Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het verwerven van de monsters van de adem van de kinderen. Monsters van gemengde lucht zijn kort, vooraf geconcentreerd in sorptiemiddel buizen vóór gaschromatografie-massaspectrometrie analyse. Adem biomarkers voor infectieuze en niet-infectieuze ziekten kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze methode adem collectie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Adem collectie van kinderen voor ziekte Biomarker ontdekking
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Adem verzameling en analyse kunnen worden gebruikt om te ontdekken van vluchtige biomarkers in een aantal infectieuze en niet-infectieuze ziekten, zoals malaria, tuberculose, longkanker en leverziekte. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare methode voor de bemonstering van de adem in kinderen en adem monsters voor verdere analyse met gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) vervolgens te stabiliseren. Het doel van deze methode is om een gestandaardiseerde protocol voor de verwerving van adem monsters voor verdere chemische analyse, van kinderen in de leeftijd van 4-15 jaar. Ten eerste adem bemonsterd met een kartonnen mondstuk gekoppeld aan een 2-weg klep, die is verbonden met een zak van 3 L. Adem analyten zijn vervolgens overgebracht naar een thermische desorptie-buis en opgeslagen bij 4-5 ° C tot analyse. Deze techniek is eerder gebruikt om vast te leggen van de adem van kinderen met malaria voor succesvolle adem biomerker identificatie. Vervolgens hebben we deze techniek met succes toegepast op extra pediatrische cohorten. Het voordeel van deze methode is dat het vereist minimale samenwerking van de kant van de patiënt (van bijzondere waarde in pediatrische populaties), een korte periode heeft, geen opgeleid personeel vereist en kan worden uitgevoerd met draagbare apparatuur in resource-limited Veldinstellingen.
Inleiding
Biomarkers kunnen waardevolle informatie over normale en pathologische biologische processen die tot klinisch aantoonbare ziekte bijdragen kunnen opleveren. Onlangs, is er toenemende belangstelling voor de evaluatie van adem vluchtige stoffen als biomarkers voor een verscheidenheid van ziekte staten, met inbegrip van infectie, metabole aandoeningen en kanker 1. Uitgeademde adem bevat kwantificeerbare niveaus van vluchtige organische stoffen (VOS), semi-vluchtige organische stoffen en microbially afgeleide materiaal (bijvoorbeeld nucleïnezuren tegen bacteriën en virussen). Het centrale doel van uitgeademde adem analyse is inzicht te krijgen in de status van een medische aandoening en/of milieu vorderingen niet-gebeurt. Er zijn verschillende methoden voor het verzamelen en analyseren van uitgeademde adem, afhankelijk van de kiezers van belang. Er is momenteel geen gestandaardiseerde uitgeademde adem collectie methode, die vergelijkende analyse van de resultaten over studies bemoeilijkt. Standaardisering van de procedures voor het verzamelen van adem is essentieel, aangezien de bemonsteringsprocedure zelf een aanzienlijke effect op de downstream resultaten van analyses van de adem heeft.
In vele studies is laat respiratoire adem bemonstering werknemer2,3. Deze bemonstering omvat teruggooi van het eerste gedeelte van de uitgeademde adem ("dead space"), om te vangen bij voorkeur de lucht aan het einde van de cyclus van de adem. Het voordeel van deze strategie is dat minimaliseert het de niveaus van exogene VOC (bijvoorbeeld milieu Vos), terwijl het verrijken voor endogene, patiënt-specifieke Vos. Deze methode sluit de eerste paar seconden van uitademing van een individu voordat het adem-monster te verzamelen. Andere onderzoekers hebben een druksensor bemonstering tijdens een vooraf gedefinieerde fase van vervaldatum4,5te activeren in dienst. Omdat druksensoren complexe techniek vereist, vereist deze alternatieve methode een specifieke en relatief dure bemonsteringsapparatuur.
Pediatrische adem bemonstering kunnen bijzonder uitdagend. Een sleutelelement is dat jonge kinderen wellicht niet in staat om samen te werken met protocollen voor vrijwillige uitademen van lucht van de "dead space". Om deze reden is het gemakkelijker te verkrijgen van gemengde respiratoire adem van kinderen. Een belangrijke caveat met gemengde respiratoire adem monsters is echter het risico van besmetting van het milieu- en materiaal. Daarom is de haalbaarheid van pediatrische collectie een drijvende zorg in het veld.
Daarnaast, vergaringsmethoden, kan de opslag van adem monsters monster kwaliteit ook beïnvloeden. De hoge luchtvochtigheid in adem exhalate en de ultra-lage concentraties (delen-per-biljoen) van adem van vluchtige organische verbindingen maken adem monsters vooral gevoelig voor problemen in verband met opslag6,7. GC-MS blijft ondanks het grote potentieel van real-time technieken zoals Reactiemassa spectrometrie (PTR-MS) van de overdracht van de proton, de gouden standaard voor de analyse van monsters van de adem. Aangezien GC-MS analyses van monsters van de adem een off line techniek is, gaat het gepaard met pre concentratie methoden zoals thermische desorptie (TD) buizen, vaste fase micro-extractie en naald val-apparaten. Voorafgaand aan de pre concentratie moeten adem monsters worden tijdelijk opgeslagen in polymeer zakken8. Polymeer tassen zijn populair vanwege hun gematigde prijs, relatief goede duurzaamheid en hergebruik. Terwijl zakken kunnen worden hergebruikt, zijn tijd en moeite vereist om ervoor te zorgen efficiënte reiniging7,8. Elk type specifieke zak vereist ook empirisch bepaald en gestandaardiseerde procedures voor kwaliteitscontrole, hergebruik en terugwinning.
TD buizen worden veel gebruikt voor adem pre concentratie omdat zij een groot aantal vluchtige stoffen verzamelen en kunnen worden aangepast. De absorberende materialen gebruikt voor het verpakken van TD buizen kunnen worden aangepast aan de specifieke toepassingen en specifieke doelorgaan vluchtige stoffen van belang. TD buizen aanzienlijk verbeteren van het gemak van adem biomerker studies, met name op extern gebied sites, omdat TD buizen veilig opslaan van adem vluchtige stoffen gedurende ten minste twee weken en zijn eenvoudig te vervoer3.
In een poging om te standaardiseren pediatrische adem-collectie voor de ontdekking van biomarker, beschrijven we hier een eenvoudige methode voor het verzamelen van adem van jonge kinderen. Ter illustratie van de representatieve resultaten van de uitgevoerde protocollen, de geïdentificeerde gegevens worden gepresenteerd tot een cohort behoren, gaande van kinderen (leeftijd 8-17) ondergaan evaluatie voor vetzuur lever ziekte (NAFLD). Volledige uitslag en analyse van deze studie zal in een latere publicatie worden gerapporteerd. In dit werk rapporteren we een deelverzameling van de gegevens te tonen van de toepassing van onze protocol. Kortom, zijn kinderen geïnstrueerd om normaal uitademen via het mondstuk in de zak van een polymeer, alsof "blaast een ballon." Het proces wordt herhaald 2 - 4 keer tot 1 L van adem wordt opgehaald. Het monster is vervolgens overgebracht in een TD-buis en opgeslagen bij 5 ° C vóór de GC-MS-analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De studie is goedgekeurd door de institutionele Review Board van Washington University School of Medicine (#201709030). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van een ouder of wettelijke voogd voorafgaand aan de opname in de studie. Foto's in Figuur 2 gereproduceerd met schriftelijke toestemming van de ouders op de hoogte.
1. adem sampler vergadering
- Gebruik van wegwerphandschoenen, voegt u een kartonnen mondstuk aan de adem sampler, zoals in aanvullende Figuur 1is aangegeven. Hechten een korte lengte van grote diameter buis aan het andere uiterste van de adem sampler, zoals in aanvullende figuur 1. Gebruik nieuwe buizen voor elke patiënt.
- De adem verbindingslijn koppelt aan de klep van de tas via de buis. Zie afbeelding 1 voor foto van de adem sampler en zak aangesloten.
- Zetten van de gekartelde duimschroef aan de zijkant van de montage tegen de klok in om te ontgrendelen de klep inlaat en duw de stam van de klep van de tas, openen de inlaat passend voor bemonstering.
- Vergrendel de klep open, door te draaien aan de gekartelde duimschroef aan de zijkant van de montage met de klok mee inlaat.
- Bevestigen dat het blauwe ventiel op de adem sampler geopend is (parallel met de connector).
- Schrijf patiënt ID, datum en tijd op het etiket van de polymeer-tas.
- Voorwaarde TD sorptiemiddel buis vóór het gebruik van de collectie van de adem aanbevolen procedures (verkrijgbaar bij afzonderlijke fabrikanten). Cap en opslaan van thermische desorptie buizen bij 4-5 ° C vóór adem verzamelen om te minimaliseren van de artefacten.
2. adem collectie
- Een demonstratie van uitademing van de adem aan het kind met behulp van een adem sampler (zonder een zak) uitvoeren. Leg het kind dat ze uitademen moeten zoals ze zou doen wanneer "opblazen van een ballon" en uitademen blijven, zover ze comfortabel kunnen. Zet de kartonnen mondstuk tussen uw lippen en uitademen zo ver als je kunt.
- Het kind te voorzien van een nieuwe adem sampler gekoppeld aan een zak en vraag hen om adem zoals de demonstratie, zoals geïllustreerd in Figuur 2.
- Sluit de blauwe klep op de adem sampler apparaat zodra het kind klaar is met het uitademen. Opnieuw openen het ventiel zo nodig voorafgaand aan extra exhalations.
- Herhaal stap 2.2 en 2.3 totdat ten minste 1 L van adem zijn verzameld. Voor een gezond kind duurt dit 2 exhalations, en voor een zieke of jonger kind 2-4-exhalations. 1 L van adem is de analytische minimumvereiste. Opmerking op de zak etiket hoeveel adem werden verzameld van de patiënt. Zie aanvullende figuur 2 voor een foto van de zak met verschillende volumes van adem.
- Vóór het loskoppelen van de zak van de adem sampler, zorg ervoor dat de gekartelde duimschroef aan de zijkant van de montage door linksom draaien inlaat los en druk op de stam van het ventiel tot sluiten de montage inlaat. Zie aanvullende figuur 3 voor foto van de klep van de tas in de open en gesloten positie.
- Sluit de klep van de tas afgesloten door de gekartelde duimschroef aan de zijkant van de inlaat montage met de klok mee draaien.
- Loskoppelen van de zak van de adem sampler.
- Vervreemden van het mondstuk en de adem sampler opzij te zetten voor het reinigen, voorafgaand aan het gebruik met een andere patiënt.
3. adem overdracht aan thermische desorptie buizen
- Verwijder de TD-buis uit de koelkast. Verwijder de langdurige opslag caps van de sorptiemiddel buis, met behulp van de fabrikant geleverde buis aftopping/uncapping-tool.
- Sluit de gegroefde uiteinde van de TD sorptiemiddel buis aan de bemonsteringszak via buizen. Merk op dat de buis oriëntatie is belangrijk, als TD buizen zijn ontworpen om de lucht stroomt in slechts één richting, vanaf de gegroefde einde. Merk op dat de overdracht van adem uit zak TD binnen 1 uur van adem-collectie gebeuren moet.
- Plaats het andere uiteinde van de buis TD in de buis, die met een pomp verbonden is.
- De pomp inschakelen en instellen op 100 mL/min gedurende 10 minuten worden uitgevoerd.
- Open het ventiel op de zak door de gekartelde duimschroef aan de zijkant van de montage inlaat linksom draaien en druk op de stam van de klep omlaag naar open de montage inlaat. Dit wordt geïllustreerd in aanvullende figuur 4, waaruit blijkt hoe de overdracht van de adem in een TD sorptiemiddel buis met behulp van een pomp.
- Start de pomp, die na 10 min van de collectie stopt.
- Verwijderen van de TD sorptiemiddel buis en schroef de doppen op beide uiteinden met behulp van de buis aftopping/uncapping-tool. Lange termijn opslag caps moeten stevig worden aangescherpt met het oog op een lek-goede afdichting.
- Plaats een sticker op het einde van een GLB om aan te geven dat de buis is gebruikt. Vermeld op de sticker, geduldige studie identificatie (ID) nummer en de datum.
- Plaats de buis in een kleine hersluitbare plastic tas. Winkel sorptiemiddel buis bij 4-5 ° C. Druk op de rest van de adem uit de zak en negeren van de tas. Opnemen van geduldige studie ID, TD tube serienummer, collectie dag, tijd van adem collectie, het tijdstip van de overdracht van de adem en voedselinname (tijd van voedselinname voorafgaand aan adem collectie en verbruikte maaltijden).
4. de lucht-collectie
- Het verzamelen van de monsters van de lucht in de omgeving van de patiënt onmiddellijk na het verzamelen van de adem.
- Hechten de zak aan de pomp retourzijde met behulp van leidingen, zoals geïllustreerd in aanvullende figuur 5.
- Duw de stam van de klep van de tas neer aan open de montage inlaat voor bemonstering.
- Vergrendel de klep open door het draaien van de gekartelde duimschroef aan de zijkant van de montage inlaat.
- De pomp inschakelen en instellen op 100 mL/min gedurende 12 minuten wordt uitgevoerd. De pomp zal verzamelen 1200 mL van de lucht.
- Nadat het gewenste volume is verzameld, los van de gekartelde duimschroef aan de zijkant van de montage door linksom draaien inlaat en druk op de stam van het ventiel tot sluiten de montage inlaat.
- Sluit de klep van de tas afgesloten door het draaien van de gekartelde duimschroef aan de zijkant van de montage inlaat.
- Loskoppelen van de zak van de pomp.
- Volg dezelfde stappen zoals in deel 3. Het enige verschil is dat de lucht vluchtige organische stoffen zal worden overgebracht, niet die van de adem.
5. voorbeeld en data-analyse
Opmerking: Voorwaarden voor analyse van monsters van de adem en door de lucht zijn geweest eerder9beschreven.
- Verzamelde gegevens analyseren en detecteren van verbindingen in de chromatogrammen. Typische software programma's te vinden en identificeren van alle verbindingen die zijn gedetecteerd door het instrument (figuur 3A) gebruiken. Bijvoorbeeld, een deconvolutie-functie gebruiken om te identificeren van verbindingen. Gegevens filteren met behulp van retentie venster grootte factor van 80, massale hoogten filters ≥100 telt, en samengestelde absolute gebied filter ≥500 telt.
- Gebruik chemische standaarden identiteit verbindingen in adem en lucht monsters. Pak de basis ion piekoppervlakte van verbindingen van belang, zoals isopreen en β-pineen (Figuur 4), en vergelijk het gehalte aan vluchtige stoffen in adem en lucht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Adem monsters werden genomen bij 10 kinderen (8-17 jaar oud) ondergaan in onze studie, evaluatie van St. Louis Children's Hospital. Adem monsters en de lucht monsters (n = 10) werden verzameld zoals hierboven beschreven. Monsters werden geanalyseerd met behulp van gaschromatografie vierpolige time-of-flight massaspectrometrie (GC-QToF-MS) en thermische desorptie, als eerder beschreven9. Na verwijdering van achtergrond contaminanten leverde de geïmplementee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ondanks aanzienlijke vooruitgang in adem onderzoek in het afgelopen decennium blijven gestandaardiseerde procedures voor de bemonstering en analyse van adem gas vluchtige stoffen ongedefinieerd10. Een primaire reden voor dit gebrek aan standaardisatie is de diversiteit van de adem vergaringsmethoden, die directe invloed op de resulterende chemische diversiteit in bepaalde uitgeademde adem monster aanwezig hebben geweest. Adem exhalate bevat een uitgebreid scala aan vluchtige organische stoffen op ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We onze dankbaarheid uiten aan de kinderen en de gezinnen van St Louis Children's Hospital, die hebben deelgenomen aan deze studie. Wij erkennen de unieke inspanningen van Ms. Stacy Postma en mevrouw Janet Sokolich bij het verzamelen van de adem. Dit werk wordt ondersteund door de St. Louis Children's Hospital Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Breath bag | SKC | 237-03 | Dit zijn 3 L zakken |
| Karton mondstuk | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Buis met groot diameter | Cole Parmer | 95802-11 | Siliconen slang, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Caps voor lange termijn opslag | Markes International | C-CF010 | Messing opslagdop ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Mannelijke adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Deel 1/3 van ademconnector (1/2" Universeel onderdeel nr. 436-005) |
| Mannelijke adapter (gemaakt van Teflon) | In-house gebouwd | Deel 3/3 van ademconnector (1/4" ID x 1/2" MIP). Dit onderdeel werd speciaal gemaakt van staven gemaakt van virgin Teflon | |
| Pomp | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch met oplader |
| Buis met klein diameter | Supelco | 20533 | Teflon buis L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermische desorptiebuizen | Markes International | C2-CAXX-5314 | Buis, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Gereedschap voor het af- en opdoppen van buizen | Markes International | C-CPLOK | |
| Tweeweg kogelkraan connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Deel 2/3 van ademconnector (1/2") |
Referenties
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of 'breath-taking' methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse? Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
