeerd trypsinePromegaV5111
Natriumchloride (NaCl) Carl Roth 9265.2118,3 mM 
Natriumwaterstoffcarbonaat (NaHCO3) Carl Roth 965.325 mM 
Trifluorazijnzuur (TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydraat Carl Roth 6780.111 mM 
B. Reagentia en kits
0,5 mm zirkoniumoxide kralen Next AdvanceZROB05
1,0 mm zirkoniumoxide kralen Next AdvanceZROB10
Colloidal Blue Staining  KitThermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC6025Om 25 mini gels per kit te kleuren
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gelsThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1,0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEKMerck Millipore71772-320 reacties per kit
Weefsel Eiwit Extractiereagens (T-PER)Thermo Scientific78510
C. Gereedschappen
96-well V-bottom platenGreiner Bio-One651180
Corning 96-well flat-bottom platenSigma-AldrichCLS3595-50EA
Weggeef microtoombladenpfm Medical207500014
Weggeef scalpels #21pfm Medical200130021
Dissectiepennen Carl RothPK47.1
Extra Fijn Bonn Schaar Fine Science Tools14084-08
Falcon conische centrifugebuizen (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Mayo schaar, Tough cut Fine Science Tools14130-17
Precisie pincetten Fine Science Tools11251-10Type 5
Precisie pincetten, recht met extra fijne tipsCarl RothLH53.1Type 5
Zelfklevende afdichtingsfolies voor microplatenRatiolab (vWR)RATI6018412
Standaard patroon pincetten Fine Science Tools11000-12
Student Vannas veer schaar Fine Science Tools91501-09
Vannas capsulotomy schaar  Geuder19760 Recht, 77 mm
ZipTipC18 pipette tipsMerck MilliporeZTC18S096
D. Apparatuur en apparaten
150 × 0,5 mm BioBasic C18 kolomThermo Scientific, Rockford, USA72105-150565
30 × 0,5 mm BioBasic C18 pre-kolom Thermo Scientific, Rockford, USA72105-030515
Amicon Ultra-0,5 3K Centrifugal Filter Devices Merck MilliporeUFC500396Pakket van 96.
Analytische balansSartoriusH51
Autosampler CTC Analytics AG, Zwingen, ZwitserlandHTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm Next AdvanceNA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301Sigma-AldrichZ368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424Fisher Scientific05-403

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
  5. Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
  6. Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526(2018).
  7. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629(2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
  10. Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481(2017).
  11. Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
  12. Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
  13. Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
  14. Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
  15. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
  16. Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298(2016).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
  18. Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
  19. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
  20. Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
  21. Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).
  22. de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ocular MicrovesselsProtein ExtractionMass Spectrometry ProteomicsSample PreparationCentrifugal Filter DevicesOne Dimensional Gel ElectrophoresisPeptide PurificationLiquid Chromatography MSTissue Protein ExtractionPorcine Short Posterior Ciliary Arteries

Gerelateerde artikelen