Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het gebruik van recombinante virussen is in basic of toegepaste Virologie van cruciaal belang geworden. Omgekeerde genetica heeft bewezen een uiterst krachtige technologie, zowel ontcijferen van virale replicatie mechanismen te bestuderen van antivirale middelen of ontwikkelplatform voor vaccins. De bouw en de manipulatie van een omgekeerde genetische systeem voor een negatieve-streng RNA-virus zoals een respiratoir syncytieel virus (RSV), echter blijft gevoelige en speciale kennis vereist. Het RSV genoom is een single-strand, negatief-sense RNA van ongeveer 15 kb dat als een sjabloon voor zowel virale RNA replicatie en transcriptie fungeert. Onze omgekeerde genetica-systeem gebruikt een cDNA kopie van het menselijk genoom van de RSV lange stam (HRSV). Dit cDNA, evenals de cDNAs virale eiwitten van de polymerase van complexe codering (L, P, N en M2-1), worden in afzonderlijke expressievectoren onder T7 polymerase besturingsprocessen geplaatst. De transfectie van deze elementen in de BSR-T7/5 cellen, die stabiel express T7 polymerase, kan men cytoplasmatische replicatie en transcriptie van de recombinante RSV, die aanleiding geven tot genetisch gemodificeerde virionen. Een nieuwe RSV, die aanwezig is op het celoppervlak en in het supernatant van cultuur van BSRT7/5, wordt verzameld om te infecteren menselijke HEp-2 cellen voor virale versterking. Twee of drie rondes van versterking nodig zijn om te verkrijgen van virale bouillon met 1 x 10,6 tot en met 1 x 107 plaque-vormende eenheden (PFU) / mL. Methoden voor de optimale oogsten, bevriezing en titratie van virale voorraden worden hier in detail beschreven. We illustreren het protocol hier gepresenteerd door het creëren van twee recombinante virussen respectievelijk uiten gratis groen fluorescente proteïne (GFP) (RSV-GFP) of virale M2-1 gesmolten tot GFP (RSV-M2-1-GFP). We laten zien hoe met RSV-GFP kwantificeren RSV replicatie en de RSV-M2-1-GFP te visualiseren van virale structuren, evenals de dynamiek van de virale eiwitten in levende cellen, met behulp van video microscopie technieken.
Inleiding
Menselijke RSV is de belangrijkste oorzaak van hospitalisatie voor acute respiratoire landstreekbesmetting in zuigelingen wereldwijd1. RSV is bovendien gekoppeld aan een aanzienlijke ziektelast in volwassenen vergelijkbaar met influenza, met de meeste van de hospitalisatie en sterfte last in de oudere2. Er zijn geen vaccins of specifieke antivirale middelen beschikbaar nog tegen RSV, maar veelbelovende nieuwe drugs zijn in ontwikkeling3,4. De complexiteit en de zwaarte van de technieken van kwantificering van RSV vermenigvuldiging belemmeren de zoekt antivirale m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. materiële voorbereiding
- Cel media kopen (verminderde serum media, minimale essentiële media [MEM], 10 x MEM en Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium [DMEM]), transfectiereagens en microkristallijne cellulose (Zie Tabel van materialen).
- Verkrijgen van de volgende vectoren voor omgekeerde genetica: de genomische vector(s) en de codering van de N-eiwitten en de complexe eiwitten van polymerase expressievectoren. De genomische vectoren bevatten het volledige cDNA genoom van RSV-GFP (p-RSV-GFP) en RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) stroomafwaarts van de bacteriofaag T7 RNA polymerase (T7 pol) promotor. De expressievectoren (uitgeroepen tot ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit werk beschreven we een gedetailleerd protocol voor de productie van recombinante virussen van RSV uiting van een fluorescente proteïne (Figuur 2). In pRSV-GFP, is het GFP-gen tussen de P en M genen, geïntroduceerd als beschreven voor het Cherry gen in eerder gepubliceerde werk21. In de pRSV-M2-1-GFP, de M2 gene was links onaangeroerd en een extra gen dat codeert voor M2-1-GFP werd ingevoegd tussen SH en G genen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier presenteren we een methode van redding van recombinant RSVs van vijf plasmiden en hun versterking. De mogelijkheid om het manipuleren van het genoom van virussen heeft een revolutie teweeggebracht in virologie onderzoek om te testen van mutaties en express een extra gen of een tagged virale eiwitten. Het RSV hebben we beschreven en gebruikt als een voorbeeld in dit artikel een uiting van een verslaggever-gen, de RSV-GFP is (ongepubliceerd), en spreekt een M2-1 eiwit tot een GFP label12 gesmolten
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Dr. Qin Yu van AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, voor het verstrekken van de drug AZD4316. De auteurs zijn dankbaar aan het Cymages platform voor toegang tot de ScanR Olympus Microscoop, die werd ondersteund door subsidies uit de regio Ile-de-France (DIM Eén gezondheid). De auteurs erkennen steun van het INSERM en de Universiteit van Versailles Saint-Quentin.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 35 mm µ schaal voor live cel beeldvorming | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technische en andere informatie over Avicels is beschikbaar op http://www.fmcbiopolymer.com. Bewaren bij kamertemperatuur. Protocol in stap 4 is geoptimaliseerd voor dit reagens. |
| BSRT7/5 | niet commercieel verkrijgbaar | Zie referentie 22. Buchholz et al. 1999 | |
| Kristal violet oplossing | Sigma | HT90132 | |
| Fluorescentiemicroscoop voor observaties | Olympus | IX73 Olympus microscoop | |
| Fluorescentiemicroscoop voor videomicroscopie | Olympus | ScanR Olympus microscoop | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99,5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in stap 2.3. is geoptimaliseerd voor dit reagens. |
| MEM (10x), geen glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥99,5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmids | niet commercieel verkrijgbaar | Zie referentie 21. Rameix-Welti et al. 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 | SMARTpool en 3 van de 4 individuele siRNA's ontworpen door Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 | SMARTpool van 4 individuele siRNA's ontworpen door Dharmacon. Individuele referenties en sequenties J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU en UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA transfectiereagens | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in stappen 5.1. en 5.1.2 zijn geoptimaliseerd voor dit reagens. |
| Natriumbicarbonaat 7,5% oplossing | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
Referenties
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
