Methodenartikel

Met behulp van Sniper-Cas9 te minimaliseren Off-target effecten van CRISPR-Cas9 zonder verlies van On-target activiteit Via gerichte evolutie

DOI:

10.3791/59202

⸱

26 februari 2019

 ,  ,  , 
1ToolGen

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het optimaliseren van CRISPR-Cas9 om een hogere specificiteit zonder verlies van aan-target activiteit. We een gerichte evolutie aanpak genoemd Sniper-scherm gebruiken om te zoeken een mutant Cas9 met de gewenste kenmerken. Sniper-Cas9 compatible met afgekapte single-gids RNAs en levering in een ribonucleoprotein formaat, bekende strategieën voor het bereiken van hogere specificiteit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR)-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) in therapeutische modaliteiten vereist het vermijden van de potentieel schadelijke gevolgen ervan af-target. Verschillende methoden hebben ontwikkeld om dergelijke effecten. Hier presenteren we een Escherichia coli-gebaseerde gerichte evolutie methode genaamd Sniper-scherm om het verkrijgen van een Cas9-variant met geoptimaliseerde specificiteit en behouden op de doelsoort activiteit, Sniper-Cas9 genoemd. Met behulp van Sniper-scherm, kan positieve en negatieve selectie gelijktijdig worden uitgevoerd. Het scherm kan ook worden herhaald met andere single-gids-RNA (sgRNA)-sequenties te verrijken voor de echte positieve hits. Met behulp van de CMV-PltetO1 dual promotor uitspreken Cas9 varianten, kan de prestaties van de gebundelde bibliotheek worden snel ingecheckt zoogdiercellen. Methoden om het specifieke karakter van Sniper-Cas9 zijn ook beschreven. Ten eerste, het gebruik van afgekapte sgRNAs eerder gebleken te verhogen van de specificiteit van de Cas9. In tegenstelling tot andere gemanipuleerde Cas9s behoudt Sniper-Cas9 een wild-type (WT) niveau van aan-target activiteit in combinatie met afgekapte sgRNAs. Ten tweede, de levering van Sniper-Cas9 in een ribonucleoprotein (RNP) formaat in plaats van een plasmide-indeling is mogelijk zonder haar activiteit op doelsoort zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit document streven wij naar het verbeteren van de specificiteit van de Cas9 door het combineren van verschillende strategieën. Verschillende methoden om de effecten van de af-target van CRISPR-Cas9 te vermijden hebben ontwikkeld. Afgeknotte sgRNAs kan bijvoorbeeld worden gebruikt om hogere specificiteit1. Bovendien kan de methode van Cas9 levering vanuit de plasmide-indeling worden gewijzigd in een formaat RNP verkrijgen van hogere specificiteit2. Specifieke aminozuurresidu's van de Streptococcus pyogenes -Cas9 (SpCas9) eiwit zijn gewijzigd volgens het rationele ontwerp eerder3,4,5beschreven. Uitwijkmogelijkheid, aminozuurresidu's zijn gewijzigd in een willekeurige manier en de varianten van de Cas9 met de hoogste specificiteit werden geïdentificeerd met behulp van een gist6 of een E. coli7,-8 , screening systeem.

Echter, veel groepen hebben gemeld dat de Cas9 varianten met behulp van het ontwerp ontworpen aan de knelpunten van de niet-specifieke interactie tussen Cas9 en het substraat tentoonstelling laag op de doelsoort activiteiten7,8,9, 10 , 11 , 12. ontwikkelden we een E. coli-gebaseerde gerichte evolutie systeem, Sniper-scherm, scherm willekeurig mutagenized Cas9 varianten. Een E. coli screening systeem heeft voordelen ten opzichte van een gist-systeem vanwege de sneller verdubbeling transformatie van tijd en hogere efficiëntie van E. coli.

Zowel de positieve als de negatieve selectie, op basis van drie verschillende plasmiden en een gen van belang (Indiase) geïntegreerd in het genoom van E. coli , worden gebruikt in Sniper-scherm. Cas9 varianten worden uitgedrukt onder het systeem van CMV-PltetO1 dual-promotor van een lage-kopie nummer plasmide zodat kandidaten in E. coli geïdentificeerd kunnen worden getest in zoogdiercellen zonder de noodzaak voor het subcloning. De Indiase overheid is geïntroduceerd in het genoom van de E. coli met behulp van de Tn7 transposon systeem. Het plasmide-sgRNA, die een temperatuurgevoelige oorsprong van replicatie bevat, spreekt een sgRNA gericht op de Indiase overheid; echter, de sgRNA en de Indiase overheid sequenties zijn niet perfect overeen. Een doelsite perfect afgestemd sgRNA bestaat voor een derde plasmide met de ccdB -gen, dat codeert een dodelijke product dat gyrase vergiftigt. In dit systeem, worden de cellen uiten Cas9 varianten met hoge korting-target activiteiten verwijderd omdat dubbel-strand einden (DSBs) worden ingevoerd in de niet-overeenkomende site gelegen in de genomic DNA. Aan de andere kant, worden cellen uiten Cas9 varianten met lage op doelsoort activiteiten ook verwijderd vanwege dodelijk ccdB genexpressie. Het niveau van de expressie van de varianten van de Cas9 kan worden gewijzigd door een wijziging van de concentratie van anhydrotetracycline (ATC), die de kracht van de selectie aanpast.

We redeneerde dat het lokaliseren van de doelsite niet-overeenkomende sgRNA in de genomic DNA in plaats van op een plasmide de gevoeligheid van het systeem zou toenemen. Het voordeel van deze aanpak is dat er slechts één genomic site, terwijl er zou veel plasmiden, elk met een doelsite, binnen een honkslag E. coli cel.

Met behulp van dit systeem, wij een Cas9 variant, Sniper-Cas9, die toont WT-niveau op doelsoort zijn activiteiten en verminderd uit doelsoort zijn activiteiten in vergelijking met WT Cas9 geïdentificeerd. Sniper-Cas9 kunt bereiken zelfs hogere specificiteit verhoudingen met afgekapte sgRNAs of RNP gebaseerde levering in plaats van plasmide gebaseerde levering.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. integratie van een menselijke Indiase in de stam van de BW25141 E. coli

  1. Klonen van de Indiase overheid
    1. De Kettingreactie van de polymerase (PCR) versterken een 500 bp lengte van een menselijke GOI met diverse kandidaat-target sites via standaard PCR methodes met inleidingen die kennisgevingen en XhoI sites van het beperkingsenzym bevatten.
      Opmerking: In dit experiment was de Indiase overheid de menselijk EMX1 -gen.
    2. Zowel het PCR product en de pgrg3613 vector met kennisgevingen en XhoI restrictie-enzymen verteren.
    3. Gel zuiveren de gewenste fragmenten (500 bp en 12 kb).
    4. De fragmenten samen met behulp van ligase T4 afbinden. Om dit te doen, Meng 50 ng verteerd pgrg36 en 6 ng van PCR invoegen in een volume van de reactie van 20 μL met 1 x ligase buffer en 0,5 U ligase enzym. Bij kamertemperatuur (RT) na een nacht bebroeden.
    5. Transformeer de ligaturen plasmide in DH5-α bevoegde cellen. De resulterende transformants op Luria Bouillon (LB) agar platen met ampicilline (100 μg/mL) op 32 ° C groeien en na een nacht bebroeden. Pak een kolonie en groeien in LB-media met ampicilline 's nachts. Isoleren van de plasmide DNA uit de E. coli, met behulp van een commercieel verkrijgbare miniprep Kit. Bevestig de invoeging van het fragment van de Indiase overheid door Sanger sequencing van de plasmide verkregen uit de mini plasmide voorbereiding (mini prep)13.
  2. Voorbereiding van de BW25141 -GOI
    1. DeIndiase overheid plasmide verkregen pgrg36 - transformeren in de stam van de BW25141 E. coli . Het is essentieel om te gebruiken van een BW25141 spanning om te minimaliseren van het aantal valse positieve kolonies.
    2. Groeien de getransformeerde cellen in de LB-buffer bij 32 ° C's nachts. Indiase overheid wordt ingevoegd aan de genomic DNA van de BW25141 stam (BW25141 -Indiase overheid). DeIndiase overheid plasmide pgrg36 - uit de BW25141 -Indiase stam met behulp van de standaard pgrg36 protocol13verwijderen. Kort, Verdun een kolonie (ongeveer 107-vouwen) en groeien op een LB-plaat bij 42 ° C's nachts. Strijk de kolonies op de plaat LB en groeien ze bij 42 ° C's nachts.
    3. Bevestigen van de juiste GOI invoeging door PCR, met behulp van de inleidingen voorgesteld in het pgrg36-protocol van de kolonie: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3 'en 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3'. De primer versterkt de genomic DNA invoeging site, en de grootte van het resulterende PCR product zullen 904 bp plus de grootte van de insert (500 bp in dit geval).
    4. Het bereiden van electrocompetent BW25141 -GOI cellen (een gedetailleerd protocol wordt beschreven in de stappen 3.2.6–3.2.10).

2. voorbereiding van de Cas9 variant bibliotheek

  1. Voorbereiding van de bibliotheek
    1. De Cas9 vector7 transformeren in een commerciële E. coli mutator stam (Tabel van materialen) en volg de instructies van de fabrikant te verkrijgen van een variant bibliotheek (de Mutator-bibliotheek).
    2. Vergissing-geneigd PCR op de volgorde van de hele WT Cas9 in het Cas9 vector, met behulp van een foutgevoelige PCR kit (Tabel of Materials) uitvoeren.
      Opmerking: Het lage-foutenpercentage protocol werd aangenomen in het geval van de Sniper-Cas9 te voorkomen dat de oorspronkelijke functie van het eiwit.
    3. De vector Cas9 met geschikte restrictie-enzymen verteren. Gel zuiveren van het PCR-product (uit stap 2.1.2) en de verteerd ruggengraat.
      Opmerking: De grootte van de SpCas9-gen is ongeveer 4,3 kb. XhoI en KpnI werden gekozen om te verteren pBLC-SpCas9-vector die werd gebruikt in het geval van Sniper-Cas9.
    4. Monteer het fragment van de ruggengraat (uit stap 2.1.3) en het donormateriaal versterkt met behulp van foutgevoelige PCR (uit stap 2.1.3) via isothermische in vitro recombinatie.
      Opmerking: meer dan 500 ng van backbone is nodig om het verkrijgen van een hoge concentratie van bibliotheek (foutgevoelige PCR [EP] bibliotheek). Twee verschillende foutgevoelige PCR uitrustingen werden gebruikt voor het bereiden van EP bibliotheken in het geval van Sniper-Cas9 (EP bibliotheek I en II).
    5. De producten van de vergadering (uit stap 2.1.4) zuiveren met behulp van een DNA-zuivering kit waarmee laag-volume elutie (Tabel van materialen). Elueer met 6 μL van de nuclease-gratis water (NFW) en meten van de concentratie van DNA.
    6. Transformeren van meer dan 500 ng van Cas9 bibliotheek vector (voor elk van de drie bibliotheken) in 50 μl van het electrocompetent E. coli cellen (Tabel van materialen). Zie het protocol electroporation in stappen 3.2.1-3.2.4. Voor de voorbereiding van deze bibliotheek, 1 mL van SOC medium te gebruiken in plaats van 250 μL per 50 μl van bevoegde cellen.
    7. Maken van 1:100, 1:1, 000, en 1:10,000 verdunningen van het mengsel met de herstelde cellen met SOC medium. Plaat van de verdunde cellen op 100 mm LB agar platen aangevuld met chlooramfenicol (12,5 μg/mL). De resterende cellen op een plaat van de2 245 mm plaat. Incubeer bij 37 ° C's nachts.
  2. Berekening van de complexiteit van de bibliotheek
    1. Foto van de verdunning platen via een documentatiesysteem gel of een gewone digitale camera. OpenCFU software14 uitvoeren en uploaden van de foto's van de verdunning platen. Instellen van het tellen gebied binnen een plaat en verwijderen van valse kolonies.
    2. Handmatig het aantal kolonies te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor om het oorspronkelijke aantal transformants te verkrijgen. Deze getallen omzetten in logaritmische vorm (grondtal 10). Bereken het gemiddelde om te bepalen van de complexiteit van de bibliotheek.
    3. Wanneer de complexiteit van de gewenste waarde wordt verkregen, verzamelen alle kolonies op de vierkante plaat van 245 mm (uit stap 2.1.7) met behulp van een spreider en 20 mL LB aangevuld met chlooramfenicol. De verzamelde kolonies groeien niet en zuiveren van de plasmide-bibliotheek met behulp van een commerciële midiprep kit.
      Opmerking: Hoe hoger de complexiteit van de bibliotheek, hoe beter. Wanneer Sniper-Cas9 werd geïdentificeerd, was een diversiteit van 3 x 106 voor elke bibliotheek bereikt.

3. positieve en negatieve screening voor de evoluerende Cas9

  1. Doelverschuiving en plasmide bouw
    1. Selecteer een doelgroep sgRNA spacer-reeks in de Indiase overheid. Vervang een of twee residuen in het willekeurig nucleotide tot een verkeerde volgorde.
      Opmerking: Menselijke EMX1 doelsite 3 (GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA met GGG PAM) werd gebruikt in het geval van Sniper-Cas9. Achterban zijn de niet-overeenkomende sequenties gebruikt: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA, GAacCCGAGCAGAAGAAGAA, GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA en GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA.
    2. Invoegen van de verkeerde volgorde (zie stap 3.1.1) in het plasmide van de sgRNA met behulp van standaard oligonucleotide (oligo) procedures7klonen.
    3. Invoegen de verkeerde volgorde met een PAM aan de 3'-eind p11-lacY-wtx1 (Tabel of Materials) voor de bouw van de ccdB plasmide met behulp van standaard oligo klonen procedures15.
  2. Voorbereiding van Sniper-screening E. coli bevoegde cellen
    1. BW25141 -Indiase electrocompetent cellen op ijs ontdooien.
    2. Er 1 bij optellen ng elke de ccdB -plasmide of de plasmide sgRNA met dubbele incongruenties in 50 μl van ontdooide BW25141 -GOI cellen. Zachtjes Meng de cellen door pipetteren en sleep ze in een prechilled 0,1 cm electroporation cuvette.
    3. Transformeren de E. coli met de twee plasmiden via electroporation. Voeg 250 μL van SOC medium onmiddellijk na electroporation. Pipetteer zachtjes de oplossing voor het mengen van de cellen en het medium. Het mengsel overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
      Opmerking: Voor maximale efficiëntie, vastgesteldop de spanning 1,80 kV en de runtime moet tussen 4.8 ms en 5.0 ms.
    4. De getransformeerde cellen herstellen en hen uit te broeden bij 32 ° C gedurende 1 h met zacht schudden.
    5. 125 μL van de herstelde cellen op een ampicilline (50 μg/mL) plaat / kanamycine (25 μg/mL) LB agar plaat (cultuur voorwaarde). Plaat de resterende cellen op een ampicilline/kanamycine/arabinose (1,5 mg/mL) LB agarplaat (ccdB-voorwaarde uitdrukken). Incubeer bij 32 ° C's nachts.
    6. Controleren op de afwezigheid van het overleven van de kolonies op de ccdB-voorwaarde plaat uitdrukken. Verzamelen kolonies van de cultuur voorwaarde plaat met behulp van een spreider en cultuur in 250 mL super optimale Bouillon (SOB) voedingsbodem aangevuld met 50 μg/mL ampicilline en 25 μg/mL kanamycine bij 32 ° C, met schudden zacht.
    7. Wanneer de extinctie op 600 nm (OD600) uithoeken 0.4, chill de kolf op ijs. Voorbereiden prechilled gedeïoniseerd water en een oplossing van de prechilled 10% glycerol (steriliseren vóór gebruik).
    8. Centrifugeren (bij 4000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C) van de cellen en de vloeistof wordt weggeworpen. Voeg 200 mL van prechilled gedeïoniseerd water. Resuspendeer de cellen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Herhaal deze stap 3 x.
    9. Wassen van de cellen met 50 mL prechilled 10% glycerol oplossing. Centrifugeer ze als voorheen (bij 4000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C).
    10. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 300 μL van 10% glycerol-oplossing. Breng 50 μl aliquots en bevriezen ze in vloeibare stikstof. Opslaan van de cellen (cellen Sniper-screening) bij-80 ° C.
  3. Sniper-screening
    1. Transformeren van de cellen van de Sniper-screening (uit stap 3.2.10) met 100 ng van de Cas9 variant plasmiden, uit elke bibliotheek (uit stap 2.2.3.See stappen 2.1.1 en 2.1.4). Volg de stappen van de electroporation beschreven in stappen 3.2.1–3.2.3.
    2. 250 μL van de cellen overbrengen in een tube van verse 1,5 mL microcentrifuge. Voeg toe 250 pg van ATC om een eindconcentratie van 10 ng/mL. ATC-bevattende zowel ATC-vrije cellen (zie stap 3.2.4 voor de herstelstap) herstellen.
    3. Plaat 25 μL van herstelde ATC-vrije cellen op een agarplaat chlooramfenicol/kanamycine LB (opvangfaciliteiten voorwaarde). ATC toevoegen aan de herstelde ATC-bevattende cellen om een eindconcentratie van 100 ng/mL op een plaat van de LB 245 mm. Onmiddellijk plaat de cellen op een chlooramfenicol/kanamycine/arabinose LB agarplaat (selectieve voorwaarde). Na een nacht bebroeden bij 32 ° C.
      Opmerking: De grootte en het aantal de LB-plaat worden bepaald door de grootte van de diversiteit van de screening covers. Voeg in het geval van een 100 mm petrischaal met 20 mL LB, 2 μg van ATC.
    4. Foto van de platen. Het aantal levensvatbare kolonies met behulp van de OpenCFU software14. (Zie stap 2.2.1) Zorg ervoor dat het aantal kolonies op de opvangfaciliteiten plaat minstens 10 x groter is dan de diversiteit van de bibliotheek is ter dekking van alle varianten.
    5. Bereken de frequentie van de overleving als volgt.
      Overleving frequentie = het aantal kolonies op een selectieve plaat / (het aantal kolonies op een opvangfaciliteiten plaat x 10)
    6. Het zwembad van de koloniën die overleefd op de selectieve platen uit alle drie bibliotheken. Incubeer de overlevende kolonies in 250 mL LB voedingsbodem aangevuld met 12,5 μg/mL chlooramfenicol bij 42 ° C's nachts. Isoleren van de afgeschermde Cas9 bibliotheek DNA met behulp van een midiprep-kit.
      Opmerking: Deze stap wist de sgRNA plasmide.
    7. Herhaal de screening van stappen 3.3.1–3.3.6 totdat de frequentie van de overleving een plateau bereikt. Gebruik 10 ng van het geselecteerde Cas9-plasmide voor transformatie en 10 ng/mL ATC tijdens het herstel. De ATC-concentratie aan 100 ng/mL voor de selectieve voorwaarde te handhaven.
  4. Schuifelen en de tweede screening
    1. Shuffle de geselecteerde gepoolde varianten met behulp van de volgende DNA-schuifelen protocol. PCR versterken de Cas9 invoegen in de plasmide van de Cas9 met behulp van begeleidende primers, 150 nucleotiden van de grenzen invoegen. Digest 2 μg van versterkte PCR product met DNase ik voor 1 min bij 37 ° C.
    2. Zuiveren fragmenten 70-200 bp in lengte met behulp van 2% agarose de Elektroforese van het gel. PCR versterken de gezuiverde fragmenten. Gebruik het product als een sjabloon aan PCR versterken de Cas9 invoegen met passende inleidingen begeleidende Cas9. Gebruik het eindproduct van PCR voor de bouw van een Cas9-bibliotheek, zoals beschreven in stap 2.1.4.
    3. Voorbereiding van de nieuwe Sniper-screening cellen (zie paragraaf 3.2) met een ander niet-overeenkomende sgRNA plasmide (zie stap 3.1.1). Opnieuw de screening (afdelingen 3.2 – 3.3) tot de overleving tarief bereikt een plateau. Gebruik 10 ng van het geselecteerde Cas9-plasmide voor transformatie en 10 ng/mL ATC tijdens het herstel. De concentratie van de ATC 10 ng/ml voor de selectieve voorwaarde te handhaven.
  5. Selectie van geëvolueerde Cas9 mutant plasmiden
    1. Na de laatste stap van de screening, willekeurig kiezen van honderd kolonies van de selectieve plaat en cultuur hen in chlooramfenicol-bevattende LB medium bij 42 ° C's nachts.
    2. Isoleren van de plasmiden met behulp van een miniprep procedure en Sanger-sequence de inserts gebruikend sequencing inleidingen binnen Cas9.
    3. Selecteer de bovenste drie meest voorkomende varianten om ze te testen in menselijke cellijnen.

4. levering van Cas9 als een RNP met afgekapte sgRNA

  1. Gen-doelverschuiving met behulp van Cas-OFFinder
    1. Kies doel sites met Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Selecteer het geschikt is voor het specifieke type van Cas9 en het doel-genoom PAM-type (mens, muis, zebravis, enz.). Vul op het tabblad Query sequenties , kies de Mismatch nummeren klik op de verzendknop .
    2. Na een paar seconden, de op-target (met een nummer van de wanverhouding van '0') en de uit-target sites zal verschijnen. In het algemeen, kiezen voor de uit-target plaatsen met één tot drie incongruenties.
  2. Voorbereiding van de sjabloon sgRNA
    1. Bestelt van oligos van de crRNA en tracrRNA met de volgende sjabloon sequenties, namelijk crRNA volgorde: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3'; tracrRNA volgorde: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'. N20 invullen de volgorde van de crRNA met de doel-reeks in stap 4.1.2 verkregen. Voor het ontwerpen van afgeknotte sgRNAs, verwijder basen aan het einde 5' te verkrijgen van de N19, N18 of N17 sgRNA sequenties.
    2. Voorbereiden op het mengsel van PCR versterking van de reeks sgRNA-codering als volgt: combineren van 10 μL van 5 x buffer, 0,5 μL van crRNA oligo (100 pmol/l), 0,5 μL van tracrRNA oligo (100 pmol/l), 2,5 μL van dNTPs (elke 10 mM), 0,5 μL van de polymerase van DNA , en 36 μL van NFW (tabel van materialen).
    3. Versterken van de sjabloon met behulp van de volgende voorwaarden, namelijk voor de eerste denaturatie: 1 min bij 98 ° C; voor de denaturatie, gloeien en uitbreiding: 10 s bij 98 ° C, 15 bij 54 ° C, 20 s s bij 72 ° C, voor 25 cycli; voor de laatste uitbreiding: 5 minuten bij 72 ° C.
    4. Analyseren 2 μL van de versterkte sjabloon DNA (uit stap 4.2.3) op een 2% agarose gel. Zuiveren van de sjabloon met behulp van een PCR zuivering kit.
      Opmerking: De grootte van de sjabloon DNA is 125 bp.
  3. Synthese van sgRNA
    1. Voorbereiden op het reactiemengsel sgRNA synthese als volgt: combineren van 8,5 μl van sjabloon DNA (uit stap 4.2.3), 1 μL van UTP (25 mM), 1 μL van CTP (25 mM), 1 μL van GTP (25 mM), 1 μL van ATP (25 mM), 4.2 μL van MgCl2 (100 mM) , 4.5 μL van T7 RNA-polymerase (50 U/μl), 3 μL van 10 x T7 RNA polymerase buffer 1.2 μL van pyrophosphatase (0,5 U/μl), 0,75 μL van RNase remmer (40 U/μl) en 4.2 μL van NFW.
    2. Na een nacht bebroeden het reactiemengsel bij 37 ° C (ten minste voor 10 h). Voeg toe 0,5 μL van DNase (2 U/μl) aan het reactiemengsel en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15-30 min. zuiveren de sgRNA met behulp van een RNA zuivering kit.
    3. Verklein de toxiciteit veroorzaakt door een aangeboren immune reactie veroorzaakt door de 5'-trifosfaat op de sgRNA16en de 5'-trifosfaat uit de gids RNAs met kalf intestinale alkalisch fosfatase (CIP) als volgt worden verwijderd: 10 µg in vitro- behandelen getranscribeerde RNA met 250 U van CIP gedurende 3 uur bij 37 ° C in aanwezigheid van 100 U van RNase remmer. Zuiveren de CIP-behandeld sgRNA met behulp van een RNA zuivering kit.

5. de eiwituitdrukking WT - en Sniper-Cas9 en reiniging

  1. Eiwit expressie in E. coli
    1. Transformeren huisdier plasmiden18 codering zijn-gelabeld WT - en Sniper-Cas9 in de BL21 (DE3) E. coli stam.
    2. Inoculeer 50 mL LB medium dat 50 μg/mL kanamycine met een verse kolonie herbergen de huisdier-Cas9 expressie plasmide hermetisch en schud het 's nachts (200 rpm) bij 37 ° C (preculture).
    3. Breng 10 mL van overnachting cultuur 500 mL verse LB opslagmedium met 50 μg/mL kanamycine. Incubeer de cultuur met schudden (200 rpm) bij 37 ° C gedurende 2 uur.
    4. Volgen de OD600 totdat de cultuur de mid log fase van groei (OD600 ≈ 0.6-0.7 bereikt).
    5. Induceren van de expressie van het eiwit WT - of Sniper-Cas9 met isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, bij een uiteindelijke concentratie van 0,25 nM). Incubeer de cultuur bij 18 ° C's nachts.
  2. Eiwitreiniging
    1. Oogsten van de cellen door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    2. Resuspendeer de pellet in de lysis-buffermengsel (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl imidazool 10 mM, 4 mM dithiothreitol [DTT], 5 mM benzamidine, 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF], pH 8) bij 20 mL per gram versgewicht.
    3. PMSF, DTT en lysozym toevoegen om een eindconcentratie van 1 mg/mL elke en het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten uit te broeden.
    4. Bewerk ultrasone trillingen ten de cellen op het ijs. Pulse herhaaldelijk voor 10 s bij 200-300 W met een 10 s koeling periode tussen elke pols, voor een totale tijd van 20 min.
    5. Centrifugeer het lysate bij 6.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
    6. Verwijder de bovendrijvende substantie aan een verse buis. Voeg 1 mL zijn-Bind agarose hars aan 5 mL gewist lysate en schud zachtjes gedurende 1 uur bij 4 ° C.
    7. Laad het lysate/zijn-Bind Agarose hars mengsel op een kolom met een afgetopte bodem afvoer.
    8. Verwijder de dop van de bodem en het verzamelen van de kolom doorstroming.
    9. Was de kolom 2 x met was buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8); Verzamel de breuk wassen voor analyse door natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina).
    10. Elueer de proteïne 10 x met 1 mL elutie buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8), verzamelen monsters voor SDS-pagina.
    11. De proteïne van de geëlueerd WT - of Sniper-Cas9 met behulp van een 100 kDa kolom filter concentreren. Opslaan van de monsters in een oplossing van 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl en 50% glycerol bij-80 ° C.

6. RNP levering

  1. Transfectie en voorbereiding van cellen RNP levering
    1. Handhaven HEK293T cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% antibiotica bij 37 ° C met 5% CO2.
    2. WT - of Sniper-Cas9 eiwit (2 μg) mengen met sgRNA (2 μg) en incubeer gedurende 10 min op RT om RNP complexen.
    3. Trypsinize en cellen tellen. 2 x 104 cellen per één reactie voor te bereiden. Wassen van de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifuge. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet met electroporation buffer.
    4. Electroporate RNP complexen in de cellen met de volgende instellingen, namelijk 1.300 V, 30 ms, en een pulse. Plaat de cellen op een plaat van 48-well gevuld met 500 μL van DMEM aangevuld met FBS en antibiotica (zoals beschreven in stap 6.1.1) direct na de electroporation. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.
    5. Isoleer genomic DNA met een gDNA voorbereiding kit, 48 h na de transfectie.

7. de transfectie van plasmiden codering Sniper-Cas9 en sgRNA

  1. Bouw van een sgRNA-plasmide
    1. Vooruit bestellen en reverse oligos met de volgende sjabloon sequenties, namelijk naar voren: 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; omgekeerde: 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'. N20 vervangen door de volgorde van de doelgroep in stap 4.1.2 verkregen. De volgorde van de doelgroep tot een lengte van N19, N18 of N17 te synthetiseren afgeknotte sgRNA verkorten.
    2. Ontharden van beide oligos in 1 x T4 DNA ligase buffer.
    3. Het verteren van het pRG2 vector met BsaI restrictie-enzym.
    4. Gel zuiveren de verteerd vector (3300 bp) met behulp van een 0,8% agarose gel.
    5. Afbinden van de ontharde oligo en het gezuiverde fragment met behulp van ligase T4 op 37 ° C: mix 50 ng van verteerd pRG2 en 1 ng van ontharde oligo in een volume van de reactie van 20 μL. Incubeer bij RT gedurende 15 minuten.
    6. De afbinding mengsel transformeren in de DH5 alpha stam en groeien transformants op LB agar platen met ampicilline (100 μg/mL) bij 37 ° C. Bevestig de invoeging van de oligo in de vector door standaard sequentiebepaling.
  2. De transfectie van plasmiden codering Sniper-Cas9 en sgRNA
    1. Het handhaven van HEK293T cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica bij 37 ° C met 5% CO2. De dag voor transfectie, trypsinize en cellen tellen. Wanneer u werkt op een 48-well schaal, bord 1 x 105 cellen per putje in 250 μL van volledige groeimedium. De cellen moeten op de dag van de transfectie 50 – 80% heuvels.
    2. Op de schaal van de 48-well, bereiden 250 ng p3s-Cas9 plasmide of 250 ng van sgRNA plasmide voor transfectie, met behulp van een lipide gebaseerde transfectiereagens. Meng de plasmiden in 25 μL van serum gratis-MEM.
    3. Verdunnen 1 μL van transfectiereagens met 25 μL van serum gratis-MEM. Incubeer het mengsel op RT voor 5 min. combineren de twee mengsels en de resulterende oplossing bij RT voor 20 min naar formulier plasmide-lipofectamine complexen uit te broeden.
    4. Voeg na 20 min van incubatie, 50 μl van de oplossing, bevattende de plasmide-transfectie reagens complexen rechtstreeks aan elk goed met cellen, en meng zachtjes door de plaat heen en weer schommelen. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator voor 48-72 h post transfectie vóór de keuring voor transgenic expressie.

8. berekening van de indel frequenties om te bepalen op de doelsoort en af-target activiteiten

  1. Diepe rangschikken voor de analyse van de op-target en potentiële af-target sites gericht
    1. Isoleer genomic DNA uit stap 6.1.5 of 7.2.4 met een gDNA voorbereiding kit. Genereren van diepe sequencing bibliotheken door PCR versterking van de gDNA met inleidingen gericht op op-target en af-target.
    2. Gebruik index inleidingen op het label van elk monster. Gebundelde bibliotheken onverminderd gekoppeld-einde sequencing met behulp van een volgende generatie sequencing-machine.
  2. Diepe sequentie-analyse met behulp van Cas-Analyzer
    1. Diepe sequencing gegevens met behulp van de Cas-Analyzer beoordeling gereedschap17analyseren.
    2. Kies de bestanden die Fastq onder de Lees 1 en Lees 2 tabbladen (Lees 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, Lees 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq).
    3. Vul het tabblad Basisinformatie en de Analyse gebruikte Parameters tab. Klik op de verzendknop .

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadat Sniper-scherm wordt uitgevoerd, kan het percentage van overleving kolonies worden berekend door het aantal kolonies op de plaat van de LB met chlooramfenicol, kanamycine, arabinose, en ATC (CKAA) door het aantal kolonies in de LB plaat bevattende chlooramfenicol en kanamycine alleen (CK). Dit percentage was meestal erg laag wanneer Sniper-scherm werd uitgevoerd met de bibliotheken van SpCas9. True-positieve hits kunnen worden verrijkt door het herhalen van het scherm met de overlevende zwembad. Deze vertegenwoordiger Sniper-scherm, bijvoorbeeld, is een 100% overlevingskans verworven na het derde scherm (Figuur 1). Transfections met RNPs of plasmide-gecodeerde Sniper-Cas9 kunnen worden gedaan voor verschillende doelen en de resulterende op-target en af-target activiteiten gemeten door gerichte amplicon sequencing (Figuur 2). Hooguit doelen, Sniper-Cas9 toont hetzelfde beschermingsniveau voor de doelsoort activiteiten en hogere specificiteit ratio's ten opzichte van de PM beknot sgRNAs kunnen ook worden gebruikt ter verdere verbetering van specificiteit (Figuur 3). Hun gebruik is echter beperkt tot slechts een paar doelen, omdat zij leiden lage op doelsoort zijn activiteiten in vergelijking met full-length sgRNAs, in de meeste gevallen tot. Daarom, sgRNAs met verschillende lengtes (vanaf 17 - tot 20-mers) moeten worden getest en zowel op de doelsoort en af-target activiteiten moeten worden gemeten om te optimaliseren specificiteit.

figure-results-1
Figuur 1: vertegenwoordiger Sniper-schermen uitgevoerd met verschillende bibliotheken met willekeurige Cas9 varianten. Mutator bibliotheek, EP bibliotheek ik en EP bibliotheek II geven bibliotheken gemaakt met behulp van verschillende commerciële kits. Eerste, tweede en finale geven het aantal keren dat de verrijking scherm was7uitgevoerd. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: On-target en af-target activiteiten van WT-Cas9 of Sniper-Cas9 gecombineerd met een 20-mer gids reeks geleverd via plasmide of RNP. Specificiteit-ratio's werden vastgesteld door het verdelen van de doelsoort op activiteit door de activiteit van uit-target. Foutbalken geven SEM (n = 3)7. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: On-target en af-target activiteiten van Sniper-Cas9 in vergelijking met de WT-Cas9 verkregen met behulp van sgRNAs met een variabele lengte, gericht op de websites FANCF01 en AAVS. Specificiteit-ratio's werden vastgesteld door indel frequenties op aan-target sites delen door die op de respectieve sites van de af-target. sgRNAs met een overeenkomende guanine in het terminus 5' (GX18 of GX19) en mensen met een niet-overeenkomende guanine (gX17, gX18, gX19 of gX20) worden vermeld. Specificiteit ratio's waren niet berekend wanneer de genormaliseerde op doelsoort zijn activiteiten waren < 70%7. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor degenen die voorkomen dat omslachtig screening procedures willen voor het verkrijgen van Sniper-Cas9, zijn het eiwit Sniper-Cas9 en het coderen plasmide beschikbaar. Het gebruik van deze materialen, de optimale lengte van de sgRNA, die het hoogste percentage van de specificiteit, moet worden bepaald. Bovendien, wordt levering van Sniper-Cas9 en sgRNA in een RNP-indeling aanbevolen omdat het meestal in een hogere specificiteit ratio dan levering in een plasmide-indeling resulteert. In tegenstelling tot Sniper-Cas9 zijn andere gemanipuleerde Cas9 varianten niet compatibel met afgekapte sgRNAs6,7 of levering in RNP vorm8 (met uitzondering van HiFi-Cas9).

Voor Sniper-scherm is de selectie van de verkeerde volgorde de belangrijkste stap. Selectie van een niet-overeenkomende sgRNA die wordt geassocieerd met lage decolleté activiteit naar de Indiase overheid volgorde moet worden vermeden. Als dat niet het geval is, Cas9 varianten met een WT niveau van specificiteit zal niet klieven aan de genomic DNA van E. coli met de niet-overeenkomende doelsite. Dit zal leiden tot een groot aantal achtergrond kolonies, de hele procedure screening in gevaar te brengen.

Omdat E. coli een snelle heeft verdubbeling van tijd en hoge transformatie efficiëntie ten opzichte van gist, Sniper-scherm is voordelig in vergelijking met gist gebaseerde screeningmethoden. Sniper-scherm moet bovendien gevoeliger dan andere E. coli-gebaseerde systemen waarin de niet-overeenkomende site is uitgevoerd op een plasmide: er is één exemplaar van de genomic DNA en dus slechts één kopie van de niet-overeenkomende site in ons systeem, maar een groot aantal plasmiden binnen één E. coli cel.

De specifieke kenmerken van de andere DNA-enzym die DSBs, zoals SaCas9 of Cpf1s induceren, kunnen ook worden verbeterd met behulp van Sniper-scherm. Worden helaas, Sniper-scherm kan niet gebruikt te verhogen van de specificiteit van base redacteuren direct, omdat basis redacteuren doen niet het induceren van DSBs in de genomic DNA van E. coli. Als basis editors de nickase of de versie van de dood van Cas9 in de kern van hun systeem gebruiken, kunnen de specifieke kenmerken van base redacteuren worden verhoogd door gebruik van de hits verkregen Sniper-scherm.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ToolGen heeft ingediend een octrooiaanvraag (PCT/KR2017/006212) die betrekking hebben op Sniper-scherm (status: in behandeling, uitvinder: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung en Euihwan Jeong zijn werknemers van ToolGen, Inc.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en ICT van Korea (2017M3A9B4061406) en de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (subsidie nummers 2017M3A9B4061404 en 2018M3A9H3020844) te Jungjoon K. Lee. Het plasmide codering van pGRG36 was een geschenk van Nancy Craig (Addgene plasmide #16666) en p11-LacY-wtx1 was een geschenk van Huimin Zhao.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)NEBM0290L
Ampicillin Sodium SaltFisher ChemicalBP1760-25
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma Aldrich37919 or 94664
Antibiotic Antimycotic solutionWelgeneLS203-01Media component
BamHIEnzynomicsR003L
ChloramphenicolSigma AldrichR4408
Diversify PCR Random MutagenesisClontech630703Error-prone PCR kit
DNA-Shuffling KitJena BiosciencePP-103
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM001-17Culture media
Endura Electrocompetent Cells (DUO)Lucigen60242-2E. coli electrocompetent cells voor bibliotheekvoorbereiding
Fetal Bovine Serum (FBS)WelgeneS101-01Media component
Gene Pulser IIBio-RadE. coli elektroporeringsapparatuur
GeneMorph II Random Mutagenesis KitAgilent200550Error-prone PCR kit
genomic DNA prep kitGenAll106-152gDNA-prep kit
GlycerolBioShopGLY001.1
GP/MP Cuvette, 0.1cmBio-RadBR165-2089E. coli elektroporeringsapparatuur
HEK293T cellATCCCRL-11268Human cell line
Kanamycin sulfateAcros Organics450810500
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA3256-25G
LaboPass PCR Purification KitCosmogenetechCMR0112
LaboPass Plasmid MiniCosmogenetechCMP0112Mini-prep kit
LB Agar MillerFormediumLMM0202
LB Broth MillerFormediumLMM0102
LipofectamineInvitrogen11668019Transfectiereagens
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LGibson assembly (isothermische in vitro recombinatie) mix
Neon Transfection SystemThermoMPK5000RNP Elektroporeringsapparatuur
Neon Transfection System 10 µL KitThermoMPK1096RNP Elektroporeringsapparatuur
NucleoBond Xtra Midi EFMacherey-Nagel740420.50Midi-prep kit
Oligo Clean & ConcentratorZymo ResearchD4061DNA-zuiveringskit die laagvolume elutie mogelijk maakt
Opti-MEMGibcoLS31985070Transfectiemedia
p11-lacY-wtx1Addgene#123945
pgrg36Addgene#16666E. coli mutator strain
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530L
PyrophosphataseNEBM2403L
Ribonucleotide Solution SetNEBN0450L
RNase inhibitorNEBM0314L
T7 RNA polymeraseNEBM0251L
Turbo DnaseAmbionAM2238
XbaIEnzynomicsR013L
XL1-Red Competent CellsAgilent200129

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
  2. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  3. Chen, J. S., et al. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).
  4. Kleinstiver, B. P., et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).
  5. Slaymaker, I. M., et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  6. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  7. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048(2018).
  8. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  9. Anderson, K. R., et al. CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Nature Methods. 15, 512-514 (2018).
  10. Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Genome Biology. 18 (1), 218(2017).
  11. Kulcsar, P. I., et al. Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage. Genome Biology. 18 (1), 190(2017).
  12. Zhang, D., et al. Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases. Genome Biology. 18 (1), 191(2017).
  13. McKenzie, G. J., Craig, N. L. Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event. BMC Microbiology. 6, 39(2006).
  14. Geissmann, Q. OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects. PLoS One. 8 (2), e54072(2013).
  15. Chen, Z., Zhao, H. A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases. Nucleic Acids Research. 33 (18), e154(2005).
  16. Kim, S., et al. CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells. Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).
  17. Park, J., et al. Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data. Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).
  18. Studier, F. W., et al. Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes. Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Cas9 specificiteitSniper screen systeemGetrunceerde sgRNARibonucleoprote ne formaatVermindering van off target effectenScreening van Cas9 variantenHEK293 T cellen

Gerelateerde artikelen