Methodenartikel

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

DOI:

10.3791/59249

⸱

26 maart 2019

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De neurovasculaire eenheid (NVU) is samengesteld uit microvasculaire endotheliale cellen vormen de bloed - hersenbarrière (BBB), een endothelial kelder membraan met ingesloten pericytes, en de glia limitans samengesteld door de parenchymal kelder-membraan en astrocytic einde-feed omarmen het abluminal aspect van het centrale zenuwstelsel (CNS) microvessels. Naast het behoud van de CNS bepaalt homeostase de NVU immuun cel smokkel naar het centraal zenuwstelsel. Tijdens de immunosurveillance van het centraal zenuwstelsel kunnen lage aantallen van geactiveerde lymfocyten het endotheel barrière oversteken zonder BBB dysfunctie of klinische ziekte te veroorzaken. In tegenstelling, tijdens neuroinflammation zoals in multiple sclerose of haar diermodel kan experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) een groot aantal immuuncellen kruisen de BBB en vervolgens de glia limitans uiteindelijk bereiken de CNS parenchym leidt tot klinische ziekte. Immuun cel migratie naar de CNS parenchym is dus een proces van twee stappen waarbij een sequentiële migratie over het endotheel en gliale barrière voor de NVU met verschillende moleculaire mechanismen. Als na hun passage over het endotheel barrière, T-cellen tegenkomen hun cognaat antigeen op gerelateerde antigeen-presenteren cellen hun lokale reactivering zal starten volgende mechanismen die leiden tot de focal activering van gelatinases, die de T-cellen te steken de gliale barrière en voer de CNS parenchym kunnen. Dus, beoordeling van zowel, BBB permeabiliteit en MMP activiteit in ruimtelijke correlatie met immuun cel accumulatie in het VNV tijdens EAE om aan te geven van verlies van de integriteit van het endotheel en gliale belemmeringen voor de NVU. Hier laten we zien hoe ertoe EAE in C57BL/6 muizen door actieve immunisering en hoe vervolgens analyseren BBB permeabiliteit in vivo met behulp van een combinatie van exogene fluorescerende verklikstoffen. We tonen verder, hoe om te visualiseren en lokaliseren van gelatinase activiteit in EAE hersenen door in situ zymogaphy gekoppeld aan immunefluorescentie technieken van BBB kelder membranen en CD45 + binnenvallende immuuncellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het centrale zenuwstelsel (CNS) coördineert alle lichaam en mentale functies in gewervelde dieren, en CNS homeostase is essentieel voor een goede communicatie van neuronen. CNS homeostase is gerechtvaardigd door de neurovasculaire eenheid (NVU), die de CNS tegen de veranderende omgeving van de bloedstroom beschermt. De NVU is samengesteld uit CNS microvasculaire endotheliale cellen die biochemically uniek zijn en stellen de bloed - hersenbarrière (BBB) in continu Overspraak met pericytes, astrocyten, neuronen en componenten van de extracellulaire matrix (ECM), tot oprichting van twee aparte kelder membranen1. Het endotheel kelder membraan dat ensheathes het abluminal aspect van de endotheliale cellen van BBB herbergt een groot aantal pericytes en bestaat uit laminin α4 en laminin α5, naast andere ECM eiwitten2. In tegenstelling, het parenchymal membraan van de kelder bestaat laminin alpha1 of alpha2 laminin en wordt omarmd door astrocytic einde-voeten. Het parenchymal membraan van de kelder samen met de Astrocyt einde-voeten componeert de glia-limitans dat het CNS neuronale netwerk van de cerebrospinale vloeistof gevuld gerelateerde of de subarachnoïdale ruimtes3beveiligingsmethode. Vanwege de unieke architectuur van de NVU verschilt immuun cel smokkel naar de CNS van dat in de perifere weefsels als het vereist een proces van twee stappen met de immune cellen, eerst overtredingen van het endotheel BBB en vervolgens de glia limitans ter de CNS parenchym bereiken.

Multiple sclerose (MS) is een gemeenschappelijk neuroinflammatoire ziekte van het centraal zenuwstelsel, waarin een groot aantal immuuncellen circulerende Voer de CNS en veroorzaken neuroinflammation, demyelinisatie en focale verlies van BBB integriteit4. Verlies van BBB integriteit is een vroeg kenmerk van MS, zoals aangegeven door de aanwezigheid van gadolinium-contrast verbetering van de laesies in het VNV als gevisualiseerde door magnetische resonantie beeldvorming (MRI)5. Extravasation van de leukocyten in het centraal zenuwstelsel plaatsvindt op het niveau van de postcapillary venules; de precieze mechanismen die betrokken zijn bij immuun cel diapedesis in het membraan van de kelder BBB en vervolgens de gliale barrière moeten echter nog worden onderzocht. Experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) fungeert als een dierlijk model voor MS en heeft aanzienlijk bijgedragen aan onze huidige kennis over MS pathogenese. Bijvoorbeeld heeft met behulp van de EAE-model men ontdekt dat leukocyte extravasation treedt op in een meerstaps proces, met inbegrip van een eerste opname en rollen stap gemedieerd door selectinen en mucin-achtige moleculen zoals selectine P glycoproteïne ligand (PSGL) -1, gevolgd door integrine-afhankelijke stevige arrestatie en kruipen van T cellen op BBB endotheliale cellen te tolerant zijden voor diapedesis6.

Zodra T cellen hebben gekruist het endotheel BBB en het endotheel kelder membraan, moeten zij hun cognaat antigeen op macrofagen en dendritische cellen strategisch gelokaliseerd in de ruimten van leptomeningeale of gerelateerde tegenkomen. Deze interactie induceert focal productie van pro-inflammatoire mediatoren die trigger de volgende mechanismen nodig voor CNS weefsel invasie van immune cellen via de glia limitans7,8,9. Focal activering van matrix-metalloproteinasen (MMP) -2 en MMP-9 verandert chemokine activering en induceert afbraak van extracellulaire matrix receptoren op Astrocyt einde-voeten, die een voorwaarde is voor immuun cel migratie over de glia-limitans in de CNS parenchym en voor het opwekken van het begin van de klinische symptomen van EAE10,11.

Het combineren van detectie van CNS infiltreren immuun cel met BBB verstrekt lekkage en gelatinase activiteit in CNS weefselsecties waardevolle informatie over de functionele integriteit van het endotheel en gliale blok in het kader van neuroinflammation. Bijvoorbeeld, we onlangs onderzocht de constitutieve verlies van het endotheel tight junction molecuul regulates adhesie molecuul (JAM)-B mensenhandel immuun cel in het centraal zenuwstelsel in het kader van EAE. In vergelijking met gezonde wild-type C57BL/6 muizen, gezonde JAM-B-deficiënte nestgenoten toonde geen bijzondere waardevermindering van BBB integriteit zoals blijkt uit de beoordeling van de in vivo permeabiliteit met behulp van zowel endogene als exogene traceurs12. In het kader van EAE toonde JAM-B-deficiënte C57BL/6 muizen verbeterd ziekte symptomen, die werd geassocieerd met inflammatoire cel overlapping in de leptomeningeale en gerelateerde spaties12. Dit fenomeen bestuderen we toegepast in situ zymography, waardoor identificatie van gelatinase activiteit om te testen of het gebrek aan gelatinase activiteit in JAM-B-deficiënte muizen mogelijk verantwoordelijk voor het verlaagde aantal immuuncellen kundig voor inbreuk op de glia limitans12.

Gegeven van de beschikbaarheid van gemodificeerde verschillende genetisch muis modellen ontbreekt, bijvoorbeeld verschillende BBB tight junction moleculen die wijzigingen in functie van de BBB veroorzaken kunnen, methoden voor het onderzoeken van BBB integriteit zijn belangrijk. Daarnaast kon nieuw ontwikkelde geneesmiddelen beïnvloeden op NVU belemmeringen. Hier laten we zien hoe ertoe EAE in C57BL/6 muizen door actieve immunisatie met de myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG)-peptide aa35-55 in volledige Freund de hulpstoffen. We dan uitleggen hoe te lokaliseren immuun cel infiltratie in de barrières van het endotheel en gliale van de NVU en hoe om te bestuderen in vivo endotheel en gliale barrière integriteit door ter plaatse detectie van exogene verklikstoffen en gelatinase, respectievelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle studies werden uitgevoerd onder de richtlijnen volgens de Zwitserse wetgeving inzake de bescherming van dieren en zijn goedgekeurd door het Veterinair Bureau van het Zwitserse kanton Bern (toestemming nummers: BE 31/17 en worden 77/18/EG).

1. behuizing van C57BL/6 muizen in specifieke pathogene vrije (SPF) voorwaarden

  1. Huis muizen in individuele geventileerde kooien met een 12/12 h licht-donker cyclus. Voedsel en water ad libidum. Om het toezicht op de microbiologische kwaliteit van de muizen, onderging de experimentele cohort driemaandelijkse gezondheidsmonitoring door vuile beddengoed sentinels na FELASA aanbevelingen13.
  2. Gebruik oor stoten aan het afzonderlijk markeren 8-12 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen.

2. de immunisatie van C57BL/6 muizen

  1. Bereiding van de oplossingen14:
    1. Voor de Complete Freund adjuvans (CFA), mix 30 mL van onvolledig Freund van adjuvante met 120 mg van vers pestled warmte geïnactiveerd Mycobacterium tuberculosis (H37RA) onder een zuurkast. Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.
    2. Voor de MOGaa35-55-peptide stockoplossing, los MOGaa35-55-peptide in steriele PBS (4 mg/mL) en opslaan bij-80 ° C.
    3. Voorbereiding van de MOG-emulsie:
      1. Verdun CFA 1:2 met MOG-peptide stockoplossing in een microtube 2 mL.
      2. Zegel van de microtube met het afdichten van film en monteren op een Vortex-mixer volledig bedekken de buis met plakband. Vortex emulsie voor 4 uur bij 4 ° C.
    4. Voorbereiding spuiten met stabiele emulsie:
      1. Neem de microtube en snel spin down de emulsie met behulp van een centrifuge tafeltje. Emulsie in een injectiespuit met behulp van een 18G x 1½'' (1.2 mm x 40 mm) injectie naald verzamelen.
      2. Volgens het aantal muizen aanpassen van het volume van de emulsie in de spuit (100 µL/muis) en de naald 18 G vervangen door een injectie naald 27G x ¾'' (0.4 mm x 19 mm). Het zegel van de naald van de injectie aangesloten op de spuit met de afdichting van de film.
    5. Voor de toxine (PTx) stockoplossing van pertussis, ontbinden 50 µg gelyofiliseerd PTx in 500 µL van steriele PBS (100 ng/µL). Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.
    6. Meng voor de PTx-werkoplossing, 97 µL van steriele PBS met 3 µL van PTx-stockoplossing (300 ng/100 µL) per muis (voor intraperitoneale injectie gebruik een 30G x ½'' (0.3 mm x 13 mm)-naald).
  2. EAE inductie
    1. Anesthetize C57BL/6 muizen met isofluorane met behulp van een vaporizer-systeem. Om te induceren anesthesie bij muizen, bloot de muis naar 4,5% isofluorane in zuurstof in een kamer klein incubatie vóór de overbrenging van de muis om een gelaatsmasker met 2,1% isofluorane. Gebruik een verdoving eenheid uitgerust met verwarming pad te voorkomen hypothermie van de muis.
    2. De narcose muis in de ene hand vast en 30 µL van MOG35-55/CFA-emulsie eerst subcutaan te injecteren in de flanken van de achterpoot (figuur 1:1 + 2; in totaal 60 µL; links flank 30 µL en rechterflank 30 µL) in de onmiddellijke nabijheid naar de inguïnale lymfeklieren.
    3. Plaats de muis op zijn buik en injecteren 20 µL van MOGaa35-55/CFA-emulsie in de links en rechts zachte vetweefsel aan de wortel van de staart (figuur 1:3 + 4; in totaal 40 µL; linkerzijde staart wortel 20 µL en rechterkant staart wortel 20 µL) en een kleine druppel van MOGaa35-55/CFA-emulsie int o de hals van de muis (Figuur 1: 5).
    4. Intraperitoneally 100 µL van PTx oplossing te injecteren in de muis. Houd het hoofd van de muis onder het lichaam center injectie in de darm voorkomen.
    5. Vervangen onderhoud dieet (extrudate belangrijke voedingsstoffen: ruw eiwit 18.5% ruw vet 4.5% ruwe vezel 4,5%, ruwe as 6,5%; zetmeel 35%; metabole energie: 13.1 MJ/kg) aan het dieet fokken (extrudate belangrijke voedingsstoffen: ruw eiwit 23,5%, ruw vet 5,5%; ruwe vezel 3%; ruw as 5,7%; zetmeel 36%; metabole energie: 14.3 MJ/kg) zodat de muizen met voedsel van hogere energie-inhoud vóór en tijdens de verwachte klinische ziekte.
    6. Verwijder het gezichtsmasker en de muis overbrengen in zijn kooi met een opwarming pad. Zorg ervoor dat de muis is volledig wakker en motile na 10 minuten.
    7. Herhaal de PTx injectie (2.2.4) 48 h na de eerste behandeling.

3. scoren van muizen EAE

  1. Controleer de gezondheidsstatus van muizen EAE elke ochtend door een kijkje te nemen binnen de kooien.
  2. Score van muizen EAE elke middag.
  3. Elke individuele muis opgenomen in de EAE-experiment uit de kooi en controleer of de staart tonus heeft door deze te verplaatsen naar boven met een vinger te nemen. Een gezonde muis zal houden de staart (de staart heeft een tonus). Als klinische EAE is begonnen, zullen de tonus van de staart lager, door een geleidelijke daling van de staart zichtbaar zijn. Uiteindelijk de muis zal niet in staat zijn op te heffen zijn staart helemaal.
  4. Plaats elke individuele muis opgenomen in het experiment van de EAE op de schone Bank en observeren en documenteren van het wandelen gedrag. Zie tabel 1,15 voor het scoren van criteria voor de beoordeling van de ernst van de ziekte (de EAE-score).
  5. Beoordelen en documenteren van het gewicht van elke muis opgenomen in het experiment.
  6. Om te zorgen voor voldoende voedsel en water opname door muizen weer te geven van een klinische EAE score van 1 leveren bevochtigd voedsel in een kunststof schotel op de bodem van de kooi en dagelijks te vernieuwen.

4. In vivo permeabiliteit assay

  1. Preparaten van oplossingen:
    1. Los voor dextran stamoplossingen, 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 evenals 3 kDa Dextran Texas Red in 500 µL van 0,9% natriumchloride-oplossing (20 mg/mL).
    2. Voor de werkoplossing dextran, net vóór injectie Pipetteer 55 µL van 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 stockoplossing (20 mg/mL) op een stuk van de sluiting van de film en voeg 55 µL van 3 kDa dextran Texas Red stockoplossing (20 mg/mL). Meng en 100 µL verzamelen in een wegwerp fijne spuit (definitieve concentratie van 2 mg/100 µL).
    3. Voor de 10% formaldehyde (PFA) stockoplossing, combineren 10 g PFA extra pure poeder, 100 mL PBS en 200 µL van 1N NaOH in een bekerglas van schoon glas en warmte tot juist 56 ° C onder roeren met een magneetroerder; houden bij 56 ° C gedurende 30 minuten totdat de PFA volledig is opgelost; afkoelen tot kamertemperatuur; Breng de pH aan 7.4; en filtreer door een papieren filter. Winkel bij - 20 ° C. De stockoplossing kan worden verdund verder met PBS.
  2. Kort anesthetize gezonde C57BL/6 muizen of C57BL/6 muizen EAE lijden met Isofluraan (de muis zal worden verdoofd voor ongeveer 1 minuut). Het gebruik van een geautomatiseerd systeem zoals in stap 2.2.1 (muizen zal worden blootgesteld aan 4,5% Isofluraan in zuurstof in een kamer van de inductie en vervolgens overgebracht naar een gelaatsmasker met 2,1% Isofluraan).
  3. Plaats de narcose muis in zijligging op tafel, dan intraveneus (bijvoorbeeld retro-orbitally) 100 µL van fluorescerende traceurs injecteren met de muis, voordat de muis wakker.
  4. Onmiddellijk verwijderen van de gelaatsmasker en zorg ervoor dat de muis is volledig wakker en motile na de korte narcose. Laat de tracer circuleren gedurende 15 minuten.
  5. Ga verder met stap 5.1.

5. perfusie van muizen

  1. Voor in vivo permeabiliteit beoordeling:
    1. Allereerst de procedure 15 min na tl tracer injectie inducerende diepe Isofluraan anesthesie. Om diepe verdoving in muizen gebruiken 2,3% van Isofluraan in zuurstof. Gebruiken van de poot terugtrekking reflex om te beoordelen van de diepte van de narcose (knijpen van de huid tussen de tenen; een gebrek aan flexie geeft aan een voldoende diepte), en de reflexen van de voorpoot zowel het stuk in muizen onderworpen aan EAE sonde.
    2. Los van de muis op zijn rug en de buik spuiten met ethanol. Open van de thorax met behulp van een schaar en verwijder het middenrif. Open het recht atrium van het kloppend hart met een schaar en perfuse van de muis via het linkerventrikel van het hart met 10 mL PBS gevolgd door 10 mL 4% PFA in PBS.
      Let op: Voorkom inademen van PFA, perfuse de muis in een zuurkast.
    3. Ga naar sectie 6.
  2. Voor in situ zymography:
    1. Diepe Isofluraan verdoving 2,3% Isofluraan met zuurstof in een muis EAE lijden veroorzaken, en controleren van de diepte van de verdoving zoals in stap 5.1.1.
    2. Vervolgens de muis vast op zijn rug en de buik spuiten met ethanol. Open van de thorax met behulp van een schaar en verwijder het middenrif. Open het recht atrium van het kloppend hart met een schaar en perfuse van de muis via het linkerventrikel van het hart met 20 mL PBS.
    3. Ga naar sectie 6.

6. dissectie en bevriezen van hersenen

  1. Bereiding van koeling Bad:
    1. Vul een platte dewar container met geplette droogijs en voeg 2-methylbutane (tolueen) totdat de vloeistof ongeveer 1 cm boven het droogijs pack tot. Bedek met een losse deksel – bijvoorbeeld een ijsemmer dekking.
  2. Clip uit het hoofd van de perfused muis met een scherpe schaar en verwijderen van de huid en oren met behulp van een kleiner aantal schaar.
  3. Zorgvuldig ontleden de skullcap door te snijden uit het foramen magnum naar voren op de linkerkant en de rechterkant te upfold de skullcap laat zien dat in de hersenen. Til vervolgens zorgvuldig uit de intact hersenen vanaf de onderkant van de schedel terwijl het versnijden van de optische zenuwen met behulp van een platte metalen spatel.
  4. Plaats van hersenen op aluminiumfolie en snij de hersenen in drie stukken (frontale hersenen, middelste hersenen, en cerebellum + hersenstam) door het plaatsen van twee coronale sneden.
  5. Vul een cryomold (25 x 20 x 5 mm) met het eerste kwartaal met optimale temperatuur snijden (O.C.T.) matrix, hersenen segmenten hechten aan de voorste kant van elk stuk van de hersenen beneden gericht in de cryomold en dekking van weefsel volledig met O.C.T. matrix.
  6. De cryomold met het weefsel in een horizontale richting in de 2-Methylbutane Bad plaatsen en ervoor te zorgen dat het weefsel vanaf de onderkant tot de bovenkant binnen 1 minuut bevriest door het vermijden van de gehele weefsel blok dompelen in het bad.
  7. Overdracht van bevroren weefsel tot-80 ° C voor opslag en gaat u verder met sectie 7.

7. bereiding van bevroren weefselsecties

  1. Equilibreer temperatuur van bevroren weefsel van-80 ° C tot-20 ° C in de cryostaat gedurende 30 minuten.
  2. Verwijderen van weefsel blok uit de cryomold en de mount op de cryostaat weefsel houder (ingesteld op-15 ° C) via een O.C.T. matrix.
  3. Trim de randen van het blok van het weefsel op de houder van de cryostaat met een scherpe scalpel, en beginnen met het snijden in het weefsel blok door het verwijderen van 20 µm secties met het mes van de cryostaat, totdat het weefsel zichtbaar is.
  4. Voor de analyse van in vivo BBB permeabiliteit:
    1. 6-10 µm weefselsecties knippen, verzamelen ze op hechting glas dia's en onmiddellijk het beeld van de secties bedekt met een slip van de cover met behulp van een fluorescentie Microscoop.
    2. Uiterlijk van de bloedvaten in de hersenen (Let op de scherpe randen van de niet-lekkende bloedvaten in vergelijking met diffuse fluorescentie patronen waargenomen voor de lekkende bloedvaten) te beoordelen. Als positieve controle, Controleer of de lekkage van de tracer in het stroma van de organen van de Circumventriculaire of de plexus choroideus die een BBB ontbreken.
  5. Voor in situ zymography:
    1. 6 µm weefselsecties met behulp van een cryostaat knippen, verzamelen ze op hechting glas dia's en bevriezen van weefselsecties bij-20 ° C in een bevriezing doos met silica gel in het deksel.

8. in situ zymography gecombineerd met laminin/CD45 immunofluorescentie kleuring

  1. Oplossingen voor te bereiden:
    1. Bereid insluiten-oplossing:
      1. Meng 6 g glycerol (p.a.), 2,4 g van poly (vinylalcohol) en 6 mL ddH2O 12 mL 0,2 M Tris buffer, pH 8, en roer (magneetroerder) de oplossing voor 4 uur op RT.
      2. Breng de oplossing over in een tube van 50 mL centrifuge en laat het rusten gedurende 2 uur op RT. Vervolgens laat de oplossing gedurende 10 minuten bij 50 ° C (waterbad) en Centrifugeer gedurende 20 min bij 2700 x g bij kamertemperatuur inwerken.
      3. Neem het supernatant en bevriezen in aliquots bij-20 ° C.
    2. Bereid gelatine koude-oplossing:
      1. Los 0,1 g koude gelatine van boviene huid in 10 mL ddH2O.
      2. Laat het weken voor minimaal 1 dag en op te slaan aliquots bij 4 ° C.
    3. Bereiden ijskoude methanol (-20 ° C):
      1. 100% methanol zetten in een coplin pot en koel hem af tot-20 ° C.
    4. 10% natrium azide stamoplossing te bereiden:
      1. Voeg 1 g van natriumazide tot 10 mL van ddH2O en bewaren bij kamertemperatuur.
    5. Bereiden van 0,1% natrium azide werkende oplossing:
      1. Mix 99 µL van ddH2O met 1 µL van 10% natrium azide stockoplossing.
    6. Los 1 mg geconjugeerd fluoresceïne kleurstof-uitgeblust (DQ) gelatine van varken huid in 1 mL natriumazide werken oplossing en winkel 100 µL aliquots beschermd tegen licht bij 4 ° C.
    7. Los op 30 mg 1,10-phenanthroline monohydraat in 76 µL van ethanol en winkel bij-20 ° C.
    8. 25 x protease inhibitor van de omwenteling-oplossing te bereiden:
      1. Meng 1 tablet van EDTA gratis proteaseinhibitor 2 mL ddH2O. Winkel bij-20 ° C.
    9. Bereid de reactie-oplossing (150 µL/sectie) vlak voor gebruik:
      1. De 1 mg/mL DQ gelatine oplossing voor 5 min op 13,300 x gcentrifugeren.
      2. Mix 127,2 µL van ddH2O, 15 µL van 10 x reactie buffer (Gelatinase/Collagenase Assay Kit; Zie Tabel of Materials), 0,3 µL van 20 mg/mL koude gelatine, 1.5 µL van 1 mg/mL DQ gelatine en 6 µL van 25 x protease inhibitor oplossing.
    10. Net voordat hij gebruik, stelt phenantroline negatieve reactie bedieningsoplossing (150 µL/sectie):
      1. Mix 125.2 µL van ddH2O, 15 µL van 10 x reactie buffer, 0,3 µL van 20 mg/mL koude gelatine, 1.5 µL van 1 mg/mL DQ gelatine, 6 µL van 25 x proteaseinhibitor EDTA gratis en 2 µL van 2 M 1,10-phenantroline (MMP-remmer).
    11. Vlak voor gebruik bereiden koude gelatine (niet-tl) negatieve reactie bedieningsoplossing (150 µL/sectie):
      1. Mix 128,7 µL van ddH2O, 15 µL van 10 x reactie buffer, 0,3 µL van 20 mg/mL koude gelatine en 6 µL van 25 x proteaseinhibitor EDTA-vrij.
    12. Primair antilichaam cocktail voor de counterstaining, bijvoorbeeld, 0.95 µg/mL polyklonale konijn anti-laminin antistof en 10 µg Fe/mL polyklonale rat anti-CD45 antistof in 1% BSA in PBS voorbereiden, en passende isotype controle primair antilichaam cocktails te bereiden.
    13. Bereiden van secundair antilichaam oplossing, bijvoorbeeld 7,5 µg/mL Cy3 geit anti-rat + 15 µg Mo/mL AMCA anti-konijn in 1% BSA in PBS (beschermen tegen licht).
  2. Ontdooien 6 µm hersenen niet-vaste weefselsecties van EAE muizen binnen de plastic bevriezing doos met silica gel in het deksel in een zuurkast te voorkomen retentie van water aan het weefsel en 2 weefselsecties op één dia scheiden door het tekenen van lijnen met een water afstotende pen
  3. Reactie oplossingen (stappen 8.1.9-8.1.11) bereiden, Centrifugeer gedurende 5 min bij 13.400 x g bij kamertemperatuur, en pre warm tot 37 ° C met behulp van een waterbad.
  4. Hydrateren de weefselsecties gedurende 5 minuten bij 37 ° C met 1 x reactie buffer. Vervolgens giet af de 1 x reactie buffer, reactie oplossing toevoegen op de weefselsecties en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. Dia's 5 keer wassen in ddH2O.
  5. Herstellen van secties voor 5 min met de ijskoude methanol bij-20 ° C en daarna wassen secties keer met PBS bij kamertemperatuur.
  6. 1% BSA in PBS toevoegen aan de secties en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (beschermen tegen licht). Vervolgens, 1% BSA in PBS van de secties te negeren door het omkeren van de dia's op weefsel, primair antilichaam cocktail toevoegen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (beschermen tegen licht).
  7. Wassen van secties tweemaal met PBS, toevoegen van secundair antilichaam cocktail en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (beschermen tegen licht).
  8. Wassen van secties tweemaal met PBS, mount de dia's met insluiten oplossing, laat gemonteerd secties over nacht bij kamertemperatuur drogen (beschermen tegen licht). Ten slotte analyseren gebeitst weefselsecties met behulp van een fluorescente microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Evaluatie van de klinische cursus van EAE in C57BL/6 muizen zou moeten resulteren in een bocht van de ziekte zoals afgebeeld in figuur 2A en veranderingen in het lichaamsgewicht muis als aangegeven in figuur 2B. C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met MOGaa35-55 meestal beginnen te ontwikkelen van de ziekte symptomen rond dag 10-12 na actieve immunisatie (figuur 1A). Geïmmuniseerde muizen Toon een voorbijgaande daling van het lichaamsgewic...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te induceren en monitor EAE in vrouwelijke C57BL/6 muizen. Vrouwtjes worden bij voorkeur gekozen, en er is een incidentie van vrouwen: mannen van 3:1 in MS. Om te beoordelen van de ernst van de EAE, wij maakte gebruik van een 3-punts scoren blad. EAE ernst is over het algemeen scoorde met betrekking tot de ernst van de motorische stoornissen. Muizen met geavanceerde stadia van EAE, d.w.z. exposeren een score boven 2 mag worden opgeofferd om te voorkomen dat onnodig lijden van de dieren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen dankbaar Lydia Sorokin, die heeft haar oorspronkelijke in situ zymography protocol10 gedeeld met ons.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AMCA anti-rabbit antibodyJackson ImmunoResearch111-156-045Bewaar bij 4 °C; beschermen tegen licht
Anti-CD45 Antibody (30F11)Pharmingen07-1401Bewaar bij 4 °C
Anti-Laminin AntibodyDAKOZ0097Bewaar bij 4 °C
Kweekvoerbijv. PROVIMI KLIBA SA3336
Afzonderlijk geventileerde kooien, Blauwe lijn Type II of IIIbijv. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fractie VApplichemA1391Bewaar bij 4 °C
Koude gelatineSigma-AldrichG 9391
Coplin-pot + rekbijv. Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antilichaamJackson ImmunoResearch111-156-144Bewaar bij 4 °C; beschermen tegen licht
Dekglasjes 24 x 40 mm # 1bijv. Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10.000 MW)bijv. Molecular probesD22910Bewaar bij -20 °C; beschermen tegen licht
Dextran Texas Red (3000 MW)InvitrogenD3328Bewaar bij -20 °C; beschermen tegen licht
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit Thermo Fisher Scientific; EnzCheckE12055Bewaar bij -20 °C; bescherm form licht
Vrouwelijke C57BL/6J muizen (8-12 weken)bijv. Janvier LabsVrouwtjes, 8-12 weken
Invriesbox voor histologie slidesbijv. Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1½’’ (1,2mm x 40mm) injectienaaldbijv. BD, BD Microlance 3304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0,4mm x 19mm) injectienaaldbijv. BD, BD Microlance 3302200
30G x ½’’ (0,3 mm x 13 mm) injectienaaldbijv. BD, BD Microlance 3304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)bijv. Santa Cruz Biotechnologysc-24648Bewaar bij 4°C
Onderhoudsvoerbijv. PROVIMI KLIBA SA3436
MOGaa35-55 peptidebijv. GenScriptBewaar bij -80 °C
microscoopslides (Superfrost Plus )Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RAbijv. BD231141Bewaar bij 4 °C 
NaCl 0,9 %B. Braun3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek )Sakura4583
Omnican 50 30G x ½’’B. Braun9151125S
ParaformaldehydeMerck30525-89-4
Pertussis toxinbijv. List biological laboratories, Inc.180Bewaar bij 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche)Sigma-Aldrich4693132001Bewaar bij 4 °C
Afstotende pen bijv. DAKO Penbijv. DAKOS2002
Sealing film bijv. Parafilm Mbijv Sigma-AldrichP7793
Silica gelbijv. Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
Stitch schaarF.S.T15012-12
Spuit 1 mlbijv. PRIMO62.1002
Spuit 10 mlbijv. CODAN Medical ApS2022-05
Verdampersysteem Univentor 400UNO.BV

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363(2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Permeabiliteit van de bloed hersenbarri revisualisatie van gelatinase activiteitinjectie van fluorescente tracersin situ zymografieinfiltratie van immuuncellenanalyse van de neurovasculaire eenheidC57BL 6 muismodelbeeldvorming van het CNS parenchymscoring van ziekte ernst

Gerelateerde artikelen