Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59174

⸱

29 mei 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een in vivo immunisatie, translationeel hepatitismodel in BALB / c-muizen dat kan worden gebruikt om de pathogenese van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te bestuderen, inclusief geslachtsverschillen die bij deze ziekte worden waargenomen. We zullen beschrijven hoe dit model reproduceerbare analyses demonstreert met behulp van in vivo en in vitro experimentele technieken.

Samenvatting

Geneesmiddel-geïnduceerde auto-immune hepatitis (DIH) is het meest voorkomende hepatische geneesmiddel-geïnduceerde overgevoeligheidsproces waargenomen bij ongeveer 9 tot 12% van de patiënten met auto-immune hepatitis. De overgrote meerderheid van de patiënten met DIH zijn vrouwen. De onderliggende mechanismen van deze sekseverschillen in prevalentie zijn onduidelijk vanwege het gebrek aan diermodellen die menselijke ziekten nabootsen. Toch wordt algemeen aangenomen dat onderliggende mechanismen geassocieerd zijn met menselijke leukocytenantige haplotypen en geslachtshormonen. Daarentegen hebben we met behulp van een DIH-muismodel ontdekt dat IL-4 cd4 + T-cellen heeft geïnitieerd die gericht zijn tegen een epitoop van cytochroom P450 2E1 induceert instroom van neutrofielen, macrofagen en mestcellen in de levers van vrouwelijke BALB / c-muizen. Met behulp van dit model hebben we ook aangetoond dat IL-33-geïnduceerde FoxP3 + regulerende T-cellen bescherming bieden tegen DIH bij vrouwelijke en mannelijke muizen. Dit DIH-model wordt geïnduceerd door muizen te immuniseren met een epitoop van CYP2E1 dat covalent is veranderd met een medicijnmetaboliet die is geassocieerd met DIH. Deze epitoop wordt herkend door patiënten met DIH. Onze methode induceert robuuste en reproduceerbare hepatitis en auto-antilichamen die kunnen worden gebruikt om de pathogenese van DIH te bestuderen. Hoewel in vivo studies onnodige pijn en angst bij muizen kunnen veroorzaken wanneer ze onjuist worden uitgevoerd, is het voordeel van een in vivo model het vermogen om de pathogenese van ziekte bij een groot aantal muizen te evalueren. Bovendien kunnen biologische effecten van de veranderde levereiwitten worden bestudeerd met behulp van invasieve procedures. De toevoeging van in vitro studies aan het experimentele ontwerp maakt snelle herhaling en mechanistische analyse op cellulair niveau mogelijk. Zo zullen we ons modelprotocol demonstreren en hoe het kan worden gebruikt om in vivo en in vitro mechanismen van DIH te bestuderen.

Inleiding

Het doel van deze methode is om een muismodel van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te beschrijven dat zich in vivo ontwikkelt en aan te tonen hoe het kan worden gebruikt om de moleculaire, immunologische en genetische basis van deze ziekte te onderzoeken. Het langetermijndoel van onze studies is om mechanismen te ontdekken die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van chronische leverontsteking en -letsel door DIH bij gevoelige patiënten te bestuderen. Leverziekte en cirrose vormen de zesde meest voorkomende doodsoorzaak bij volwassenen tussen de 25 en 64 jaar. Idiosyncratische DILI, soms aangeduid als geneesmiddel-geïnduceerde auto-immune hepatitis (DIH) is de derde meest voorkomende oorzaak van acuut leverfalen in de Verenigde Staten. DIH is het meest voorkomende door levergeneesmiddelen geïnduceerde overgevoeligheidsproces dat wordt waargenomen bij ongeveer 9 tot 12% van de patiënten met auto-immune hepatitis1. De overgrote meerderheid van de patiënten met DIH zijn vrouwen 2,3,4. Een type DIH ontwikkelt zich bij gevoelige personen na toediening van gehalogeneerde vluchtige anesthetica zoals isofluraan, sevofluraan, desfluraan of halothaan. Deze anesthetica binden covalent aan levereiwitten met reactieve producten van hun metabolisme, waardoor nieuwe autoantigenen worden gecreëerd die allergische of auto-immuunreacties kunnen veroorzaken5.

De studie van pathogene mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van anestheticum en elke vorm van DIH is eerder belemmerd door het ontbreken van een diermodel dat de inductie van menselijke ziekten nauw nabootst. We hebben een experimenteel muizenmodel van DIH ontwikkeld met kenmerken die lijken op immuungemedieerde DILI bij patiënten. Hepatitis wordt geïnduceerd door immunisatie met een van de twee autoantigenen die covalent zijn gemodificeerd door de trifluoroacetylchloride (TFA) metaboliet die wordt gevormd na oxidatief metabolisme van het anestheticum door het enzym cytochroom P450 2E1 (CYP2E1)5. Eén autoantigeen is de hepatische cytosolische S100-leverfractie, een mengsel van verschillende eiwitten6, en het tweede autoantigeen is een epitoop van CYP2E1 dat wordt herkend door sera van patiënten met anesthetisch immuungemedieerd DILI7. Door BALB/c-muizen te gebruiken, die relatief resistent zijn tegen experimentele auto-immune hepatitis, onderscheiden we ons model van het S100-geïnduceerde immunisatiemodel van auto-immune hepatitis bij C57Bl/6J-muizen8.

Vanwege de diverse klinische presentaties is DIH moeilijk te bestuderen bij patiënten. Translationele experimentele modellen bieden de mogelijkheid om de pathogenese van ziekte in vivo en in vitro te evalueren. Op dit moment zijn er geen andere alternatieve methoden voor het induceren van DIH die in vivo of in vitro adaptieve of aangeboren immuunresponsen volledig onderzoeken zonder het gebruik van dieren. Bovendien, aangezien trifluoroacetylering van S-100 of het CYP2E1-epitoop geen irriterend immunogeen lijkt te produceren, en we DIH induceren door immunisatie met TFA-veranderde eiwitten, zullen deze dieren geen ether, gehalogeneerde verdoving, barbituraat of alcohol ontvangen voorafgaand aan immunisatie of andere procedures, aangezien deze middelen de parameters die we bestuderen kunnen veranderen. Toch hebben we ons muisgebruik verminderd door computersimulatie te gebruiken om de bindingsvoorkeuren van ons ontdekte CYP2E1-epitoop9 te bevestigen en hebben we menselijke DIH gespiegeld die vrouwelijk geslacht impliceert door aan te tonen dat vrouwelijke BALB / c-muizen een ernstiger DIH10 ontwikkelen.

Ondanks diverse presentaties van DIH bij patiënten en uitdagingen in de studie van klinische ziekten, is posttranslationele modificatie van inheemse eiwitten door reactieve geneesmiddelmetabolieten een geaccepteerd sleutelmechanisme in de pathogenese DIH die volgt op gehalogeneerde anesthetica11. Onderzoekers accepteren ook dat CYP2E1 een belangrijk autoantigeen is in dit proces 12,13. De rol van interleukine (IL)-4-upregulated CD4+T-cellen die een posttranslationeel gemodificeerd CYP2E1 en andere levereiwitten herkennen, is een geaccepteerde initiator van anesthetisch DIH door neutrofielen, eosinofielen en mestcellen in de lever aan te trekken14, en dit mechanisme is bevestigd in vele vormen van DIH15,16. Geïnduceerde FoxP3-expresserende CD4+CD25+T-cellen (Tregs) verminderen de ernst van DIH, en relatieve tekortkomingen van deze cellen in de milt verergeren DIH 10,7. De meeste vooruitgang in het begrijpen van DIH is dus mogelijk gemaakt door gebruik te maken van in vivo muismodellen om de genetische, metabole en immunologische mechanismen van DIH zowel in vivo als in vitro te evalueren.

Omdat wij en andere onderzoekers rollen hebben ontdekt voor IL-4, neutrofielen en eosinofielen bij het initiëren van DIH met behulp van verschillende muismodellen, geloven we dat deze observatie onze bewering ondersteunt dat ongeacht het gebruikte DIH-model, hepatitis en letsel worden geïnduceerd door IL-4. De kracht van ons protocol ligt in het gebruik van in vivo methodologie, zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, en herhaling van histologie, CD4 + T-celproliferatietests en cytokines. De kracht van ons gebruik van in vitro studies is dat ze het aantal muizen verminderen dat nodig is, terwijl ze de methodologie bieden om cellulaire interacties te isoleren die DIH aansturen. We raden het gebruik van mannelijke en vrouwelijke muizen aan omdat dit de kans op onbewuste vooroordelen bij de interpretatie van resultaten vermindert en het vertaalpotentieel van onze studies versterkt, omdat de incidentie, prevalentie en ernst van DIH hoger is bij vrouwen17. We raden aan dat muizen worden verkregen van één leverancier; als dit echter niet mogelijk is, verkrijg dan nestgenootcontroles of wildtypemuizen van dezelfde leverancier als de genetisch veranderde muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de commissie voor dierenverzorging en -gebruik.

1. Trifluoroacetylering van hepatische S-100 cytosolische eiwitten of een CYP2E1-epitoop

OPMERKING: Bereid eerst de trifluoroacetylated S100 (TFA-S100) en trifluoroacetylated CYP2E1 epitoop (TFA-JHDN5). Omdat syngene S100-eiwitten nodig zijn voor immunisaties en BALB / c-muizen nodig zijn om het immunogeen te produceren. Het preparaat levert een grote hoeveelheid immunogeen op; dus verwacht dit deel ongeveer vier keer per jaar uit te voeren. Een identieke methode zal worden gebruikt om de TFA-JHDN5 te maken. Het CYP2E1-epitoop (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, kan worden gesequenced of gekocht.

  1. Isolatie van de S100-fractie van de lever.
    1. Na sedatie van 5 - 10 BALB / c muizen met 40-60 mg / kg ketamine gemengd met 4 - 6 mg / kg xylazine, bevestigt u de juiste diepte van de anesthesie door een vermindering van de spiertonus waar te nemen en geen reactie op pijnlijke stimuli, zoals een teenknijper (ontwenningsreflex), naast het verlies van rechtzettingsreflexen en het verlies van palpebrale reflexen.
    2. Gebruik een microchirurgische schaar om de intra-abdominale inhoud bloot te leggen met behulp van een middellijnincisie en maak een kleine snee in de inferieure vena cava om het bloed te verwijderen.
    3. Plaats een 24-gauge angiocatheter in de poortader en perfuseer de lever 10 ml / min met 40 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 in een waterbad bij 4 ° C. Verwijder en weeg de samengevoegde levers en snijd deze in kleine stukjes (10 – 15 mm).
      OPMERKING: Euthanasie wordt geïnduceerd door intraperitoneale injectie van extra ketamine/xylazine (80 mg/kg: 8 mg/kg), gevolgd door cervicale dislocatie en het openen van de borstholte om de longen in te klappen. Deze methode zorgt voor de minste pijn en ongemak voor de dieren. Deze methode is in overeenstemming met de aanbevelingen van het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association.
    4. Voeg 4 keer het gewicht van sucrose (250 mM) -TRIS (10 mM) - EDTA (1 mM) homogenisatiebuffer (pH 7,4) aangevuld met Complete Protease inhibitor Cocktailtabletten (zie Tabel van materialen) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Homogeniseer in een polypropyleenbuis van 15 ml, met behulp van een algemene laboratoriumweefselhomogenisator op gemiddelde snelheid op ijs tot een gladde massa. Homogeniseer op ijs om te voorkomen dat het weefsel warm wordt tijdens het homogeniseren.
    5. Centrifugeer de lever homogenaten bij 1500 x g gedurende 10 minuten en giet vervolgens het supernatant af. Centrifugeer het supernatant gedurende 1 uur bij 100.000 x g. Vries het supernatant vast en bewaar het bij -80 °C. Het supernatant is cytosolisch S-100.
  2. Trifluorediëring van S100 en JHDN5
    OPMERKING: Trifluoroacetylering van de ε-aminogroepen van lysineresiduen van S-100 zal worden uitgevoerd volgens de procedure van Satoh18. Alle delen van dit experiment, met uitzondering van de laatste dagen van dialyse, worden uitgevoerd in de zuurkast.
    1. Bepaal de totale eiwitconcentratie van de cytosolische S-100 met behulp van de bicinchonininezuurtest (BCA-assay)7. Verdun 20 mg BALB/c muis S100 of JHDN5 tot 10 ml met dH2O in een Erlenmeyer van 50 ml. Stel de pH in op 10 met 1N KOH.
    2. Voeg 4,7 mmole S-ethyltrifluorioacetaat (S-ETFA) toe aan de oplossing. Houd de pH tussen 9,9 - 10,0 met 1N KOH door KOH ongeveer 1 uur op druppelvorm toe te dienen. Noteer het totale volume KOH voor elke reactie.
    3. Breng de oplossingen over in afzonderlijke dialysecassettes (niet overvullen). Dialyseer de cassettes gedurende 72 uur tegen 4 L dH2O met drie veranderingen per dag. Noteer na dialyse het uiteindelijke volume van TFA-S100 of TFA-JHDN5 en vervolgens aliquot in gelabelde buizen. Snap vries in en bewaar bij –80 °C.
    4. Een geschatte concentratie wordt bepaald door de initiële hoeveelheid S100 of JHDN5 (in mg) te delen door het uiteindelijke volume na dialyse (ml). Om de procentuele modificatie van het inheemse eiwit19 te bepalen, verdunt u 1,0 mg van elk inheems en TFA-veranderd eiwit (als de uiteindelijke concentratie groter is dan 1,0 mg) tot 1,0 ml met dH2O in afzonderlijke kogelbuizen en bereidt u een blanco met behulp van 1,0 ml dH2O. Als de concentratie van het TFA-veranderde eiwit lager is dan 1,0 mg, verdun dan niet
      1. Om putten van een 96 putplaat te scheiden, voegt u 50 μL van de lege, inheemse en veranderde eiwitten toe. Voeg 50 μL van 4% NaHCO3 gevolgd door 50 μL van 0,1% 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur toe aan elk putje.
      2. Incubeer de plaat bij 40 °C gedurende 2 uur. Voeg na de incubatie 50 μL 10 % SDS toe aan elke put, gevolgd door 25 μL 1N HCl.
      3. Lees af bij OD van 334 nm en registreer vervolgens de absorptie van elke verbinding van 200 - 600 nm om de karakteristieke daling van de absorptie bij 334 nm te bevestigen. Bereken de procentuele modificatie van lysineresiduen door TFA, met behulp van de volgende formule:
        figure-protocol-1

2. Immunisatie van muizen om hepatitis te induceren

OPMERKING: DIH wordt gemodelleerd in BALB /c-muizen door immunisaties met levercytosolische eiwitten die covalent zijn veranderd door trifluoracetylchloride (TFA), een modelgeneesmiddelmetaboliet, TFA-S1006 of een epitoop van CYP2E1 covalent veranderd door TFA9, TFA-JHDN5 dat hepatitis, autoreactieve T-cellen en CYP2E1-autoantilichamen induceert. Muizen vertonen een miltactiveringsfase 2 weken na de eerste immunisatie en een leverfase van 3 weken die wordt gekenmerkt door granulocytische ontsteking. Vrouwelijke BALB/c muizen zijn in dit model gevoeliger dan mannen voor hepatitis.

  1. Immuniseer op dag 0 6-8 weken oude BALB / c-muizen subcutaan aan de basis van de nek met 200 μg TFA-S100 of 100 μg TFA-JHDN5 geëmulgeerd in gelijke volumes van volledig Freund's adjuvans (CFA). Immuniseer de muizen op dag 0 met 50 ng kinkhoesttoxine, intramusculair in een van de achterpoten. Immuniseer de muizen op dag 7 subcutaan aan de basis van de staart met 200 μg TFA-S100 of 100 μg TFA-JHDN5 geëmulgeerd in gelijke volumes CFA om ervoor te zorgen dat elke muis twee injecties van hetzelfde immunogeen ontvangt.
    OPMERKING: De muizen worden de eerste 6 uur na de immunisatie elk uur gecontroleerd en vervolgens gedurende een week ten minste tweemaal daags. Als de muizen tekenen van pijn of angst vertonen, zoals een gebogen houding of gegolfde vacht, moeten pijnstillers worden toegediend in overeenstemming met de lokale ACUC. Als aanzienlijke pijn of angst wordt opgemerkt, moeten de muizen worden geëvalueerd door een dierenarts om te bepalen of euthanasie noodzakelijk is.
  2. Bepaling van cd4+ T-cel immuunresponsen op hele zelfeiwitten, epitopen van zelfeiwitten of de TFA hapten met behulp van flowcytometrie
    1. Na sedatie van muizen met 40-60 mg/kg ketamine gemengd met 4-6 mg/kg xylazine via intraperitoneale injectie, bevestigt u de juiste diepte van de anesthesie zoals beschreven in stap 1.1.1 en identificeert u vervolgens de milt na blootstelling van de intra-abdominale holte met behulp van een microchirurgische schaar. Snijd de milt bij de pedikel en plaats in een petrischaaltje met PBS/2% foetaal kalfsserum (FCS).
      OPMERKING: Euthanasie zal bij de muizen worden geïnduceerd door intraperitoneale injectie van extra ketamine/xylazine (80 mg/kg: 8 mg/kg), gevolgd door cervicale dislocatie en het openen van de borstholte om de longen in te klappen. Deze methode zorgt voor de minste pijn en ongemak voor de dieren. Deze methode is in overeenstemming met de aanbevelingen van het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association.
    2. Laat de cellen los met behulp van matglasglaasjes en breng over naar een conische polypropyleenbuis van 50 ml. Wassen met PBS/2% FCS door het volume op 50 ml te brengen en te centrifugeren op 335 x g met behulp van een gekoelde centrifuge op tafel. Giet het supernatant af en herhaal deze stap.
    3. Verwijder de rode bloedcellen met behulp van 1 ml ACK Lysing buffer gedurende 1 min en breng het volume op 50 ml met PBS/2% FCS. Centrifugeer bij 335 x g en giet het supernatant af.
    4. Tel de cellen. Label de cellen met CFSE gedurende 30 minuten op ijs in het donker, volgens de instructies van de fabrikant. Hang eencellige suspensies in 6 putplaten van 3x106 cellen / ml per put in PBS / 2% FCS.
    5. Stimuleer gelabelde cellen met CYP2E1, JHDN5 of TFA-OVA (10 μg/ml) gedurende 72 uur bij 37 °C in 5% CO2, 95% lucht (bevochtigd). Na incubatie kleurt u de cellen met CD4-APC (1:100) gedurende 30 minuten op ijs en analyseert u binnen 3 dagen met flowcytometrie.
    6. Gebruik de volgende gatingstrategie om CD4+CFSE+-cellen te identificeren: CD4+CVSE+-cellen zullen worden geïdentificeerd uit de gated alive cellen en worden weergegeven als histogrammen van prolifererende cellen.
  3. Isolatie van infiltrerende immuuncellen van geïmmuniseerde muizen.
    1. Om infiltrerende immuuncellen in de levers te isoleren op dag 14 of dag 21, verdooft u de muizen door intraperitoneale injectie met 40-60 mg / kg ketamine gemengd met 4-6 mg / kg xylazine en bevestigt u de juiste diepte van de anesthesie zoals beschreven in stap 1.1.1. Na laparotomie met behulp van een middellijnincisie gemaakt met een microchirurgische schaar zoals beschreven in 1.1.2, kan de poortader worden gecanneerd met een naald van 25 gauge en vervolgens de inferieure vena cava onder de nieraderen worden gesneden.
    2. Perfuseer elke lever met een stroomsnelheid van 10 ml / min met 40 ml PBS in een waterbad van 37 ° C. Na perfusie, met behulp van een micro-chirurgische schaar, knip de lever bij de lever pedikel, verwijder de galblaas en snijd vervolgens de lever bij het hilum.
    3. Verstoor de lever op een mesh roestvrijstalen zeef met behulp van een steriele spuit stamper van 20 ml en koude PBS. Filter de resulterende celsuspensie in 50 ml voorgesteriliseerde centrifugebuizen met behulp van een scherm met 300 mazen. Breng elke suspensie op 50 ml met koude PBS en was de suspensie vervolgens door centrifugeren gedurende 10 minuten op 370 x g.
    4. Gooi het supernatant weg en voeg vervolgens elke pellet door behandeling toe in nieuwe buizen van 50 ml (één buis per muis wordt aanbevolen; als monsters echter worden samengevoegd, wordt 2-4 pellets / buis aanbevolen). Hang de gepoolde pellets op in 45 ml Percoll 35% (in PBS) en 100 IE / ml heparine.
    5. Draai elke buis op 500 x g gedurende 10 min bij 20 °C. Gooi het supernatant weg en hang de pellet in 5 ml PBS en voeg vervolgens 1 ml ACK-ligbuffer toe aan elke pellet gedurende 10 minuten op ijs.
    6. Breng elke tube op 50 ml met PBS en was door centrifugeren gedurende 10 minuten op 370 x g. Gooi het supernatant weg en was de cellen vervolgens met PBS/2% FCS door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 370 x g. Tel de cellen.
    7. Analyse van het celtype met behulp van flowcytometrie
      OPMERKING: Hier is een voorbeeld van hoe geïnduceerde Foxp3 + Tregs kan worden gedetecteerd.
      1. Incubeer 1x106 cellen met FcR blokkerend reagens en kleuring met 1:100 verdunningen van CD4-FITC, CD25-PE en CD45-PerCP gedurende 30 minuten op ijs. Kleur vervolgens de cellen intracellulair met FoxP3-APC.
      2. Fixeer de cellen met 250 μL fixatiebuffer (zie Materiaaltabel) en bewaar bij 4 °C tot analyse door flowcytometrie binnen 3 dagen.
      3. De volgende gatingstrategie wordt aanbevolen om geïnduceerde Foxp3 + Tregs in eencellige suspensies van lever-, milt- of lymfeklieren te detecteren met behulp van flowcytometrie: Identificeer levende cellen met behulp van Live / Dead Fixable Aqua Dead Cell-vlekkit. Vervolgens gate op levercellen die CD45+ zijn (PerCP, kloon RA3-6B2) en gate CD4+ cellen (FITC, cloneGK1.5) van de CD45+ gate. Identificeer vanuit de CD4+ cellen de percentages cd25+(PE,klonen 7D4) en FoxP3+ (APC, kloon 3G3) cellen.
  4. Histologische analyse van leverweefsels voor hepatitis
    1. Fixeer op dag 21 de leversecties (5 μm dik) in 10% neutraal gebufferd formaline en vlek met Hematoxyline &Eosine.
    2. Bepaal eerst histologiescores bij laag vermogen (40X) in een gemiddelde van 2 weergaven en bevestig op 64X. Scoor de weefselsecties als volgt: Graad 0 = geen ontsteking of necrose; Graad 1= lichte lobulaire ontsteking zonder necrose; Graad 2= lobulaire ontsteking waarbij < 50% van de sectie betrokken is; Graad 3=lobulaire ontsteking waarbij ≥ 50% van de sectie betrokken is; en graad 4 =ontsteking met necrose.
  5. Bepaling van weefselcytokineniveaus in milten en levers.
    1. Homogeniseer op dag 14 of dag 21 de lever- of miltmonsters (1 g) van elke muis in 1 ml RPMI / 2% FCS totdat deze glad zijn met behulp van een algemene laboratoriumhomogenisator op mediuminstelling. Houd het monster koud op ijs.
    2. Centrifugeer het homogenaat gedurende 15 minuten bij 1455 x g bij 4 °C met behulp van een gekoelde desktopcentrifuge. Vries het supernatant in en bewaar het bij -80 °C tot het klaar is voor gebruik. Cytokine- en chemokineniveaus kunnen worden gemeten met commerciële ELISA-kits, volgens de instructies van de kit. Standaardiseer de niveaus van cytokines door de niveaus (in ml of μL) om te zetten in pg / g weefsel.
  6. Detectie van serumantistoffen tegen CYP2E1, het CYP2E1-epitoop JHDN5 en de TFA-medicijnmetaboliet.
    1. Op dag 14 of 21, verdoof de muizen met 40-60 mg / kg ketamine gemengd met 4-6 mg / kg xylazine. Bevestig de juiste diepte van de anesthesie door een vermindering van de spiertonus te observeren en geen reactie op pijnlijke stimuli, zoals een teenknijper (ontwenningsreflex), naast het verlies van rechtzettingsreflexen en het verlies van palpebrale reflexen. Gebruik een naald van 25 G die aan een tuberculinespuit is bevestigd en benader het hart door de naald langzaam in de thoracale holte onder de ribben te brengen en onmiddellijk lateraal naar het xiphoid-proces. Verzamel bloed met behulp van intracardiale punctie.
    2. Zodra bloed is verzameld, laat het stollen bij kamertemperatuur. Centrifugeer de bloedmonsters bij 295 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de sera, aliquot de sera en knap invriezen bij -20 °C.
    3. Breng 100 μL CYP2E1, JHDN5 of TFA-ovalbumine (OVA) testantigenen (5 μg/ml in PBS) aan op 96 putplaten gedurende ten minste 18 uur bij 4 °C 's nachts. Was de volgende dag de platen met wasbuffer (PBS/2%FCS), 2 cycli (elk 4 wasbeurten).
    4. Breng 100 μL muizensera (1:100) in PBS/2% FCS in drievoud aan op de platen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Was de platen na 2 uur met wasbuffer zoals beschreven in stap 2.6.2.
    5. Voeg 100 μL alkalische fosfatase (AKP)-geitenantimuis IgG, AKP-rat antimuis IgG1 of AKP-rat antimuis IgG2a secundaire antilichamen (1:1000) toe gedurende 2 uur gevolgd door een wasstap van 1 cyclus met wasbuffer en 1 cyclus met PBS. Detecteer de antilichamen met behulp van een AKP-substraatkit en meet elke 15 minuten bij OD 405 nm met een spectrofotometer. TFA ontwikkelt zich meestal volledig in 15 minuten, terwijl CYP2E1 en het CYP2E1-epitoop zich kunnen ontwikkelen van 30 tot 60 min7.
  7. Studies van de ontwikkeling van JHDN5 IgG-geïnduceerde oxidatieve stress in vitro.
    1. Incubeer met behulp van 12 putplaten 106 terminaal gedifferentieerde levercellen per put op met fibronectine bedekte afdekslips in 1000 μL Williams E-media aangevuld met glutamine en algemeen supplement (zie materiaaltabel) bij 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid gedurende 7 dagen zoals aanbevolen om de CYP2E1-activiteit te maximaliseren.
    2. Voeg JHDN5 IgG (1:40) of muis IgG (1:1000) toe aan afzonderlijke putten en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid. Hybridoma sera was zeer verdund. Voeg dieprood fluorescerend antilichaamdetector (zie materiaaltabel) gedurende nog eens 30 minuten toe aan alle putten.
    3. Was de putjes 3x met 1 ml PBS in het donker. Bevestig de cellen in 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten. Onderzoek met confocale microscopie binnen 24 uur.
  8. Colokalisatiestudies van JHDN5 IgG met intracellulaire organellen zoals mitochondriën in vitro.
    1. Om co-lokalisatie van JHDN5 IgG met mitochondriën aan te tonen, culminerend gekweekte (~ 30% confluentie) terminaal gedifferentieerde levercellen op met fibronectine bedekte dekkingsslips gedurende 7 dagen in kleurstofvrije Williams media E aangevuld zoals beschreven in stap 2.7.
    2. Voeg na het bepalen van de juiste absorptiegolflengten groene fluorescerende, 488 nm -geconjugeerde muis IgG of JHDN-5 (1:100) en rood fluorescerende, 594-geconjugeerde Mito-tracker Rood (1:100) toe gedurende 2 uur (37 °C), 5% CO2, 95% vochtigheid.
    3. Monteer gelabelde fibronectine-bedekte afdekslips met Anti-fade Reagens met DAPI en onderzoek met confocale microscopie.

3. Algemene protocolnota's

  1. Gebruik niet-farmaceutische hulpmiddelen wanneer verbindingen niet beschikbaar zijn in een formulering voor klinisch gebruik. Verkrijg echter elk van deze tools van betrouwbare commerciële leveranciers die in deze methode worden geïdentificeerd. Gebruik altijd chemische stoffen die voldoen aan de specificaties die zijn vastgesteld door het Committee on Analytical Reagents van de American Chemical Society van ten minste het reagenskwaliteitsniveau. Gebruik voor onze methoden waar mogelijk reagentia op analytisch niveau.
  2. Volg een strikte aseptische techniek voor de formulering van de TFA-veranderde eiwitten om besmetting te voorkomen die het dierenwelzijn of de interpretatie van gegevens nadelig zou kunnen beïnvloeden.
  3. Bewaar en gebruik formuleringen van niet-farmaceutische kwaliteit bij duur waarvoor de formulering krachtig zal blijven, volgens de beschikbare technische informatie. Bewaar CFA bij kamertemperatuur, CYP2E1 en zijn epitopen bij -20 of -80 °C. Bewaar TFA-veranderde eiwitten bij -80 °C en laat tot 4 °C komen voorafgaand aan emulgering met CFA. Bewaar TFA-veranderde eiwitten bij -80 °C en bewaar in aliquots om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het immunisatieschema dat wordt gebruikt om DIH te induceren, weergegeven in figuur 1 , vertegenwoordigt de twee immunisaties die nodig zijn aan de basis van de nek (dag 0) en de basis van de staart (dag 7). Figuur 2 toont representatieve proliferatiegegevens verkregen op dag 14 met behulp van CVSE als reactie op CYP2E1, JHDN5, het CYP2E1-epitoop en de trifluoroacetyl (TFA) metaboliet van de anesthetica. Figuur 3 toont de gatingstra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De kracht van dit protocol ligt in de reproduceerbaarheid; het is dus van cruciaal belang om zich aan de voorgestelde stappen te houden. Formulering van het immunogeen kan voor sommigen een barrière zijn; we hebben ons model echter gereproduceerd met behulp van het epitoop dat in ons document wordt beschreven, waardoor de noodzaak om de S100-fractie van de lever te isoleren, wordt weggenomen. Het is waarschijnlijk dat extra epitopen of eiwitten kunnen worden veranderd en hepatitis kunnen induceren na immunisaties; we bes...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dr. Njoku wil graag Dr. Noel R. Rose, MD PhD, bedanken voor zijn begeleiding en inzichtelijke discussies die hebben geresulteerd in de formulering van dit model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1% 2,4,6-trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS)ThermoFisher28997
AKP Substraat KitBioRad172-1063
BALB/c muizenJackson
CellTrace™ CFSE Cel Proliferatie KitThermoFisherC34554
CFA H37RaBecton Dickinson (Difco Bacto)231131
FcR Blokkerend reagensMilteyi130-092-575
Algemeen supplementThermoFisherHPRG770
HepaRG™ cellen cryogepreserveerdThermoFisherHPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kitThermoFisherL34965
NaHCO3Millipore SigmaS5761
Percoll®Millipore SigmaP1644-1L
Pertussis ToxineList Biologicals180
Fosfaat Buffered Saline pH 7.4Verschillende
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tabletten, EDTA VrijThermoFisher88666
Kalium HydroxideJT Baker3140-01
S-ethyltrifluorthioacetaat (S-ETFA)Millipore Sigma177474
Slide-a-lyzer dialyse cassettes (10 K, 12 ml)ThermoFisher66810
UltraPure™ SDS Oplossing, 10%ThermoFisher24730020
Williams Media E, geen fenol roodThermoFisherA1217601

Referenties

  1. Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
  2. Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
  3. Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
  4. Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
  5. Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
  6. Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
  7. Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
  8. Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
  9. McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
  10. Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).
  11. Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
  12. Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
  13. Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
  14. Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
  15. Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
  16. Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
  18. Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
  19. Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
  20. Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
  21. Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cytochroom P450 2E1flowcytometrieleverperfusieisolatie van miltcellentrifluoracetyleringimmunisatieprotocolhepatitisanalysesekseverschillen
Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.