Methodenartikel

Belangrijke eindpunten en proliferatieve markers om kleine darm letsel en aanpassing te beoordelen met behulp van een muis model van chemotherapie-geïnduceerde Mucositis

DOI:

10.3791/59236

⸱

12 mei 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het vaststellen van belangrijke eindpunten en proliferatieve markers van kleine intestinale letsel en compenserende hyperproliferatie met behulp van een model van chemotherapie-geïnduceerde mucositis. We demonstreren de detectie van prolifererende cellen met behulp van een celcyclus specifieke marker en met behulp van kleine intestinale gewicht, crypte diepte, en villus hoogte als eindpunten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intestinale adaptatie is het natuurlijke compenserende mechanisme dat optreedt wanneer de darm verloren gaat als gevolg van trauma. De adaptieve reacties, zoals crypte celproliferatie en verhoogde nutriënten absorptie, zijn van cruciaal belang in herstel, maar slecht begrepen. Inzicht in het moleculaire mechanisme achter de adaptieve responsen is cruciaal om de identificatie van nutriënten of geneesmiddelen te vergemakkelijken om de aanpassing te verbeteren. Verschillende benaderingen en modellen zijn beschreven in de hele literatuur, maar een gedetailleerde beschrijvende manier om de procedures in wezen uit te voeren is nodig om reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Hier beschrijven we een methode om belangrijke eindpunten en proliferatieve markers van kleine darm letsel en compenserende hyperproliferatie te schatten met behulp van een model van door chemotherapie geïnduceerde mucositis bij muizen. We demonstreren de detectie van prolifererende cellen met behulp van een celcyclus specifieke marker, evenals met behulp van kleine intestinale gewicht, crypte diepte, en villus hoogte als eindpunten. Enkele van de kritische stappen binnen de beschreven methode zijn het verwijderen en wegen van de dunne darm en het nogal complexe software systeem dat wordt voorgesteld voor de meting van deze techniek. Deze methoden hebben de voordelen dat ze niet tijdrovend zijn en dat ze kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren en te meten zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intestinale adaptatie is het natuurlijke compenserende mechanisme dat optreedt wanneer de darm verloren gaat als gevolg van ziekte of chirurgie1,2. Na trauma, de darm ondergaat een Morfometrische en functionele adaptieve reactie, gekenmerkt door de proliferatie van crypte cellen en verhoogde nutriënten absorptie3. Deze stap is van cruciaal belang in herstel, maar slecht begrepen. Experimentele studies van de intestinale adaptieve respons zijn gericht op de veranderingen die zich voordoen na de kleine darm resectie bij muizen, ratten en varkens, maar inzicht in het moleculaire mechanisme achter de adaptieve respons bij andere soorten verwondingen (bijv. chemische of bacteriële) is van cruciaal belang om de identificatie van voedingsstoffen of drugs te vergemakkelijken aanpassing. Experimenteel zijn verschillende benaderingen gebruikt om de complexe moleculaire en cellulaire index van kleine intestinale pathologie te beschrijven, waaronder histopathologische scoring en het meten van de uitkomst van letsel. Desondanks is wat afwezig is in de literatuur een gedetailleerde beschrijving van het uitvoeren van de procedures die nodig zijn om reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Bij het identificeren van factoren die betrokken zijn bij de aanpassing, zoals gut hormonen, een gemakkelijk, lage kosten, en reproduceerbare diermodel is gerechtvaardigd en hier raden wij het gebruik van een model van chemotherapie-geïnduceerde intestinale mucositis (CIM).

Een van de eenvoudigste en zeer informatieve eindpunten van zowel letsel en aanpassing is het meten van de massa van de dunne darm (SI). We weten dat een kenmerk van mucositis is apoptosis van enterocyten, tijdafhankelijke villus atrofie en verminderde mitose. Daarom is het onderzoeken van de darm morfologie zeer relevant in preklinische modellen4,5. Bij de mens, een afname van het plasma citrulline, een marker van functionerende enterocyten, correleert met toxiciteit scores en inflammatoire markers6 naast de absorptiecapaciteit7, suggereren dit aminozuur is een uitstekende biomarker van mucositis. Citrulline kan worden gemeten in zowel muizen en ratten, en heeft aangetoond uitstekende correlaties met villus lengte8, Crypt Survival9, en straling-geïnduceerde mucositis10.

Een groot voordeel van het meten van plasma citrulline is de mogelijkheid om herhaalde metingen te verzamelen van een dier. Meervoudige bloedafname bij muizen is echter beperkt tot een totaal bloed volume van 6 μL/g/week en vereist algemene anesthesie. Dit helaas ook beperkt het gebruik van citrulline metingen bij muizen. Bovendien, de meting van citrulline vereist High-Performance vloeibare chromatografie11,12, dat is kostbaar en tijdrovend. Onlangs, we hebben aangetoond dat citrulline niveaus in muizen correleren significant met SI gewicht (p < 0,001) (niet-gepubliceerde gegevens), waardoor citrulline een directe meting reflecterend enterocyten massa. Een beperking tot de meting van het SI-gewicht is de noodzaak om de muizen op te offeren en dus zijn er geen herhaalde metingen binnen dezelfde muis mogelijk. Toch biedt de methode de mogelijkheid om verschillende andere weefsel analyses uit te voeren die gericht zijn op de onderzoeksvraag, en deze feiten kunnen denkbaar zijn voor het extra gebruik van dieren. We raden daarom aan om SI-gewicht te gebruiken als een eenvoudige, goedkope en snelle biomarker voor letsel en aanpassing aan muizen. Om de reproduceerbaarheid en aanvaardbare analytische variatie te garanderen, moeten de darmen zorgvuldig worden verwijderd uit het dier, gespoeld met zout, geleegd en gedroogd vóór het wegen. In dit artikel laten we precies zien hoe deze procedure wordt uitgevoerd.

Een ander kenmerk van mucositis is het verlies van de prolifererende cellen in de crypten en een compenserende hyperproliferatie tijdens de regeneratieve periode3. De cellulaire marker Ki67 is vaak gebruikt om snelle proliferatieve cellen te bepalen door middel van immunohistochemie13. Hoewel Ki67 een eenvoudige marker van proliferatie is, heeft het een neiging tot onnauwkeurigheid omdat Ki67 aanwezig is tijdens alle actieve fasen van de celcyclus (G1, S, G2 en M)14. Specifieke etikettering is essentieel voor het opsporen van replicerende cellen, daarom stellen we voor in situ-integratie van 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU), een synthetisch analoog van thymidine, omdat het grotendeels beperkt is tot het repliceren van cellen in de S-fase15. BrdU wordt geïnjecteerd in de dieren 150 minuten voor het offeren en cellen kunnen vervolgens worden gedetecteerd met immunohistochemie met behulp van BrdU specifieke antilichamen. In deze methode artikel laten we precies zien hoe het gebied van BrdU immunopositive cellen binnen een crypte meten met behulp van een gratis beeld software.

Morfologische en functionele veranderingen worden vaak bestudeerd in 5-FU geïnduceerde mucositis modellen, waar de intestinale adaptatie wordt beoordeeld door villus hoogte en crypte diepte. Tijdens deze studie ontdekten we dat tijdens de acute fase van mucositis, die gelijk is aan de blessure fase, proliferatie gemeten door BrdU-opname niet gecorreleerd is met crypte diepte. In tegenstelling tot deze, crypte diepte is significant gecorreleerd met proliferatie gezien in de reparatiefase van mucositis, 3 tot 5 dagen na inductie. Dit suggereert dat de acute fase van mucositis niet meetbaar is door de crypte diepte alleen. We stellen voor dat bij het gebruik van proliferatie als een eindpunt in de acute fase van mucositis muizen, BrdU-opname bij voorkeur moet worden gebruikt, maar bij het kwantificeren van Hyper proliferatie in het latere stadium tijdens de regeneratieve fase, is de crypte diepte een redelijke alternatief voor de oprichting van BrdU. Het doel van deze studie was om dit model te beschrijven op een manier dat het kan worden gebruikt door alle onderzoekers, zowel op het gebied van oncologie, maar vooral onderzoekers niet bekend met intestinale schademodellen.

Het beschreven model kan worden gebruikt om fenotype transgene modellen volgens de adaptieve respons met behulp van lichaamsgewicht, SI gewicht en crypte diepte als eindpunten. Als voorbeeld laten we hier zien hoe we het model van 5-fluorouracil (5-FU) geïnduceerde mucositis hebben gebruikt in een cellulair knock-out model met onvoldoende L-cel secretie16. Glucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) en glucagon-achtige peptide-2 (GLP-2) zijn intestinale hormonen die worden afgescheiden van de enteroendocrine L-cellen in reactie op voedselinname17,18. GLP-2 wordt erkend als een belangrijke factor voor intestinale genezing, de regulering van mucosale apoptosis en de verbetering van de barrièrefunctie van de si19,20,21,22. Op basis van de literatuur veronderstellen we dat endogene hormonen essentieel zijn voor compenserende hyperproliferatie die zich voordoet in de adaptieve reactie na letsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle beschreven methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Deense wetgeving inzake dierproeven (1987). Studies werden uitgevoerd met toestemming van de Deense Animal experimenten inspectie (2013-15-2934-00833) en de lokale ethische commissie.

Opmerking: vrouwelijke C57BL/6J muizen (~ 20 − 25 g) werden verkregen en ondergebracht acht per kooi in standaard 12 h licht, 12 uur donkere cyclus met gratis toegang tot water en standaard Chow. Dieren werden overgelaten aan acclimatiseren voor een week voordat experimenten begon.

1. inductie van mucositis met 5-fluorouracil

  1. Verkrijg 5-fluorouracil (5-FU) in een 50 mg/mL oplossing.
  2. Weeg en noteer het lichaamsgewicht van de muizen. Bereken uit het lichaamsgewicht de hoeveelheid 5-FU voor injectie (bijv. 400 mg/kg).
  3. Bereid een spuit van 1 mL die is aangesloten op een naald van 27 G x 30 mm en vul de spuit met de berekende hoeveelheid 5-FU voor injectie.
  4. Restrain de muis door de Scruff-methode. Om dit te doen, pak je de voet van de staart met de ene hand en plaats je hem op een toegrijpend oppervlak, zoals een Draadstang deksel. Houd bij het positioneren van de staart met één hand de Scruff van de nek vast met de andere hand.
  5. Plaats het lichaam van de muis stevig in de ene hand door de wijsvinger en de duim zo ver mogelijk uit te breiden. Plaats de staart tussen de vingers van dezelfde hand om de muis te beveiligen.
  6. Terwijl het behoud van de muis in een stevige maar zachte grip, bloot de ventrale kant van de muis en steek de naald in de intraperitoneale holte in de rechterbenedenhoek of linker kwadrant van de buik. Aspirate om te zorgen voor een juiste plaatsing en Injecteer de 400 mg/kg 5-FU.

2. weefsel inzameling

  1. Anesthetiseer de muis met een intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (100/10 mg/kg) verdund in zoutoplossing (0,9% NaCl). Bewaak de diepte van de anesthesie door de knijp opname reflex te observeren.
    Opmerking: de anesthesie is een niet-herstel anesthesie.
  2. Noteer het gewicht van de verdoofd Mouse.
  3. Plaats de muis in een liggende positie en voer een laparotomie uit om de buikholte bloot te leggen, gevolgd door een incisie van de borstholte om pneumothorax te introduceren.
  4. Met een schaar het dier opofferen door het diafragma open te snijden.
  5. Verwijder de dunne darm. Snijd superieur aan de pylorus, Trek voorzichtig de dunne darm weg van het karkas totdat de blindedarm is bereikt en maak een snede vlak voor de blindedarm.
  6. Met behulp van een tang, klem het proximale lumen dicht. Met behulp van een 1 mL spuit met een 25 G naald bevestigd, spoelen van de dunne darm met zoutoplossing om de ontlasting te verwijderen.
  7. Verwijder voorzichtig de zoutoplossing uit de intestinale lumen met chirurgische instrumenten.
  8. Plaats de dunne darm op schoon blotting papier om overtollige zoutoplossing voorzichtig te verwijderen.
  9. Noteer het gewicht van het geflushed weefsel.
  10. Bereken het gespoede kleine darm gewicht als een percentage van het lichaamsgewicht.

3. kleine darm histologie

  1. Weefsel preparaat
    1. In een rook afzuigkap gebruik je een schaar om 3 cm delen van het gespoeld darmweefsel van elke muis uit de twaalfvingerige darm, jejunum en ileum en fixeren secties in 10% formaline voor 24 uur op kamertemperatuur te knippen.
      Opmerking: het fixatieve volume moet 5 − 10 keer van het weefsel volume zijn.
    2. Breng het vaste weefsel over naar een snijplank.
    3. Gebruik een scalpel om het weefsel op ongeveer 1 cm af te snijden en over te brengen naar een insluitings cassette.
      Opmerking: de cassette moet worden geëtiketteerd met de identificatie (ID) van het monster in potlood.
    4. Dompel de cassette onder in 70% ethanol en bewaar deze bij 4 °C tot verdere verwerking.
  2. Weefsel insluiten in paraffine
    1. Dehydraat het weefsel door in oplopende alcohol oplossingen te plaatsen. Plaats de cassette in 70% ethanol voor 1 uur, gevolgd door 80% ethanol voor 1 uur, 95% ethanol voor 1 uur en 100% ethanol voor 1,5 h. Breng de cassette over van 100% ethanol naar xyleen voor 1,5 h.
    2. Dompel de cassette onder met paraffinewas, verhit tussen 58 − 60 °C. Gebruik de tang om het weefsel in een dwarse oriëntatie te positioneren en laat de blokken meer dan 24 uur afkoelen tot ze vast zijn.
  3. Snij weefsel met behulp van een microtoom
    1. Plaats blok, weefsel gezicht naar beneden op ijs voor 5 min. met behulp van een microtoom, trim de paraffineblokken met een dikte van 10 − 30 μm om het weefseloppervlak bloot.
    2. Snijd dwarsdoorsneden van het weefsel blok tussen 3 − 5 μm, waardoor dwarse delen van de twaalfvingerige darm, het jejunum en het ileum.
    3. Plaats paraffine lint in een waterbad tussen 40 − 45 °C. Gebruik de tang om de secties te scheiden.
    4. Gebruik Microscoop-dia's om de secties uit het water te halen.
    5. Lucht droog de glaasjes 30 minuten voor de kleuring.
      Opmerking: Bewaar dia's in een koelkast voor opslag over een langere periode.
  4. Hematoxyline-eosine kleuring van weefsel
    1. Plaats de Microscoop glaasjes in een histologie houder. Deparaffiniseer de glaasjes in een verwarmings kast ingesteld op 60 °C gedurende 60 min.
      Opmerking: Dia's rechtstreeks vanuit de koelkast moeten worden achtergelaten om op kamertemperatuur te komen alvorens ze in een verwarmings kast te plaatsen.
    2. In de afzuigkap, Hydrateer het weefsel in 3 veranderingen van een clearing agent (tabel van de materialen), maak 20 dips in de eerste clearing agent jar en laat ze staan voor 7 − 8 min in elk van de twee extra clearing agent potten. Breng de dia's over naar dalende alcohol oplossingen, begin met 3 veranderingen van 99% ethanol, gevolgd door 2 veranderingen van 96% ethanol en 70% ethanol. Maak in elke pot minimaal 20 dips. Breng over naar stromend water en laat de dia's 5 minuten staan.
    3. Dompel de dia's gedurende 1 minuut onder in gefilterde Meyer's hematoxyline.
    4. Was de monsters gedurende 5 minuten in stromend kraanwater.
    5. Dompel de delen in de eosine vlek gedurende 1 − 2 min en spoel vervolgens in kraanwater.
    6. Dehydraat het weefsel door in oplopende alcohol oplossingen te plaatsen. Begin met 70% ethanol, gevolgd door 96% ethanol, 96% ethanol en 4 keer 99% ethanol. Maak in elke pot minimaal 20 dips en laat de houder in 99% ethanol staan totdat deze gemonteerd is.
    7. Monteer de dekstroken door een kleine hoeveelheid van het afdekmedium toe te passen op het oppervlak van de dia's. Zet de Afdeklijst bovenop het afdekmedium zonder dat er bellen onder de dekslip ontstaan. Laat het drogen voor 24 h.
    8. Onderzoek het weefsel met een lichtmicroscoop die is aangesloten op een camera om histologische Foto's te verkrijgen. Gebruik een 10x-doelstelling om snapshots te maken totdat een volledige dekking van de weefsel glijbaan is bereikt.

4. meting van de crypte diepte en/of villus hoogte

  1. Download en installeer de analyse software (dat wil zeggen, Zen Lite, tabel met materialen).
  2. Open de afbeelding in de software en maak verbinding met de camera. Maak snapshots in de cameramodus met 20x Objective.
  3. Open de momentopname in de verwerkingsmodus.
  4. Om de crypte diepte te meten: Selecteer in de 2D-weergavehet gereedschap lijn op het tabblad afbeeldingen. Kies een goed georiënteerde crypte en begin de lijn aan de onderkant van een villus en eindig aan de onderkant van de crypte. Herhaal deze actie voor 20 goed georiënteerde crypten (aanvullend figuur 1).
  5. De villus-hoogte meten: Selecteer in de 2D-weergavehet gereedschap lijn op het tabblad afbeeldingen. Kies een goed georiënteerde villus en start de lijn aan het einde van de luminal-projectie en eindig aan het begin van de crypte. Herhaal deze actie voor 20 goed georiënteerde Villi (aanvullend figuur 1).
  6. Overschakelen van de 2D-weergave naar de meet weergave om de metingen weer te geven.
  7. Exporteer de metingen en bereken het gemiddelde van de crypte diepte en villus hoogte.

5. BrdU kwantificering (proliferatie) door immunohistochemie

  1. Injectie van de BrdU-oplossing
    1. Weeg en noteer het lichaamsgewicht van de muizen.
    2. Bereid in een rook afzuigkap een representatieve hoeveelheid van 0,5% w/v bromodeoxyuridine (BrdU)-oplossing in fosfaatgebufferde Saline (PBS).
    3. Injecteer in de damp afzuigkap 50 mg/kg BrdU door intraperitoneale injectie.
      Opmerking: om ervoor te zorgen dat elke muis op exact 150 min na BrdU-injectie wordt geëuseerd, injecteert u elke afzonderlijke muis achter elkaar met een interval van 10 − 20 minuten daartussenin om de weefsel verzameling goed uit te voeren.
    4. Noteer het tijdstip van de injectie.
    5. Wacht 150 min, vervolgens anesthetiseer muizen en verzamel het weefsel zoals beschreven in stap 2.1 − 2.7. Voer BrdU immunohistochemie uit zoals beschreven in paragraaf 5,2.
  2. BrdU immunohistochemie
    1. Bereid het weefsel voor zoals beschreven in de stappen 3.1.1 − 3.3.4.
    2. Voor het ophalen van antigeen, plaats een slede houder met de secties in een glazen histologie pot en vul deze met de EDTA-buffer (pH 9) in een magnetron gedurende 1 minuut bij 750 W gevolgd door 9 min bij 350 W. Herhaal cyclus.
      Opmerking: Zorg ervoor dat het weefsel niet uitdroogt, wat mogelijk meer buffer aan de potten tussen verwarming moet toevoegen.
    3. Was de secties 2 − 3 keer in een tris-buffered saline en Polysorbaat 20 (TBS-T) buffer voor elk 3 min.
    4. Breng 5 druppels peroxide blok (tabel met materialen) gedurende 10 − 15 min bij kamertemperatuur aan om de endogene peroxidase activiteit te blokkeren. Was secties 2 − 3 keer in TBS-T buffer voor 3 min elk.
    5. Breng 5 druppels knaagdier blok buffer (tabel met materialen) gedurende 30 min bij kamertemperatuur, om niet-specifieke binding te blokkeren. Was secties 2 − 3 keer in TBS-T buffer voor 3 min elk.
    6. Inbroed de delen met een monoklonale muis anti-BrdU antilichaam verdund 1:500 voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was secties 2 − 3 keer in TBS-T buffer voor 3 min elk.
    7. Visualiseer immunopositivity met 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) door 5 druppels mierikswortelperoxidase toe te passen op elke dia en gedurende 15 minuten op kamertemperatuur te inbroed. Breng de secties over naar een rook afzuigkap, Voeg 150 μL DAB toe en inbroed gedurende 5 minuten.
      Let op: Draag altijd handschoenen bij het hanteren van DAB en gooi het afval op de juiste manier weg.
    8. Spoel secties in gedeïoniseerd water.
    9. Dehydraat het weefsel en monteer een dekslip zoals beschreven in de stappen 3.4.6 en 3.4.7.
  3. Visualisatie van de immunoreactions
    1. Visualiseer het weefselmonster met een lichte Microscoop die is aangesloten op een camera.
    2. Gebruik de analyse software om Microscoop-afbeeldingen te verkrijgen met een 20x-doelstelling van alle secties en sla bestanden op in de. JPG-indeling.
    3. Maak een momentopname van een stage-micrometer met een 20x-doelstelling, die wordt gebruikt als kalibratie tool in ImageJ-software.
  4. Meten van de oppervlakte van BrdU immunoreactieve cellen
    1. Installeer ImageJ-software (tabel met materialen).
    2. Schaal toewijzen aan een afbeelding in ImageJ: de installatiekopie van de stage-micrometer openen met het ImageJ- bestand | Menuopdracht openen. Selecteer het gereedschap voor het selecteren van rechte lijnen.
    3. Selecteer het rechte gereedschap en teken een rechte lijn op de micrometer afbeelding om een bekende afstand te definiëren.
    4. Selecteer schaal instellen onder het menu analyseren .
    5. Voer een waarde in het vak bekende afstand in en definieer de lengte eenheid in het vak lengte eenheid . Selecteer globaal zodat deze kalibratie van toepassing is op alle afbeeldingen die in deze imagej-sessie worden geopend.
    6. Een afbeelding van belang openen met het ImageJ- bestand | Open menuopdracht om het gebied van de BrdU immunoreactieve cellen per crypt te meten.
    7. Stel de kleuren afbeeldingen in op 8-bits onder het menu afbeelding/type .
    8. Verhoog het contrast van de afbeelding onder proces/verbeter contrast en stel de verzadigde pixels in op 0,4%.
    9. Breng een drempel aan op de afbeelding om de immunopositiviteit te segmenteren. Selecteer afbeelding/aanpassen onder menu, dan Threshold en selecteer de kleur rood (donker gebied weergegeven in rood). Kies een drempelwaarde van ongeveer 10 − 20% door de drempel balk te verplaatsen.
      Opmerking: Kies een drempel die alle BrdU-positieve cellen met zo weinig mogelijk achtergrond bevat. Het gekozen percentage moet van toepassing zijn op alle secties.
    10. Kies een goed georiënteerde crypte, d.w.z. een complete crypte van intact weefsel, en selecteer de vrije hand selectietool om het gebied eromheen te markeren.
    11. Om het drempel gebied te meten, selecteert u het tabblad analyseren , gevolgd door het analyseren van deeltjes. Stel in het venster deeltjes analyseren de grootte in op 20-oneindig, klik op het vak pixeleenheden, stel Circulariteit in op 0.00 − 1.00en stel tonen in op contouren. Klik op vakken om resultaten weer te geven, samen te vattenen gaten op te nemen.
      Opmerking: de waarden voor BrdU-positieve cellen worden automatisch gegenereerd in een resultaatvenster, waarbij de individuele metingen voor elke BrdU-positieve cel worden weergegeven. Bovendien wordt automatisch een Overzichtsvenster gegenereerd, met het aantal tellingen, het totale oppervlak, de gemiddelde grootte en het percentage van het gebied met BrdU-positieve cellen.
    12. Herhaal stap 5.4.10 en 5.4.11 om een nieuwe crypte te meten. De resultaten van alle gemeten crypten zullen worden weergegeven in het overzichts venster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het eerste experiment hebben we mucositis geïnduceerd bij muizen op dag 0 en elke dag 5 opeenvolgende dagen een groep muizen opgeofferd. Bij het meten van de SI gewicht, we vonden dat deze parameter daalde van dag 2 tot dag 4 suggereren een verlies in de enterocyt massa. We constateerden ook dat het SI-gewicht op dag 5 niet significant verschilt van dag 0 (onbehandelde muizen) (Figuur 1). De proliferatie gemeten door de opname van BrdU werd bijna afgeschaf...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstreren we een breed toegankelijke methode om SI-letsel en regeneratie in een muismodel te bestuderen. Een breed scala van preklinische dierlijke modellen van intestinale letsel bestaan, maar het is van vitaal belang dat we begrijpen dat elk model uniek is en dat de eindpunten geschikt moet zijn om de onderzoeksvraag te beantwoorden. Dit model is uitstekend om te studeren adaptieve reactie op letsel, maar de eindpunten moeten worden gewijzigd bij het gebruik van het model als een pre-klinische model van mucosit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door een onbeperkte subsidie van het Novo Nordisk Center voor fundamenteel metabolisch onderzoek en de Stichting Lundbeck.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-FluorouracilHospira Nordic AB, Zweden137853
Ketaminol®VetMerck, New Jersey, USA511485
Rompun®Vet XylazineRompunvet, Bayer, Leverkusen, Duitsland148999
10% nautral formaline bufferCell Path Ltd, Powys, Verenigd KoninkrijkBAF-5000-08A
HistoClearNational Diagnostics, Verenigd KoninkrijkHS-200
PertexHistoLab®, Zweden840
BrdUSigma-Aldrich, Duitsland.B5002
Tris/EDTA pH 9 bufferThermofisher scientific, DenemarkenTA-125-PM4X
Peroxide BlockUltravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, DenemarkenTL-060-QHDM
Rodent Block bufferUltravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, DenemarkenTL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibodyThermofisher Scientific, Denemarken.MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP QuantoThermofisher Scientific, Denemarken.TA-125-ADQ
Horseradish peroxidaseUltravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, DenemarkenTL-060-QHDM
DAB Quanto SubstrateDAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, DenemarkenTA-125-QHDX
DAB Quanto ChromogenDAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, DenemarkenTA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition)Carl Zeiss A/Shttps://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ SoftwareLOCI, University of Wisconsinhttps://imagej.nih.gov/ij/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
  2. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
  3. Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
  4. Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
  5. Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
  6. Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
  7. Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
  8. Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
  9. Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
  10. Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
  11. Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
  12. van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
  13. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  14. Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
  15. Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
  16. Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046(2018).
  17. Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
  18. Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
  19. Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
  20. Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
  21. Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
  22. Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
  23. Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
  24. Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
  25. Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
  26. Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BrdU incorporatiecryptdieptemetingvillushogte analysegewicht van de dunne darmhistologische verwerkingImage J analyse

Gerelateerde artikelen