Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Samenvatting

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan > 1000 TFs in een enkele experiment.

Samenvatting

Het identificeren van de sets van transcriptiefactoren (TFs) die regelen van elk menselijk gen is een enorme taak die vereist integratie van talrijke experimentele en computationele benaderingen. Een dergelijke methode is de gist één-hybride (Y1H) assay, in welke interacties tussen TFs en DNA regio's worden getest in de omgeving van de kern van de gist met behulp van verslaggever genen. Y1H tests omvatten twee componenten: een 'DNA-aas' (b.v.., initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een 'TF-prooi,"die kan worden gescreend voor reporter gene activering. Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H schermen zijn gebaseerd op het omzetten van TF-prooi bibliotheken of arrays in DNA-aas giststammen. Hier beschrijven we een pijpleiding, verbeterde Y1H genoemd (eY1H) testen, waar TF-DNA interacties zijn ondervraagd door de paring van de DNA-aas stammen met een gekleed verzameling TF-prooi stammen met behulp van een array met hoge dichtheid (HDA) robotic platform waarmee screening in een 1,536 de indeling van de kolonie. Dit zorgt voor een dramatische toename van de doorvoer (60 opeenvolgingen van DNA-aas tegen > 1.000 TFs duurt twee weken per onderzoeker) en reproduceerbaarheid. We illustreren de verschillende soorten van de verwachte resultaten door het testen van sequenties van menselijke promotor tegen een array van 1,086 menselijke TFs, evenals voorbeelden van problemen die zich kunnen voordoen tijdens de schermen en het oplossen van hen.

Inleiding

Een centraal probleem op het gebied van biomedische is het bepalen van de mechanismen waarmee elk menselijk gen wordt geregeld. Transcriptie is de eerste stap bij het beheersen van gen expressie niveaus, en het is geregeld door sets van transcriptiefactoren (TFs) die uniek voor elk gen zijn. Gezien het feit dat mensen coderen voor > 1500 TFs^1,2, identificatie van de complete set van TFs waarmee de expressie van elk gen blijft een open uitdaging.

Twee soorten methoden kunnen worden gebruikt voor het toewijzen van TF-DNA interacties: TF-gecentreerd en DNA-gecentreerd methode

Protocol

1. voorbereiding

1. SC −U −H platen (petrischalen 150 mm)
   Opmerking: Deze platen worden gebruikt voor de teelt van de DNA-aas giststammen.
   1. Los van de drop-out mix, gist stikstof base (YNB), adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 920 mL water en pH tot 5,9 met 5 M NaOH (ongeveer 1 mL per liter media; Zie tabel 2 voor samenstelling). Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.
   2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
   3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 ....

Resultaten

Drie belangrijke factoren moeten worden beschouwd wanneer analyseren van resultaten van eY1H assays: de achtergrond verslaggever activiteit van de DNA-aas-stam, de sterkte van de activiteit van de verslaggever overeenkomt met TF-DNA interacties, en het aantal positieve kolonies. De achtergrond verslaggever activiteit (bijvoorbeeld autoactivity) van de DNA-aas stam verwijst naar de algemene groei en kleur van de kolonies van de gist in de uitlezing plaat, zelfs in de afwezigheid van een TF-prooi. Ideaal, niet-autoactive s.......

Discussie

De robotic eY1H paring screening beschreven aanpak hier sterk verhoogt de doorvoer ter identificatie van de set van TFs die zich aan een DNA-regio van belang binden, in vergelijking met vorige bibliotheek screening of gekleed screening benaderingen gebaseerd op transformatie. Verder, de TF-DNA-interacties die zijn gedetecteerd door eY1H testen zeer reproduceerbaar, zijn 90% van interacties genotypes zijn positief voor alle vier kolonies per TF getest, en 90% van interacties opnieuw testen in een onafhankelijke scherm van.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-Amino-1,2,4-triazool (3AT) ~95 % TLC	Sigma	A8056-100G	Competitieve remmer voor producten van HIS3-gen
Adenine sulfaat (hemisulfaat), dihydraat	US Biologicals	A0865	Vereist voor goede gistgroei
Agar High Gel Strength - Bacteriologisch kwaliteit	American International Chemical	AGHGUP	Voedingsmedium voor gistgroei
Ammoniumsulfaat	US Biologicals	A1450	Stikstofbron in synthetisch gistmedium
D+ Glucose Anhydrous	US Biologicals	G3050	Vereist voor gistgroei
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp en Uracil, adenine rijk zonder giststikstofbase	US Biologicals	D9540-02	Synthetisch compleet medium vereist voor gistgroei
Edge Multiparameter pH Meter	Hanna Instruments	HI2020-01	Om de pH van selectief medium te meten
Flat Toothpicks 750 ct	Diamond		Om gisten op petrischalen uit te zaaien
Glaspebbeltjes	Walter Stern	100C	Om gist te verspreiden bij het maken van lawn
Glycerol ≥99%	Millipore Sigma	G9012-1L	Vereist om bevroren giststammen te maken
L-Histidine	US Biologicals	H5100	Voor gistgroeiselectie in selectief medium
L-Leucine	US Biologicals	L2020-05	Voor gistgroeiselectie in selectief medium
L-Tryptophane	Sigma	T-0254	Voor gistgroeiselectie in selectief medium
N,N-Dimethylformamide	Sigma	319937-1L	Om X-gal oplossing te maken
Omnipense Elite	Wheaton	W375030-A	Voor het doseren van nauwkeurige volumes medium in Singer platen
Peptone, Bacteriologisch	American International Chemical	PEBAUP	Eiwitbron vereist voor gistgroei
Petrischaal, 150 mm x15 mm	VWR	10753-950	Voor het kweken van gistlokaas voor screening
PlusPlates	Singer Instruments	PLU-003	Om rechthoekige agar platen te maken voor gebruik met Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Gekoelde Incubator	ThermoFisher Scientific	PR205745R	Om gistplaten op constante temperatuur te incuberen
RePads 1,536 kort	Singer Instruments	REP-005	Om de TF-prey array over te brengen, gist te mengen en gist over te brengen naar diploïde selectie- en uitleesplaten
RePads 384 kort	Singer Instruments	REP-004	Om TF-prey array over te brengen van 384 naar 1,536 kolonie formaat
RePads 96 lang	Singer Instruments	REP-001	Om TF-prey array over te brengen van glycerol stock naar agar plaat
RePads 96 kort	Singer Instruments	REP-002	Om TF-prey array over te brengen van 96 naar 384 kolonie formaat
Singer HDA RoToR robot	Singer Instruments		Voor het overbrengen van gist op hoog-doorvoer wijze
Natriumhydroxide (Pellets/Certified ACS)	Fisher	S318-1	Voor het aanpassen van de pH van selectief medium
Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat	Santa Cruz Biotechnology	sc-203402C	Vereist voor LacZ reporter activiteit op X-gal
Natriumfosfaat monobasisch monohydraat	Santa Cruz Biotechnology	sc-202342B	Vereist voor LacZ reporter activiteit op X-gal
Uracil	Sigma	U0750-100G	Voor gistgroeiselectie in selectief medium
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranosid)	Gold Biotechnology	X4281C100	β-galactosidase maakt kleurloos X-gal blauw om eiwit-DNA interactie te detecteren
Gist Extract	US Biologicals	Y2010	Voedzaam medium voor groei en vermeerdering van gist
Gist Stikstof Base (poeder) zonder AA, koolhydraat en zonder AS	US Biologicals	Y2030	Vereist voor krachtige gistgroei