Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59192

⸱

11 februari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan > 1000 TFs in een enkele experiment.

Samenvatting

Het identificeren van de sets van transcriptiefactoren (TFs) die regelen van elk menselijk gen is een enorme taak die vereist integratie van talrijke experimentele en computationele benaderingen. Een dergelijke methode is de gist één-hybride (Y1H) assay, in welke interacties tussen TFs en DNA regio's worden getest in de omgeving van de kern van de gist met behulp van verslaggever genen. Y1H tests omvatten twee componenten: een 'DNA-aas' (b.v.., initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een 'TF-prooi,"die kan worden gescreend voor reporter gene activering. Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H schermen zijn gebaseerd op het omzetten van TF-prooi bibliotheken of arrays in DNA-aas giststammen. Hier beschrijven we een pijpleiding, verbeterde Y1H genoemd (eY1H) testen, waar TF-DNA interacties zijn ondervraagd door de paring van de DNA-aas stammen met een gekleed verzameling TF-prooi stammen met behulp van een array met hoge dichtheid (HDA) robotic platform waarmee screening in een 1,536 de indeling van de kolonie. Dit zorgt voor een dramatische toename van de doorvoer (60 opeenvolgingen van DNA-aas tegen > 1.000 TFs duurt twee weken per onderzoeker) en reproduceerbaarheid. We illustreren de verschillende soorten van de verwachte resultaten door het testen van sequenties van menselijke promotor tegen een array van 1,086 menselijke TFs, evenals voorbeelden van problemen die zich kunnen voordoen tijdens de schermen en het oplossen van hen.

Inleiding

Een centraal probleem op het gebied van biomedische is het bepalen van de mechanismen waarmee elk menselijk gen wordt geregeld. Transcriptie is de eerste stap bij het beheersen van gen expressie niveaus, en het is geregeld door sets van transcriptiefactoren (TFs) die uniek voor elk gen zijn. Gezien het feit dat mensen coderen voor > 1500 TFs1,2, identificatie van de complete set van TFs waarmee de expressie van elk gen blijft een open uitdaging.

Twee soorten methoden kunnen worden gebruikt voor het toewijzen van TF-DNA interacties: TF-gecentreerd en DNA-gecentreerd methode3 (figuur 1A). TF-gecentreerde methoden, is een TF van belang voor de binding aan de genomic DNA regio's of om te bepalen zijn DNA-bindende specificiteit gesondeerd. Deze methoden omvatten chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door sequentiebepaling van high-throughput, eiwit bindende microarrays en SELEX4,5,6. In DNA-gecentreerde methoden, is een opeenvolging van DNA van belang om te bepalen van de set van TFs die zich aan het DNA-sequentie binden gesondeerd. De meest toegepaste van dergelijke methoden is gist één-hybride (Y1H) testen, in welke interacties tussen TFs en DNA regio's worden getest in de omgeving van de kern van de gist met reporter genen7,8,9.

Y1H tests omvatten twee componenten: een 'DNA-aas' (bijv. de initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een 'TF-prooi,"die kan worden gescreend voor reporter gene activering9,10 (figuur 1B). Het DNA-aas wordt gekloond stroomopwaarts van twee reporter genen (LacZ en HIS3) en beide DNA-bait::reporter constructies zijn geïntegreerd in het genoom van de gist voor het genereren van chromatinized 'DNA-aas stammen.' De TF-prooi, gecodeerd in een plasmide die een TF gesmolten tot het domein (AD) van de activering van de gist Gal4 TF uitdrukt, is ingevoerd in de stam van de DNA-aas te vissen voor TF-DNA interacties. Als de TF-prooi aan de opeenvolging van DNA-aas bindt, dan is de advertentie aanwezig in de TF-prooi zal leiden tot de activering van beide genen verslaggever. Dientengevolge, kunnen cellen met een positieve interactie worden geselecteerd voor groei op platen histidine ontbreekt, evenals het overwinnen van een concurrerende inhibitor, 3-Amino-1,2,4-triazool (3-AT), en gevisualiseerd als blauwe kolonies in aanwezigheid van X-gal. Omdat de potente gist Gal4 AD wordt gebruikt, Y1H assays interacties transcriptionele activators evenals repressors kunnen detecteren. Bovendien, gezien het feit dat de TF-prooien worden uitgedrukt van een sterke gist promotor (ADH1), kunnen interacties worden gedetecteerd zelfs voor TFs die lage endogene expressie niveaus, die zijn uitdagend hebben te detecteren door ChIP11,12.

Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H assays zijn gebaseerd op de invoering van TF-prooien in de DNA-aas giststammen door transformeren gepoolde TF-prooi bibliotheken gevolgd door selectie, kolonie plukken en rangschikken om te identificeren van de interactie TF, of door transformatie van individuele klonen8,9. Dit zijn tijdrovende protocollen, beperking van het aantal DNA-sequenties die kunnen worden getest per onderzoeker. Een recente verbetering van Y1H tests, genaamd versterkt Y1H (eY1H), is sterk toegenomen de screening doorvoer met behulp van een hoge dichtheid matrix (HDA) robotic platform om te paren giststammen DNA-aas met een collectie giststammen elk uiting geven aan een ander TF-prooi10,13 (Figuur 1 c). Deze schermen gebruiken een 1.536 kolonie formaat waardoor voor het testen van de meeste menselijke TFs in viervoud met behulp van slechts drie platen. Verder, gezien het feit dat de TF-DNA interacties worden getest in een paarsgewijze manier, deze aanpak maakt het mogelijk voor het vergelijken van interacties tussen DNA-aas (zoals twee noncoding één nucleotide varianten) en tussen verschillende TFs of TF varianten11,12 ,14.

Met behulp van eY1H assays, hebben we de grootste mens en Caenorhabditis elegans DNA-gecentreerde TF-DNA interacties netwerken tot heden afgebakend. In het bijzonder, hebben we 2,230 interacties tussen 246 menselijke developmental smaakversterkers en 283 TFs12vastgesteld. Verder hebben we gebruikt eY1H testen om te ontdekken van gewijzigde TF binding aan 109 één nucleotide noncoding varianten die zijn gekoppeld aan genetische ziekten zoals ontwikkelingsstoornissen malformatie, kanker en neurologische aandoeningen. Meer recentelijk hebben we gebruikt eY1H om af te bakenen een netwerk bestaande uit 21,714 interacties tussen 2.576 C. elegans gene initiatiefnemers en 366 TFs11. Dit netwerk was behulpzaam om te ontdekken de functionele rol van tientallen C. elegans TFs.

De protocollen voor het genereren van DNA-aas vlekken en evalueren van de niveaus van achtergrond verslaggever activiteit geweest gemeld elders15,16,17. Hier beschrijven we een pijpleiding van de eY1H die kan worden gebruikt om het scherm van een menselijke genomic DNA regio tegen een array van 1,086 menselijke TFs. Zodra een gist stam van de DNA-aas wordt gegenereerd en een TF-prooi-matrix is bevlekt op de overeenkomstige platen, kan het gehele protocol worden uitgevoerd in twee weken (tabel 1). Wat nog belangrijker is, kan het protocol worden heeft zodat een enkele onderzoeker kan scherm 60 opeenvolgingen van DNA-aas gelijktijdig. We gescreend om aan te tonen van het protocol, de initiatiefnemers van de twee genen van cytokine CCL15 en IL17F. Daarnaast tonen we de resultaten van mislukte schermen ter illustratie van de soorten problemen die zich voordoen kunnen bij het uitvoeren van eY1H testen en het oplossen van hen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding

  1. SC −U −H platen (petrischalen 150 mm)
    Opmerking: Deze platen worden gebruikt voor de teelt van de DNA-aas giststammen.
    1. Los van de drop-out mix, gist stikstof base (YNB), adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 920 mL water en pH tot 5,9 met 5 M NaOH (ongeveer 1 mL per liter media; Zie tabel 2 voor samenstelling). Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.
    2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
    3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.
    4. Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose, meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C in een waterbad.
    5. De leucine en het tryptofaan toevoegen aan de media. Meng goed op een bord roer en giet in steriele petrischalen 150 mm (~ 80 mL per schotel). 3-5 dagen bij kamertemperatuur, drogen in plastic zakken verpakken en bewaren bij kamertemperatuur voor maximaal 6 maanden.
  2. YAPD rechthoekige platen
    Opmerking: Deze platen worden gebruikt voor de teelt van het gazon voor de DNA-aas-stam en paring met de TF matrix collectie.
    1. Los van de poeders (Zie tabel 3 voor samenstelling), met uitzondering van agar, in 950 mL water in een erlenmeyer van 2 L en voeg een roer-bar.
    2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
    3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.
    4. Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar.
    5. Toevoegen van de glucose, mix goed op een roer plaat en laat afkoelen tot 55 ° C. Giet media in de rechthoekige platen (Zie Tabel of Materials; ~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en een 6 mm slang. Droge voor 1 dag bij kamertemperatuur, verpakken in plastic zakken, en op te slaan in de koude kamer voor maximaal 6 maanden.
      Opmerking: Hoewel het voorgestelde media volume 70 mL per plaat is, kan er 50 – 80 mL per plaat worden gebruikt. De drie kritieke kwesties om te overwegen wanneer gieten platen zijn 1) dat ze worden herverdeeld zodat de agarmedia de zelfde dikte in de plaat heeft (gebruik een geëgaliseerd tabel of oppervlak voor plaat gieten en doen niet giet in stapels van meer dan zeven platen) 2) om de afwezigheid van de bubbels in de agar media (bubbels moeten worden uitgeklapt met behulp van een steriele naald), en 3) de platen voor slechts één dag drogen en verpakken van de platen in plastic zakken om te voorkomen dat storingen in het vastzetten van de gist.
  3. SC −Trp en Sc −U −Trp rechthoekige platen
    Opmerking: Deze platen zal worden gebruikt voor de teelt van de TF matrix collectie (Sc −Trp) en selecteer diploïde gist na de paring (Sc −U −Trp).
    1. Los van de drop-out mix, YNB, adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 920 mL water en pH tot 5,9 met NaOH 5M (ongeveer 1 mL / liter van media) (Zie tabel 4 voor samenstelling). Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.
    2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
    3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.
    4. Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose, meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C.
    5. Voeg de leucine, histidine, en uracil (weglaten van de uracil voor de Sc −U −Trp platen).
    6. Meng goed op een bord roer en giet in rechthoekige platen (~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en 6 mm slang. Voor 1 dag bij kamertemperatuur drogen, wikkel de platen in plastic zakken en opslaan in de koude kamer voor maximaal 3 maanden.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rechthoekige platen
    Opmerking:     deze platen worden gebruikt als uitlezing platen voor eY1H testen.
    1. Los van de drop-out mix, YNB, adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 850 mL water (Zie tabel 5 voor samenstelling). Doen niet de pH. Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.
    2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 850 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
    3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.
    4. 10 x BU zouten (1L) voor te bereiden door het combineren van 900 mL water, 70 g gekristalliseerd nb2HPO4∙7H2O en 34.5 g NaH2PO4∙H2O. Mix met behulp van een roer bar te ontbinden poeders en breng de pH op 7.0 met 5 M NaOH. Voeg water tot 1 L en autoclaaf te brengen.
    5. Bereid de oplossing van de X-gal door 3.5 g X-gal poeder toe te voegen aan een 50 mL plastic buis waarin 42.5 mL dimethyl formamide. X-gal poeder toevoegen aan dimethyl formamide te ontbinden gemakkelijker (dit duurt 30 min). Stockoplossing houden in het donker (gebruik ondoorzichtige 50 ml tube of dekking in folie). Winkel bij-20 ° C.
    6. Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose en de 10 x BU zouten (Zie tabel 5 voor samenstelling), meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C.
    7. Voeg de leucine, 3AT, en X-gal (Zie tabel 5 voor samenstelling).
    8. Meng goed op een bord roer en giet in de rechthoekige platen (~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en een 6 mm slang. Droge voor 1 dag bij kamertemperatuur, verpakken in plastic zakken, en op te slaan in de koude kamer, bedekt met aluminiumfolie (3AT en X-gal zijn licht gevoelig) voor maximaal 1 maand.

2. het spotten van een TF-matrix

  1. Ontdooien de TF-prooi-array
    1. Ontdooi de gist glycerol voorraad platen met de TF-prooi-array op ijs.
      Opmerking: TF-prooi matrices kunnen worden gegenereerd als de eerder gepubliceerde10,12,13,18.
    2. Resuspendeer de gist met behulp van een precisiepipet 12-kanaals binnen 1 – 3 minuten voor de volgende stap.
  2. De gist spotten in Sc −Trp rechthoekige platen
    1. In de robot HDA (Zie Tabel of Materials), selecteer multi goed 96 platen als bron, 96 agar platen als doelgroep, en 96 lange pin pads.
      Opmerking: PIN pads zijn niet herbruikbare en moeten worden weggegooid.
    2. Selecteer het Repliceren vele programma twee kopieën per 96-wells-plaat te maken. Gebruik niet de recycle of opnieuw opties om terug verontreiniging van de bevroren voorraden te voorkomen.
    3. Selecteer de optie swirl op en neer in de bron te mengen van de gist.
    4. De gevlekte matrix tas en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.
  3. Genereren van 384 kolonie arrays in Sc −Trp rechthoekige platen
    1. Selecteer in de robot, 96 agar platen als bron, 384 agarplaat als doel en 96 korte pin pads.
    2. Selecteer het programma van 1:4 matrix . Op deze manier zullen de vier 96 kolonie platen (elk met een verschillende TF) worden geconsolideerd in één 384 kolonie plaat. Gebruik niet de recycle of opnieuw opties om verontreiniging tussen verschillende platen te voorkomen.
    3. Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 384-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
  4. Genereren van 1.536 kolonie arrays in Sc −Trp rechthoekige platen
    Opmerking: Dit zal resulteren in matrices met vier kolonies voor elke TF-prooi.
    1. Selecteer in de robot, 384 agar platen als bron, de 1.536 agar platen als doel en 384 korte pin pads.
    2. Selecteer het programma van 1:4 assay één bron. Het doel is om elke kolonie in vier kolonies te verkrijgen quadruplicates kopiëren. Gebruik de recycle en opnieuw van opties als het gaat om vier keer elke kolonie kopiëren.
    3. Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 1536-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 3 dagen.
  5. Frequentiebanden te versterken van de array 1.536 kolonie in Sc −Trp rechthoekige platen
    1. Selecteer in de robot, 1.536 agar platen als bron, 1.536 agar platen als doel en 1.536 korte pin pads.
    2. Selecteer het Repliceren vele programma voor 3-4-kopieën te repliceren. Gebruik de recycle en opnieuw optie, maar gooi de pad wanneer u overschakelt op een ander bord van de matrix te voorkomen van kruisbesmetting.
    3. Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 1536-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 3 dagen om te gebruiken voor de paring stappen (zie hieronder). Na dat, houden de platen bij kamertemperatuur en kopie weer na 7 dagen voor een nieuwe ronde van screening.

3. eY1H scherm

  1. DNA-aas stam gazons voorbereiden paring
    1. Ter plaatse van de gist stammen van de DNA-aas op een Sc −U −H plaat en groeien gedurende 3 dagen bij 30 ° C.
    2. Strijk de gist in een 15 cm Sc −U −H plaat met een steriel tandenstoker, zodat elke plaat 12 – 16 verschillende stammen past. Incubeer één dag bij 30 ° C.
    3. Strijk de gist in een 15 cm Sc −U −H plaat met een steriel tandenstoker, zodat elke plaat 4 verschillende stammen past. Incubeer gedurende één dag bij 30 ° C.
    4. Schraap de gist met een steriel tandenstoker, ervoor niet schraap eventuele agar en toevoegen in een 1,5 buis met 500 µL van steriel water.
    5. Voeg 10 à 15 steriele glazen bolletjes op een rechthoekig bord van YAPD. Voeg de gist schorsing op het bord en schud grondig in alle richtingen voor 1 min om ervoor te zorgen dat de gist wordt verspreid via alle de plaat.
    6. De plaat onmiddellijk omkeren en tik op zodat de kralen naar het deksel. Verwijderen en recycleren van de kralen.
    7. Tas van de platen en agar-zijde naar beneden Incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 ° C. Ga verder met de paring stap.
  2. Paring van gist DNA-aas en TF matrix stammen
    1. De TF-matrix overbrengen in een YAPD rechthoekige plaat met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma dat Vele repliceren . Elke TF matrix plaat kan overbrengen naar 3-4 YAPD platen (afhankelijk van het aantal platen in de array) worden gebruikt. De TF matrix platen gebruikt voor de paring moeten 2-3 dagen oud maar niet meer als de paring kan inefficiënt.
    2. Het gazon van een DNA-aas stam overbrengen in de platen van de YAPD al met de TF-matrix met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma dat Vele repliceren . Gebruik een willekeurige marge in de bron met een radius van ~0.6 mm om te voorkomen dat het nemen van gist van dezelfde plek, en meng op doel om contact tussen giststammen. Gebruik het gazon met de DNA-aas stammen (punt 3.1) als bron, en de platen van de YAPD met de TF-matrix gespot in stap 3.2.1 als doel.
    3. Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 1 dag.
  3. Selectie van diploïde gist
    1. De erop gist van de platen YAPD overbrengen aan Sc −U −Trp platen met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma repliceren . Meng op bron en op doel.
    2. Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen (langere incubatietijd leidt tot hoge achtergrond verslaggever activiteit).
  4. Overbrengen van uitlezing platen
    1. De diploïde gist van de Sc −U −Trp platen overbrengen naar de uitlezing rechthoekige platen Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal met behulp van de robot. Selecteer de 1.536 agar platen als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma repliceren .
    2. Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C tot 7 dagen.
  5. Beeldvorming van uitlezing platen
    1. Voor DNA-aas stammen met hoge achtergrond verslaggever activiteit, door foto's te nemen op dagen 2, 3 en 4. Anders, de foto's te nemen op dagen 4 en 7. Positieve interacties door groei en blauwe kleur van de gist kolonies worden geïdentificeerd en kunnen handmatig worden bepaald, of het kan worden bepaald met behulp van de software van de analyse van de afbeelding.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Drie belangrijke factoren moeten worden beschouwd wanneer analyseren van resultaten van eY1H assays: de achtergrond verslaggever activiteit van de DNA-aas-stam, de sterkte van de activiteit van de verslaggever overeenkomt met TF-DNA interacties, en het aantal positieve kolonies. De achtergrond verslaggever activiteit (bijvoorbeeld autoactivity) van de DNA-aas stam verwijst naar de algemene groei en kleur van de kolonies van de gist in de uitlezing plaat, zelfs in de afwezigheid van een TF-prooi. Ideaal, niet-autoactive s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De robotic eY1H paring screening beschreven aanpak hier sterk verhoogt de doorvoer ter identificatie van de set van TFs die zich aan een DNA-regio van belang binden, in vergelijking met vorige bibliotheek screening of gekleed screening benaderingen gebaseerd op transformatie. Verder, de TF-DNA-interacties die zijn gedetecteerd door eY1H testen zeer reproduceerbaar, zijn 90% van interacties genotypes zijn positief voor alle vier kolonies per TF getest, en 90% van interacties opnieuw testen in een onafhankelijke scherm van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [R35-GM128625 naar J.I.F.B.].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-Amino-1,2,4-triazool (3AT) ~95 % TLCSigmaA8056-100GCompetitieve remmer voor producten van HIS3-gen
Adenine sulfaat (hemisulfaat), dihydraatUS BiologicalsA0865Vereist voor goede gistgroei
Agar High Gel Strength - Bacteriologisch kwaliteitAmerican International ChemicalAGHGUPVoedingsmedium voor gistgroei
AmmoniumsulfaatUS BiologicalsA1450Stikstofbron in synthetisch gistmedium
D+ Glucose AnhydrousUS BiologicalsG3050Vereist voor gistgroei
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp en Uracil, adenine rijk zonder giststikstofbaseUS BiologicalsD9540-02Synthetisch compleet medium vereist voor gistgroei
Edge Multiparameter pH MeterHanna InstrumentsHI2020-01Om de pH van selectief medium te meten
Flat Toothpicks 750 ctDiamondOm gisten op petrischalen uit te zaaien
GlaspebbeltjesWalter Stern100COm gist te verspreiden bij het maken van lawn
Glycerol ≥99%Millipore SigmaG9012-1LVereist om bevroren giststammen te maken
L-HistidineUS BiologicalsH5100Voor gistgroeiselectie in selectief medium
L-LeucineUS BiologicalsL2020-05Voor gistgroeiselectie in selectief medium
L-TryptophaneSigmaT-0254Voor gistgroeiselectie in selectief medium
N,N-DimethylformamideSigma319937-1LOm X-gal oplossing te maken
Omnipense EliteWheatonW375030-AVoor het doseren van nauwkeurige volumes medium in Singer platen
Peptone, BacteriologischAmerican International ChemicalPEBAUPEiwitbron vereist voor gistgroei
Petrischaal, 150 mm x15 mmVWR10753-950Voor het kweken van gistlokaas voor screening
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003Om rechthoekige agar platen te maken voor gebruik met Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Gekoelde IncubatorThermoFisher ScientificPR205745ROm gistplaten op constante temperatuur te incuberen
RePads 1,536 kortSinger InstrumentsREP-005Om de TF-prey array over te brengen, gist te mengen en gist over te brengen naar diploïde selectie- en uitleesplaten
RePads 384 kortSinger InstrumentsREP-004Om TF-prey array over te brengen van 384 naar 1,536 kolonie formaat
RePads 96 langSinger InstrumentsREP-001Om TF-prey array over te brengen van glycerol stock naar agar plaat
RePads 96 kortSinger InstrumentsREP-002Om TF-prey array over te brengen van 96 naar 384 kolonie formaat
Singer HDA RoToR robotSinger InstrumentsVoor het overbrengen van gist op hoog-doorvoer wijze
Natriumhydroxide (Pellets/Certified ACS)FisherS318-1Voor het aanpassen van de pH van selectief medium
Natriumfosfaat dibasisch heptahydraatSanta Cruz Biotechnologysc-203402CVereist voor LacZ reporter activiteit op X-gal 
Natriumfosfaat monobasisch monohydraatSanta Cruz Biotechnologysc-202342BVereist voor LacZ reporter activiteit op X-gal 
UracilSigmaU0750-100GVoor gistgroeiselectie in selectief medium
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranosid)Gold BiotechnologyX4281C100β-galactosidase maakt kleurloos X-gal blauw om eiwit-DNA interactie te detecteren
Gist ExtractUS BiologicalsY2010Voedzaam medium voor groei en vermeerdering van gist
Gist Stikstof Base (poeder) zonder AA, koolhydraat en zonder AS US BiologicalsY2030Vereist voor krachtige gistgroei

Referenties

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50(2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Yeast One-hybrid AssayDNA-aasstammenTF-prooiaarrayarray met hoge dichtheidrobotplatform1536-kolonieformaatSC minus tryptofaanreportergenactivatiefunctionele genomica
Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.