Dit protocol beschrijft zowel in vivo-als ex vivo-methoden om hyaloïde vaten volledig te visualiseren en karakteriseren, een model van vasculaire regressie in muis ogen, met behulp van optische coherentie tomografie en fundus fluoresceïne angiografie voor de Live Imaging en ex vivo isolatie en daaropvolgende vlakke houder van hyaloïde voor kwantitatieve analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling en karakterisering van Hyaloïde vaten bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In het oog voeden de embryonale hyaloïde vaten de ontwikkelende lens en het netvlies en regressie wanneer de retinale bloedvaten zich ontwikkelen. Aanhoudende of mislukte regressie van hyaloïde vaten kan worden gezien bij ziekten zoals persistent hyperplastische primair glasvocht (PHPV), wat leidt tot een belemmerd lichtpad en een verminderde visuele functie. Inzicht in de onderliggende mechanismen van de hyaloïde bloedvat regressie kan leiden tot nieuwe moleculaire inzichten in het vasculaire regressie proces en potentiële nieuwe manieren om ziekten met aanhoudende hyaloïde vaten te beheersen. Hier beschrijven we de procedures voor het beeldvormende mellitus in levende muizen met optische coherentie tomografie (OCT) en fundus fluoresceïne angiografie (FFA) en een gedetailleerd technisch protocol van isolerende en platte mellitus ex vivo voor kwantitatieve analyse. Low-density lipoproteïne receptor-gerelateerde proteïne 5 (LRP5) Knockout muizen werden gebruikt als een experimenteel model van aanhoudende hyaloïde vaten, ter illustratie van de technieken. Samen kunnen deze technieken een grondige beoordeling van hyaloïde vaten mogelijk maken als een experimenteel model van vasculaire regressie en studies over het mechanisme van aanhoudende hyaloïde vaten.
Inleiding
De bloedtoevoer in het oog is essentieel om de normale ontwikkeling van het netvlies en de omringende oculaire weefsels te waarborgen en een goede visuele functie uit te rusten. Er zijn drie vasculaire bedden in het oog: de retinale vasculatuur, de choroid en een voorbijgaande embryonale circulatie netwerk van hyaloïde vaten. De ontwikkeling van de oculaire vasculatuur vereist ruimtelijke en temporele coördinatie in de gehele embryogenese en weefsel rijping. Onder de drie vasculaire bedden is de mellitus vasculatuur het eerste functionele bloedtoevoer systeem dat voeding en zuurstof levert aan de nieuw gevormde embryonale lens en het ontwikkelende netvlies. Hyaloïde v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de verklaring van de vereniging voor onderzoek in visie en oogheelkunde (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en visie onderzoek voor dierproeven, volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health ( NIH) met betrekking tot de verzorging en het gebruik van dieren voor experimentele procedures en de verordeningen die zijn uiteengezet door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) in het Boston Children's Hospital. Lrp5-/- muizen (stock nr. 005823; Jackson Laboratory) en zijn wild-type (WT) Control C57BL/6J muizen (stock nr. 000664; Jackson Laboratory) werden ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In vivo beeldvorming van hyaloïde vaten in levende muizen
Figuur 3 A onthult transversale beelden van Oct-afbeeldingen voor de retina en hyaloïde weefsels in 3 maanden oude WT en Lrp5-/-muizen, een diermodel met aanhoudende hyaloïde. De WT oog toont de afwezigheid van mellitus weefsel, terwijl de Lrp5-/-Eye toont twee hardnekkige hyaloïde vaten afgeleid van de oogzenuw hoofd. Figuur 3 <.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Technieken voor het beoordelen en karakteriseren van hyaloïde schepen zijn intuïtieve en noodzakelijke procedures om de mellitus-bloedvat regressie in diermodellen te observeren, om studies mogelijk te maken over de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vasculaire regressie tijdens de ontwikkeling. Terwijl de in vivo retinale beeldvorming de longitudinale observatie van hyaloïde regressie in hetzelfde dier toestaat, kan de toegang tot een knaagdier fundus Imaging System voor OCT en FFA een beperkende factor zijn. B.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies (R01 EY024963 en EY028100) aan J.C. Z.W. werd gesteund door een Knights Templar Eye Foundation Career starter subsidie. De hyaloïde isolatie procedure beschreven in deze studie werd aangepast met modificatie van protocollen royaal gedeeld door drs. Richard lang, Toshihide Kurihara, en Lois Smith, aan wie de auteurs zijn dankbaar.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AK-Fluor (fluorescein injectie, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antilichaam | Abcam | ab28364 | |
| Antifade montagemedium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Montage Medium met DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Kunstmatig traanoogdruppel | Systane | N/A | |
| Rund serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J muizen | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride en phenylephrine hydrochloride oogdruppel | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Geit anti-Konijn IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Verwarmingsplaat | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594-conjugaat | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injectie | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- muizen | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Ontwikkeld door Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV en OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Beeldvormingssoftware: InSight |
| Microscoop | Zeiss | discovery v8 | |
| Microchirurgietang | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microchirurgische schaar | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimaal snijtemperatuurscompound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimaal snijtemperatuurscompound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way wegwerp inbeddingsvormen (weefselvormen) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Glazen deksel voor objectglaasjes | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscoopobjectglaasjes | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine steriele oplossing | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
Referenties
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and it....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
