Methodenartikel

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

9.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59147

⸱

11 februari 2019

 ,  , 
1Japan Science and Technology Agency (JST), PRESTO, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 4Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba

In dit artikel

Samenvatting

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Samenvatting

De plant-immuunrespons die geassocieerd met een transcriptionele herprogrammering van genoom-brede wordt gestart op de plaats van de infectie. Dus, de immuunrespons ruimtelijk en stoffelijk is geregeld. Het gebruik van een fluorescerende gen onder de controle van een immuniteit-gerelateerde promotor in combinatie met een geautomatiseerde fluorescentie microscopie is een eenvoudige manier om te begrijpen van de spatio regulering van de immuniteit van de plant. In tegenstelling tot de root-weefsels die zijn gebruikt voor een aantal verschillende intravital fluorescerende imaging experimenten, bestaan er enkele fluorescerende live-imaging voorbeelden voor het blad weefsels die een matrix van airborne microbiële infecties optreden. Daarom ontwikkelden we een eenvoudige methode om te koppelen van de bladeren van Arabidopsis thaliana planten voor leven-cel beeldvorming over een langere periode van tijd. We gebruikten transgene planten van Arabidopsis uiting geven aan de gele fluorescerende eiwit (YFP) genefused aan de nucleaire localisatie signaal (NLS) onder de controle van de promotor van een defensie-gerelateerde marker-gen, () Pathogenesis-Related 1 PR1). We geïnfiltreerd een transgene blad met Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (avrRpt2) stam (Pst_a2) en in vivo time-lapse beeldvorming van het signaal van de YFP voor een totaal van 40 h met gebruikmaking van een geautomatiseerde fluorescentie stereomicroscoop uitgevoerd. Deze methode kan worden gebruikt, niet alleen voor studies over de immuunreacties van de plant, maar ook voor analyses van verschillende ontwikkelings gebeurtenissen en milieu reacties die zich voordoen in blad weefsels.

Inleiding

Plant immuunrespons impliceert een dynamische transcriptionele herprogrammering geregeld meerdere transcriptie factoren evenals fytohormonen1. De accumulatie van transcriptome gegevens biedt mogelijkheden voor het verzamelen van informatie op het immuunsysteem van de plant: bijvoorbeeld, de structuur van het netwerk van signalering cascades2. Onze kennis van de ruimtelijke en temporele dynamiek van de immuniteit van de plant blijft echter nog steeds beperkt3,4,5.

In eerdere studies, heeft Spatio regulering van defensie-gerelateerde genexpressie zijn meestal geanalyseerd met behulp van de kruising in situ en β-glucuronidase (GUS) verslaggever assay6,7,8. Deze methoden kunnen visualiseren de transcriptionele activering van verschillende genen van belang ter plaatse. Echter deze procedures vereisen chemische fixatie van specimens, en dus leiden tot het verlies van alle tijdelijke informatie. Biologische gebeurtenissen, zoals immuniteit, vooruitgang na verloop van tijd. Het gebruik van luciferase als verslaggever heeft de opname van tijdelijke dynamiek van de promotor van belang3ingeschakeld. Luciferase gebaseerde bepaling vereist echter een dure substraat en zeer gevoelige detectoren. Het vergroten van ons begrip van de spatio aspecten van de immuunrespons van de plant met behulp van een eenvoudige procedure, we genereerden transgene Arabidopsis thaliana planten uiting geven aan de gele fluorescerende eiwit (YFP) gen gesmolten tot de nucleaire localisatie signaal (YFP-NLS) onder de controle van de promotor van de defensie-gerelateerde marker-gen, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. We chlorofyl autofluorescence, een marker van levende cellen, gebruikt voor het vastleggen van het proces van geprogrammeerde celdood (PCD), die vaak tijdens effector geactiveerd immuniteit (ETI), een vorm van plant immuniteit geïnduceerd door specifieke pathogen infectie9 optreedt , 10. monitoring van de temporele dynamiek van fluorescentie signaalsterkte in vrij bewegende objecten, zoals wonen Arabidopsis bladeren, vereist een complexe beeld processing software beschikbaar of gebouwde huis commercieel. Anderzijds is verhinderen dat specimens verplaatsen een eenvoudige methode om het probleem op te lossen. Hier, ontwikkelden we een veelzijdige en eenvoudige methode voor montage leven van de bladeren van een transgene plant Arabidopsis voor de lange termijn waarneming onder een geautomatiseerde fluorescentie stereomicroscoop. De methode kan we vangen de promotor dynamiek binnen bodem-gegroeid intact plant over een paar dagen laat.

Protocol

Opmerking: Het is belangrijk om te voorkomen dat slaap verkeer van levende blad monsters tijdens time-lapse imaging. U wilt minimaliseren mechanische belasting op Bladeren, is zachte fixatie van de bladeren nodig. Alleen voldoende bereid blad monsters produceren time-lapse beelden geschikt voor diverse analyses van de afbeelding. Een protocol dat gebruik van transgene planten van Arabidopsis uiting van YFP-NLS fusion onder de controle van PR1 gene promotor (pPR1-YFP-NLS planten) en Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (avrRpt2) stam (Pst_a2) vindt u hieronder als voorbeeld.

1. bereiding van planten en ziekteverwekkers

  1. Vul een plastic cel plug lade (Tabel of Materials) met gesteriliseerde met autoclaaf bodem.
  2. Inzaaien een transgene Arabidopsis per cel(Figuur 1).
  3. De lade overbrengen in een kamer van de groei op 23 ° C gehouden en groeien de planten onder continue wit licht 2-3 weken.
  4. Twee dagen voorafgaand aan pathogen inoculatie, strijk Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 avrRpt2 (Pst_a2) stam uit een voorraad van glycerol op NYG medium (5 g/L pepton, Gistextract 3 g/L, 20 mL/L glycerol, bacteriologische agar 15 g/L, pH 7,0) bevat 100 mg/L rifampicine en 50 mg/L kanamycine en Incubeer bij 28 ° C gedurende 48 uur.
  5. Oogst de bacteriële cellen die worden weergegeven op het oppervlak van het medium gebruik plastic tips, overbrengen naar een plastic buis met 10 mM MgCl2en resuspendeer. Meet de optische dichtheid (OD) van de oplossing bij 600 nm (OD600). Pas de laatste cel van bacteriële cellen 108 kolonie vorming eenheden (kve) / mL, dat normaal met OD600 overeenstemt = 0,211.

2. pathogeen inoculatie

  1. Zorgvuldig uitgesneden een stekker van de cel met een 2-3 week-oude plant zonder beschadiging van de plant. Stel de cel in een lege cel plug lade (2 x 2 cellen zijn voldoende) een goed evenwicht (Figuur 1B).
  2. Selecteer een zichtbaar gezond blad voor inenting. In het algemeen, de derde, vierde en vijfde verlaat (#3 en #4 #5, respectievelijk in Figuur 1C) vanaf de onderkant van de plant zijn gemakkelijk te hanteren. Gebruik Bladeren op dezelfde positie in een aantal experimenten voor betere reproduceerbaarheid. Water de bodem houden de plant voor inoculatie voor lange termijn time-lapse imaging.
  3. Eventueel, in het geval van analyseren van stress-responsieve initiatiefnemers zoals pPR1, om ervoor te zorgen dat planten zijn niet natuurlijk benadrukt, onderzoeken de bladeren onder een fluorescentie stereomicroscoop voorafgaand aan pathogen inoculatie om te controleren of het ontbreken van YFP signaal. Uitsluiten verlaat weergegeven: YFP signaal uit het experiment.
  4. Draag wegwerphandschoenen latex voor infiltratie directe contact met het pathogene agens te vermijden. Met behulp van een naaldloze kunststof spuit van 1 mL, zorgvuldig infiltreren de abaxial kant van het blad met de bacteriële suspensie (108 CFU/mL)11 (Figuur 1D). Inoculatie van een klein gedeelte op de helft van het blad maakt een goede visualisatie van pPR1 activiteit; het geïnfiltreerde gebied zichtbaar als donkerder groen van kleur in vergelijking met de resterende blad. Wees zeer voorzichtig niet te mechanische schade aan het blad veroorzaken tijdens de infiltratie.
    Opmerking: Zorg ervoor dat alle intercellulaire ruimtes in het geïnfiltreerde gebied volledig (verticaal) vervuld met de ziekteverwekker schorsing; anders zullen de PCD domein moeilijk te visualiseren onder de fluorescerende stereomicroscoop. Dit kan eenvoudig worden bevestigd door voltooiing van donkere "greening" in het geïnfiltreerde gebied.
  5. Absorberen de overmaat van bacteriële suspensie uit de omgeving van de geïnfiltreerde sectie van het geïnfiltreerde blad met een zachte papieren handdoek.

3. montage van het geënte blad

  1. Onmiddellijk na inoculatie, vast een glasplaatje op de kunststof dienblad met behulp van chirurgische tape (Tabel of Materials), zodanig dat het geïnfiltreerde blad gelegen in het midden van het glasplaatje is. Zorg ervoor dat het geënte blad blad volledig binnen het glasplaatje(Figuur 2 uitgerust is).
  2. Bereiden dubbelgelaagd plastic tape (in het geval van 0,2 mm dikke band, Zie Tabel van materialen) en snijd het in twee stukken (Figuur 2B; stukken 1 en 2) aan de ruimten langs de bast van het geïnfiltreerde blad. Regelen van de lengte van deze twee stukken, aangegeven met een tweepuntige pijl in Figuur 2B, om te passen in de lengte van de tweepuntige pijl weergegeven in Figuur 2.
    Opmerking: Het uitsnijden van een hoek uit elk van de twee stukken helpt te voorkomen dat schade aan het blad blad (Figuur 2B, pijlpunten; Zie ook stap 3.4 hieronder). Elke vorm van kunststof band met vergelijkbare dikte is geschikt voor het maken van een brug over de bloemknop. De stijfheid van plastic tape is belangrijk voor eenvoudige behandeling tijdens de procedure hieronder beschreven.
  3. Met behulp van een paar fijne pincet, stok tape stukken 1 en 2 aan weerszijden van de bloemknop, zodanig dat de geslepen hoeken van elk stuk met de onderkant van het blad blad (Figuur 2C uitlijnen). Zorg ervoor dat de tape stukken raak niet de bast of blad blad.
    Opmerking: Deze plastic tape dubbelgelaagd stukken aan de voet van het blad blad fungeren als afstandhouders en preventie van fysieke stress op de bast tijdens montage.
  4. Een extra stukje dubbelgelaagd plastic tape (Figuur 2B, stuk 3) voor te bereiden op de grootte van de tweepuntige pijl in Figuur 2B passen en plak het op de top van de stukken van de tape 1 en 2 om te vormen van een brug over de bloemknop ( Figuur 2D, E). Wees zeer voorzichtig niet te vangen de bast als het blad blade rechtstreeks tussen de stukjes tape op posities aangegeven met pijlen in Figuur 2D, E.
  5. Voorzichtig een klein stukje van chirurgische tape (Figuur 2F, stuk 4) op het glasplaatje boven de tip van het blad blad te houden zodat het blad blad heel zacht is vastgesteld op het glasplaatje. Alleen stevig indrukken van het deel van chirurgische tape direct aanraken van het glasplaatje (Figuur 2F, gebied met een rode stippellijn), niet het andere deel overliggende voor het blad.
  6. Zachtjes stick nog een klein stukje van chirurgische tape (Figuur 2G, stuk 5) aan de rand van de bast en plastic tape stukken (1, 2 en 3), zodat de bast is heel zacht vastgesteld op zowel het glasplaatje en plastic tape stukken. Alleen steek stevig de deel van chirurgische tape direct aanraken van het glasplaatje het glasplaatje en plastic tape stukken (Figuur 2G, gebied met een rode stippellijn), niet het andere deel de bloemknop overliggende.
  7. Verhinderen dat naburige bladeren bewegen in het gezichtsveld van de microscoop met behulp van 200 µL Pipetteer tips (Figuur 2H). De uiteinden van de pipet in de bodem te zacht houden van de naburige bladeren uit de buurt van het geïnfiltreerde blad invoegen Wees voorzichtig niet te voegen de tips te diep in de bodem om mogelijke wortel schade te voorkomen.
    Opmerking: De bereid plant is nu klaar voor fluorescentie stereomicroscoop imaging.

4. de microscopische time-lapse observatie

  1. De fluorescerende stereomicroscoop inschakelen.
    Opmerking: Hier, een geautomatiseerde stereomicroscoop uitgerust met een zeer gevoelige 1.4 megapixel monochroom digitale camera in 12-bits modus wordt gebruikt (Tabel van materialen). De Microscoop moet worden geplaatst in een donkere kamer uitgerust met een airconditioning unit of in een donkere kast met voldoende ventilatie om de kamertemperatuur op 23 ° C tijdens time-lapse imaging.
  2. Stel de plant in de ruimte boven onder het objectief van de stereomicroscoop voor imaging.
  3. Stel de parameters voor time-lapse beeldvorming (zie voorbeelden in tabel 1). Zorg ervoor dat programmastappen voor blootstelling aan licht gedurende de interval time-lapse imaging omdat licht een grote invloed op de plant immuniteit12 heeft.
    1. De conventionele YFP filter (excitatie 500-520 nm, emissie 540-580 nm) gebruiken om te visualiseren het YFP signaal.
    2. Gebruik de filter van de Texas Red (TXR) (excitatie 540-580 nm, emissie 610 nm lange pass) te visualiseren van chlorofyl autofluorescence zodat de PCD domein zichtbaar als een donkere omgeving (geen autofluorescence is), omringd door YFP-positieve cel lagen9 (Figuur 3 A).
    3. Gebruik de setup voor conventionele epi-helder veld voor aanvullende blootstelling aan licht stappen.
      Opmerking: Voordat het experiment, meten van de kracht van epi-heldere lichtbron en aanpassen aan het niveau van de eigen plant groei voorwaarde.
  4. De time-lapse imaging-programma uitvoeren Voor lange termijn waarneming gedurende een aantal dagen, kunt u overwegen drenken de plant op de juiste manier, bijvoorbeeld tijdens de blootstelling aan licht stappen.
  5. Na image aquisition, weglaten extra kanalen gebruikt voor blootstelling aan licht in de intervallen (overeenkomend met 3-8 kanalen in tabel 1) van de gegevensset. Het analyseren van gegevens met verschillende methoden, zoals regio-of-interest (ROI) analyse, met behulp van andere afbeelding analysesoftware zoals Fiji9.

Resultaten

Hier hebben we gebruikt Pst_a2-geïnduceerde ETI als voorbeeld voor time-lapse imaging. Time-lapse gegevens werden verkregen als een reeks van beelden, een paar van die worden weergegeven in Figuur 3, onderB, en als een time-lapse film (aanvullende film 1)9. In succesvolle experimenten met behulp van pPR1-YFP-NLS tijdens Pst_a2-geïnduceerde ETI, voorbijgaande activering van pPR1 werd waargenomen, zo blijkt uit YFP uiten foci, in verschillende lagen van cellen rondom de PCD domein (Figuur 3B) 9. de activering van de pPR1 in cellen rondom de PCD domein meestal begint bij ongeveer 5 uur post inoculatie (hpi), pieken bij ongeveer 12 hpi, en duurt maximaal 40 hpi (Figuur 3B)9. Omdat beelden werden verkregen met behulp van een epi-belichting fluorescerende systeem, zijn de signalen van de YFP hier verkregen uit diverse lagen van de adaxial cel, met inbegrip van epidermale evenals bovenste mesophyl cellen ontstaan.

figure-results-1
Figuur 1 : Methode die wordt gebruikt voor de infiltratie van bacteriële pathogenen in de Arabidopsis thaliana blad. (A) twee - tot drie week-oude Arabidopsis planten zijn geteeld in een cel plug lade. (B) één-cel sluit met de geselecteerde plant worden gebruikt voor inoculatie en observatie was uitgesneden en geplaatst in de lege cel plug lade evenwicht te bewaren. (C) De derde, vierde en vijfde verlaat (#3 en #4 #5, respectievelijk) zijn geschikt voor beeldanalyse. (D) infiltratie van de schorsing pathogen in een geselecteerde blad met behulp van een naaldloze spuit. Het geïnfiltreerde gebied kan worden herkend op basis van de kleur donkerder groen dan het resterende blad. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 : Methode die wordt gebruikt voor de montage van de geïnfiltreerde Arabidopsis blad voor time-lapse imaging. (A) foto van de Arabidopsis plant met een glasplaatje ingevolge het geënte blad vast. Het geïnfiltreerde blad werd gepositioneerd in het midden van het glasplaatje. De tweepuntige pijl geeft de lengte van de plastic tape afstandhouders. (B) opstellen van plastic tape spacers en brug. Dubbele - gelaagde kunststof tape werd in tweeën gesneden stukken (1 en 2) voor de afstandhouders, en een ander stuk (3, aangegeven met een rode stippellijn) werd gesneden om voor te bereiden van een brug. De lengte van de tweepuntige pijl zijn vrijwel identiek zijn aan de lengte van de pijl met twee punten in (A). Een van de vier hoeken van de stukken 1 en 2, aangegeven met pijlen, werden gesneden. (C) twee stukken van dubbelgelaagd plastic tape (genummerd als 1 en 2) werden zorgvuldig in het glas van de dia langs de bloemknop met behulp van een paar fijne pincet, zonder rechtstreeks contact met de bast als het blad mes geplakt. (D) een extra stukje dubbelgelaagd plastic tape (genummerd als 3), die bereid was uit (B), werd gelegd op zowel basale spacers (1 en 2) om te vormen van een brug over de bloemknop, en tegelijkertijd niet te vangen de bast tussen tapes 1 en 2 op posities aangegeven met pijlen. (E) foto tonen de getapete honingklieren. Het is belangrijk niet te vangen plant weefsel rechtstreeks tussen de stukjes plastic tape op posities aangegeven met pijlen. (F) A klein stukje van chirurgische tape (genummerd als 4) werd zachtjes op het glasplaatje rond de tip van het blad blad geplakt. Alleen het gebied geschetst door de rode stippellijn werd stevig ingedrukt op het glasplaatje. (G) een ander klein stukje chirurgische tape (genummerd als 5) zachtjes op de grens van de bast en plastic tape stukjes geplakte. Alleen het gebied geschetst door de rode stippellijn werd ingedrukt voor de vaststelling van de bloemknop zachtjes op de dia glas en plastic tape stukjes. (H) twee Wegwerp pipet tips werden gebruikt om te voorkomen dat naburige bladeren bewegen in het gezichtsveld van de stereomicroscoop. De pipet tips werden direct in de bodem op juiste posities ingevoegd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3 : Vertegenwoordiger resultaten met behulp van de Arabidopsis blad montage methode. (A) fluorescerende stereomicroscopic beelden van een transgene Arabidopsis blad (pPR1-YFP-NLS plant). Een gedeelte van het blad was geïnfiltreerd met Pst_a2 (108 CFU/mL) op het abaxial oppervlak, en de beelden werden gevangen genomen op 22 uur post inoculatie (hpi). Kernen waarin de pPR1 promotor was geactiveerd werden gedetecteerd met behulp van de filter van de YFP en geprogrammeerde celdood (PCD) werd ontdekt op basis van het verlies van chlorofyl autofluorescence met behulp van de filter van de Texas Red (TXR). Schaal bar = 2,5 mm. (B) een paar time-lapse beelden geselecteerd uit een verzameling van 800 beelden verkregen met behulp van het protocol beschreven hier. Deze gegevens geven een in vivo -overzicht van de spatio dynamiek van pPR1 activiteit voor 40 hpi. Samengevoegde afbeeldingen van YFP en TXR beelden worden weergegeven. Schaal bar = 2,5 mm. (C) Mock infiltratie van een transgene blad (pPR1-YFP-NLS plant). In mock infiltratie, was 10 mM MgCl2 geïnfiltreerd in de abaxial kant van het blad, gevolgd door time-lapse imaging. Mock behandeling niet veroorzaakt door ectopische pPR1 activiteit en niet interfereren met chlorofyl autofluorescence op 13 hpi. Een pijl geeft de positie van mock infiltratie. Schaal bar = 2.5 mm. Deze beelden werden gewijzigd van een eerdere studie9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Tabel 1: Time-lapse imaging-programma in deze studie gebruikt.

figure-results-5
Aanvullende film 1: time-laps film toont de spatio dynamiek van pPR1 activering in een transgene Arabidopsis blad volgende effector geactiveerd immuniteit (ETI) geïnduceerd door Pst_a2 inoculatie. Een deel van de abaxial kant van een transgene blad uitvoering van de pPR1-YFP-NLS constructie was geïnfiltreerd met Pst_a2 (108 CFU/mL). Beelden werden verworven voor een totaal van 40 h tussenpozen 3-min. De tijdstempel weergegeven is in de indeling dd:hh:mm:ss.sss. Deze film werd vanaf een eerdere studie9gewijzigd. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussie

Wij rapporteren hier een eenvoudige methode om te monteren een levende Arabidopsis bladeren die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor van belang zijn voor de lange termijn observatie met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende stereomicroscoop. Time-lapse beeldvorming van een fluorescerende verslaggever is vaak uitgevoerd in wortel weefsels; echter, slechts een paar vergelijkbare studies zijn uitgevoerd in blad weefsels. Dit komt waarschijnlijk omdat de bladeren zijn kunnen vrij bewegen in de ruimte, overwegende dat wortels zijn vaak begraven en vastgesteld in solide agar medium.

In dit verslag, we gericht op de spatio dynamiek van pPR1 activiteit tijdens ETI geïnduceerd door Pst_a2. Naast de zachte fixatie van het blad hierboven is uiteengezet, is het belangrijk om duidelijk visualiseren de spatio dynamiek van cellulaire gebeurtenissen zoals de activering van de promotor en PCD. Als het onderscheid tussen cellen met pPR1 activiteit en PCD niet scherp is, zorg ervoor dat alle van de intercellulaire ruimten in het geïnfiltreerde gebied volledig zijn gevuld met de ziekteverwekker opschorting (zie stap 2.4). Dit is essentieel bij het gebruik van breed-gebied fluorescentie stereomicroscopes aangezien deze microscopen alle detecteerbare signalen langs de dezelfde verticale positie van het model vangen. Chlorofyl autofluorescence van overlevende cellen boven of onder de cellen in het domein van de PCD maskers gemakkelijk de dode cellen die geen autofluorescence vertonen. Dit geldt ook voor YFP signaal.

Voorwaarden voor time-lapse imaging moeten zorgvuldig worden vastgesteld door middel van verschillende voorbereidende experimenten onder verschillende experimentele omstandigheden. Parameters voor time-lapse imaging is afhankelijk van verschillende factoren zoals de microscopische systeem, transgene planten en ziekteverwekkers. Voor het verkrijgen van deze parameters, geanalyseerd wij eerst verschillende belichtingstijden voor YFP signaal intensiteit in het geïnfiltreerde blad op 7 hpi, die vrijwel samenvalt met de eerste activering van pPR1. Een 5 s blootstelling werd bepaald als geschikt voor het vastleggen van YFP signaal met de stereomicroscoop gebruikt in deze studie. Een gelijkaardige test werd uitgevoerd voor imaging-chlorofyl autofluorescence. Gasbedwelming met behulp van het proefstuk licht tussen 3 min intervallen was geprogrammeerd in de time-lapse imaging-programma als normale helder veld beeldbewerking met maximale blootstellingstijd. Ons systeem (Tabel van materialen) konden wij hebben 2,5 min naast YFP, TXR en heldere veld imaging. Deze beperking was de voornaamste reden voor het kiezen van een interval van 3 min. Volgende, we hebben bevestigd dat deze time-lapse voorwaarde geen zichtbare schade aan de plant monsters toegebracht, en niet ectopische lichte stressgerelateerde activering van pPR1 (Figuur 3B, C veroorzaken deed). Dit leidde tot de ontwikkeling van het programma in deze studie gebruikt. Zo 3-minuten intervallen voor fluorescentie imaging werden geacht tot voldoende voor het vastleggen van pPR1 dynamiek tijdens Pst_a2-gemedieerde ETI9.

Promotor-reporter constructies, hebben vooral met de fluorescerende verslaggever gesmolten aan de NLS, gebruikt door vele groepen, en zijn gemakkelijk beschikbaar uit de onderzoekswereld; We gebruikten de constructie geplaatst door Kubo et al. 13. dus het protocol hier beschreven kan worden gebruikt in elke plant biologie studie onderzoekt blad weefsels, als passende transgene planten beschikbaar zijn. Onze eenvoudige en gemakkelijke-protocol biedt een geweldige kans voor onderzoekers die erop gebrand zijn om het analyseren van de spatio dynamiek van alle biologische gebeurtenissen die zich voordoen bladeren, zoals immuunrespons. Het is aannemelijk dat onze methode met behulp van tape stukken een lichte fysieke spanning op de specimens induceert. Echter kan dit probleem worden gecontroleerd door passende positieve en negatieve controles, zoals mock behandelingen, waaronder in de experimenten (Figuur 3C). De experimentele omstandigheden kunnen verder worden gewijzigd en geoptimaliseerd door het analyseren van deze besturingselementen onder verschillende omstandigheden.

In de afgelopen jaren heeft de snelle ontwikkeling van beeldvormende instrumenten en technieken het belang van onderzoekers in de complexe Spatio aspecten van biologische gebeurtenissen gestimuleerd. In een analyse van beeldvorming behoren juiste montage- en vaststelling van specimens tot de belangrijkste kwesties. De eenvoudige en veelzijdig wijze van montage levende die Arabidopsis verlaat ontwikkeld in deze studie kan worden toegepast en geoptimaliseerd voor verschillende beeldvormende experimenten.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de Japan Science and Technology Agency [PRESTO117665 naar S.B., ERATOJPMJER1502 naar N.N.] en door de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (Grants-in-Aid voor onderzoek activiteit Start-up [22880008 naar S.B.] en voor jonge wetenschappers (B) [ 23780040 naar S.B.]). Wij danken Y. Suzuki, Y. Sugisawa, A. Senzaki en E. Betsuyaku voor uitstekende technische bijstand, J. Parker voor het verstrekken van de Pst_a2 stam, en T. Demura voor het verstrekken van de pBGYN-vector.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacto AgarBD biosciences214010
Bacto Protease Peptone No. 3BD biosciences211693
Bacto Yeast ExtractBD biosciences212750
BM2 soilBerger
Glycerolnacalai tesque17017-35
Kanamycin sulfateWako113-00343
Leica M205FA met DFC365FX, LED_MCI en Leica EL6000 (Las X software-gereguleerd)Leica MicrosystemsGele fluorescente eiwit (YFP) en Texas Red (TXR) filters geïnstalleerd
Magnesium Chloride HexahydrateWako135-00165
Micro Slide Glass (Grootte: 76 mm × 26 mm, Dikte: 1,0–1,2 mm)MATSUNAMIS1112
Micropore Surgical Tape (1,25 cm × 9 m)3M1530-0
Naaldloze 1 ml plastic spuitTerumoSS-01T
Kunststof celplug tray (celgrootte: 44 mm  × 44mm × 44 mm)Tanaka sangyo, Japanhtray-bk72Elke  tray met soortgelijke grootte cellen kan worden gebruikt
Rifampicinenacalai tesque30259-81
Kunststof tape (0,2 mm dik × 19 mm breed × 10 m lang)YamatoNo0200-19-1Elke kunststof/vinyl tape met  vergelijkbare dikte kan worden gebruikt

Referenties

  1. Tsuda, K., Somssich, I. E. Transcriptional networks in plant immunity. New Phytologist. 206 (3), 932-947 (2015).
  2. Mine, A., Sato, M., Tsuda, K. Toward a systems understanding of plant-microbe interactions. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  3. Murray, S. L., Thomson, C., Chini, A., Read, N. D., Loake, G. J. Characterization of a novel, defense-related Arabidopsis mutant, cir1, isolated by luciferase imaging. Molecular Plant-Microbe Interactions. 15 (6), 557-566 (2002).
  4. Spoel, S. H., Johnson, J. S., Dong, X. Regulation of tradeoffs between plant defenses against pathogens with different lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (47), 18842-18847 (2007).
  5. Asai, S., Shirasu, K. Plant cells under siege: plant immune system versus pathogen effectors. Current Opinion in Plant Biology. 28, 1-8 (2015).
  6. Schmelzer, E., Kruger-Lebus, S., Hahlbrock, K. Temporal and Spatial Patterns of Gene Expression around Sites of Attempted Fungal Infection in Parsley Leaves. The Plant Cell. 1 (10), 993-1001 (1989).
  7. Ohshima, M., Itoh, H., Matsuoka, M., Murakami, T., Ohashi, Y. Analysis of stress-induced or salicylic acid-induced expression of the pathogenesis-related 1a protein gene in transgenic tobacco. The Plant Cell. 2 (2), 95-106 (1990).
  8. Rushton, P. J., Reinstädler, A., Lipka, V., Lippok, B., Somssich, I. E. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. The Plant Cell. 14 (4), 749-762 (2002).
  9. Betsuyaku, S., et al. Salicylic Acid and Jasmonic Acid Pathways are Activated in Spatially Different Domains Around the Infection Site During Effector-Triggered Immunity in Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 59 (1), 8-16 (2018).
  10. Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nature Reviews Genetics. 11 (8), 539-548 (2010).
  11. Katagiri, F., Thilmony, R. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. , (2002).
  12. Zeier, J., Pink, B., Mueller, M. J., Berger, S. Light conditions influence specific defence responses in incompatible plant-pathogen interactions: uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation. Planta. 219 (4), 673-683 (2004).
  13. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes & Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

FluorescentiemicroscopieplantimmuniteitPR1 promotorYFP NLS expressiepathogenen inoculatiebladmontagespatiotemporele analysegenexpressie
Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.