Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Volwassen neurogenese is een dynamisch proces waarbij nieuw geactiveerde neurale stamcellen (nscs) in de subgranulaire zone (sgz) van de getand gyrus (DG) nieuwe neuronen genereren, die integreren in een bestaand neurale circuit en bijdragen aan specifieke hippocampal functies . Belangrijk, volwassen neurogenese is zeer gevoelig voor milieu stimuli, die het mogelijk maakt voor activiteit afhankelijke regulering van verschillende cognitieve functies. Een breed scala van neurale circuits uit verschillende hersengebieden organiseert deze complexe cognitieve functies. Het is daarom belangrijk om te begrijpen hoe specifieke neurale schakelingen volwassen neurogenese reguleren. Hier beschrijven we een protocol voor het manipuleren van neurale circuit activiteit met behulp van Designer receptor uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) technologie die NSCs en pasgeboren nakomelingen bij knaagdieren reguleert. Dit uitgebreide protocol omvat stereotaxic injectie van virale deeltjes, chemogenetische stimulatie van specifieke neurale circuits, thymidine analoge toediening, weefsel verwerking, immunofluorescentie labeling, confocale beeldvorming en beeldvorming analyse van verschillende stadia van neurale precursor cellen. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies over de technieken voor het ophalen van antigeen die worden gebruikt om NSCs en hun nakomelingen te visualiseren en beschrijft een eenvoudige, maar effectieve manier om hersencircuits te moduleren met behulp van Clozapine N-oxide (CNO) of CNO-bevattende drinkwater en DREADDs-het uiten van virussen. De kracht van dit protocol ligt in het aanpassingsvermogen om een breed scala aan neurale circuits te bestuderen die invloed hebben op volwassen neurogenese die zijn afgeleid van NSCs.
Inleiding
Volwassen neurogenese is een biologisch proces waarbij nieuwe neuronen worden geboren in een volwassene en geïntegreerd in de bestaande neurale netwerken1. Bij de mens, dit proces vindt plaats in de getand gyrus (DG) van de hippocampus, waar ongeveer 1.400 nieuwe cellen worden geboren elke dag2. Deze cellen bevinden zich in het binnenste gedeelte van het DG, dat een neurogene niche herbergt, aangeduid als de subgranulaire zone (SGZ). Hier, hippocampal volwassen neurale stamcellen (NSCs) ondergaan een complex ontwikkelingsproces volledig functionele neuronen die bijdragen aan de regulering van specifieke hersenfuncties, m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures, waaronder dierproef personen, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Chapel Hill van de University of North Carolina.
1. stereotaxic injectie van virale deeltjes
- Bepaal de betrokken neurale circuits. Dit zal bepalen het virus en de muis lijn gebruikt voor de volgende procedure.
Opmerking: Voor dit voorbeeld worden contralaterale Mossy celprojecties gestimuleerd om de effecten ervan op volwassen neurogenese te analyseren. Virale deeltjes coderen AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry worden geleverd aan het DG van 5ht2A-CRE muizen15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na de hierboven beschreven experimentele procedures (Figuur 1a,B), waren we in staat om de effecten van het stimuleren van contralaterale Mossy Cell projecties op de neurogene niche binnen de Hippocampus te bepalen. Door gebruik te maken van een CRE-afhankelijke GQ-gekoppelde stimulerende DREADD virus in combinatie met een Mossy Cell labeling 5-HT2A CRE-Line, konden we selectief excitatory projecties van Mossy cellen op het contralaterale DG activeren en bepaalden dat sterke.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van dit protocol is om te beoordelen hoe het manipuleren van specifieke neurale circuits volwassen hippocampal neurogenese in vivo met behulp van een reeks van immunohistochemie technieken regelt. Asgezegde activiteit afhankelijke regulering van volwassen neurogenese gemedieerd door specifieke neurale circuits is een waardevolle techniek met een groot potentieel voor modificaties om een divers bereik van neurale circuits te bestuderen. Het succes van dit soort experimenten is afhankelijk van meerdere factoren, w.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
L.J.Q. werd gesteund door het National Institute of Mental Health van de National Institutes of Health onder diversiteits supplement R01MH111773 evenals een T32 training Grant T32NS007431-20. Dit project werd gesteund door subsidies toegekend aan J.S. van NIH (MH111773, AG058160 en NS104530).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-jodium) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citroenzuur (21g/L citroenzuur) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Haarverwijderingsproduct) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
Referenties
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
