Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Samenvatting

Hier beschrijven we de high-throughput detectie en kwantificering van fucosylated menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) met behulp van een geheel-cel biosensor. We ook laten zien hier, de aanpassing van dit platform naar analyse van HMO productie stammen, gericht op het verbeteren van de signaal / ruisverhouding.

Samenvatting

Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn onderdelen van de complexe koolhydraten van menselijke moedermelk die overvloedig voordelen op de gezondheid van de baby vertonen. Optimalisatie van hun biotechnologische synthese wordt echter beperkt door de relatief lage doorvoer van detectie en kwantificering van monosaccharide en verbanden. Conventionele technieken van glycan analyse omvatten chromatografische/Massaspectrometrische methoden met doorvoer over de volgorde van honderden monsters per dag zonder automatisering. Wij tonen hier, een genetisch gecodeerde bacteriële biosensor voor de high-throughput, koppelings-specifieke detectie en kwantificering van de fucosylated HMO structuren, 2'-fucosyllactose en 3-fucosyllactose, die we via heterologe bereikt expressie van fucosidases. Als de aanwezigheid van lactose in melk of in biotechnologische processen tot valse positieven leiden kan, tonen we ook de vermindering van signaal uit lactose met behulp van verschillende strategieën. Vanwege de hoge doorvoer van deze techniek, kunnen veel reactie voorwaarden of bioreactor parameters vehiculumcontrolegroep worden parallel in een kwestie van uren, waardoor voor de optimalisatie van de HMO verwerkende industrie.

Inleiding

Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn lactose-afgeleide oligosacharide, meestal bestaande uit drie tot acht suiker monomeren. Ze hebben een lactose (Gal-β1, 4-Glc) verminderen beëindigen en verder door glycosidic links zijn langwerpig (β-1,3 - of β-1,6-) glucose (Glc), galactose (Gal) of N-acetylglucosamine (GlcNAc). Daarnaast fucose (Fuc, α-1,2 - of α-1,3-) of sialic zuur (Sia of NeuAc, α-2,3 - of α-2,6-) residuen worden vaak toegevoegd¹.

Huidige analyse van de oligosacchariden en andere koolhydraten in doorvoer en reikwijdte begrensd door de behoefte aan spectrometrische chromatografische/massa (MS) technologie^{2,3,4,5, 6 , 7}, dat ongeveer duren kan een uur per monster, niet te vergeten de noodzaak voor dure apparatuur, gespecialiseerde kolommen en Derivatiserings agenten en expertise over de werking van deze apparatuur⁸. Oligosaccharide verbanden zijn bijzonder moeilijk te bepalen, waarvoor geavanceerde MS^9,10 of¹¹technieken nucleaire magnetische resonantie (NMR). Snelle optimalisatie van synthese van deze oligosachariden is dus beperkt door de doorvoer van deze trage analytische stap.

In deze studie, tonen we koppeling-specifieke detectie van fucosylated trisaccharide lactose gebaseerde zorgorganisaties, gericht op 2'-fucosyllactose (2'-FL) thats de overvloedigste HMO in menselijke melk, met behulp van een genetisch gecodeerde Escherichia coli hele cel biosensor met een limiet van detectie op 4 mg/L. Een belangrijk kenmerk van deze biosensor is haar vermogen om te onderscheiden tussen isomere trisacharide. De ontwerpprincipe is gebaseerd op de expressie van specifieke fucosidases in E. coli die bevrijden lactose van zorgorganisaties, waarvan de aanwezigheid wordt gedetecteerd door het lac -operon, die op zijn beurt een fluorescent signaal genereert. Dit bereiken we door het bouwen van een twee-plasmide-systeem, een herbergen de koppelings-specifieke fucosidase en anderzijds een fluorescerende verslaggever eiwit. Dit platform biosensor is geschikt voor high-throughput screening door stroom cytometry of micro-afleesapparaat. We tonen ook het gebruik van de biosensor in 2'-FL geproduceerd door een gemanipuleerde stam¹²te kwantificeren. Binnen deze studie presenteren we ook drie strategieën op selectieve verwijdering van lactose die leiden valse positieve signaal van de biosensor tot kan, gezien het feit dat de gemanipuleerde producent stam wordt verbouwd op lactose.

Samen genomen, de genetisch gecodeerde biosensoren laten detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een koppeling-specifieke wijze, die moeilijk zelfs met is chromatografische, MS of NMR technieken. Vanwege de hoge doorvoer en gebruiksgemak moet deze methode wijdverbreide toepassingen in de metabole engineering en synthese van zorgorganisaties.

Protocol

1. cel cultuur en inductie voorwaarden

Opmerking: De volgende experimenten, drie stammen worden gebruikt: E. coli BL21 (DE3) met een lege vector, E. coli BL21 (DE3) met plasmiden pAfcA¹⁴ en pET28:green fluorescente proteïne (GFP) en E. coli BL21 (DE3) met plasmiden pAfcB¹⁴ en pET28:GFP. Alle stammen worden gekweekt in Luria Bertani broth (LB) of minimale media met de juiste antibiotica. Bereiden van stamoplossingen van 1.000 x kanamycine (50 mg/mL) en carbenicillin (100 mg/mL) in gedeïoniseerd (DI) water.

1. Voorbereiding van de media
   1. Bereiden van LB-media door 25 g van LB poeder voorraad aan 1 L DI water toe te voegen. Autoclaaf de oplossing bij 121 ° C gedurende 20 min te steriliseren. Wacht totdat de gesteriliseerde LB media temperatuur lager dan 60 ° C vóór toevoeging van 1 µL van antibiotica materieel voor elk 1 mL van LB-media is.
   2. Toevoegen om te bereiden LB platen, 15 g agar tot de LB-media voor sterilisatie. Wacht totdat de gesteriliseerde LB agar temperatuur lager dan 60 ° C vóór toevoeging van de antibiotica is.
   3. 1.1.3 de biosensing cellen, opstellen media of platen met dubbele antibiotica, kanamycine en carbenicillin.
2. Koolhydraten inductoren
   1. Bereiden van stamoplossingen van de koolhydraten inductoren op molaire equivalent van 20 g/L lactose: 29 g/L 2'-FL en 3-FL.
      Opmerking: Elke 200 µL van cellen vergt 20 µL van 2'-FL of 3-FL.
   2. Induceren van 200 µL van cellen met 2,0 g/L eindconcentratie van lactose of 2.9 g/L eindconcentratie van 2'-FL/3-FL. Incubate bij 37 ° C met continue schudden en culturen groeien 's nachts laat.
3. Celcultuur
   1. De dag voordat het experiment zaad 5 mL van LB medium aangevuld met kanamycine en carbenicillin uit een vers bacteriële kolonie, met behulp van steriele techniek.
   2. Incubeer alle culturen bij 37 ° C met agitatie en groeien de culturen 's nachts.
   3. Breng 50 µL van overnachting cultuur in 5 mL verse LB/M9 media met kanamycine en carbenicillin. Incubeer bij 37 ° C met continue schudden en groeien tot cultuur heeft bereikt optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) van 0,5 – 0,7. In deze fase halverwege log, kunnen de cellen worden opgewekt.

2. meting van fluorescentie en detectiegrenzen

1. Voorbereiding van cellen voor stroom cytometry
   1. De overnachting culturen overbrengen in 1,5 mL tubes en centrifuge op 12.500 x g voor 1 min.
   2. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 6 mM nb₂HPO₄, 1,8 mM NaH₂PO₄, 145 mM NaCl in DI water, pH 7,2) voor te bereiden van een eencellige schorsing en overbrengen van een enkele cel schorsing 5 mL stroom cytometry buizen.
   3. Houd de cellen in het donker bij 4 ° C tot de voorbeelden op een stroom cytometer uitvoeren. Voor het beste resultaat door de cellen zo spoedig mogelijk te analyseren.
   4. Selecteer 488 nm laser te prikkelen GFP. Verzamelen fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) fluorescentie niveaus (20.000-40.000 evenementen, gated voor voorwaartse en zijdelingse scatter om te voorkomen dat de samengevoegde cellen en puin) met een 525/50 nm bandfilter filter.
2. Kalibreren van de biosensor
   1. Om een ijklijn, 8 – 10 verdunningen van het standaard 2'-FL te maken in het bereik 0-2.500 mg/L.
   2. Cultuur van de 2'-FL biosensing cellen (met pAfcA en pET28:GFP) en veroorzaken ze met de standaard verdunningen, zoals eerder is beschreven in punt 1.3. Uitvoeren van drie biologische herhaling voor elke verdunning.

3. opsporing en kwantificering van 2'-FL bij een producent stam

1. Teelt van producent stam
   1. Voor het maken van minimale media, bereiden aparte oplossingen van 1 M K₂HPO₄, FeSO₄·7H₂O, Natriumcitraat en 1 M thiamine-HCl. Steriliseer de oplossingen met behulp van een 0,22 µm filter. M9 media Bouillon poeder mengen met 1 L DI water. Autoclaaf de M9 oplossing bij 121 ° C gedurende 15 min. koel de oplossing tot 50 ° C. Voeg MgSO₄, CaCl₂, K₂HPO₄, FeSO₄·7H₂O, Natriumcitraat, en thiamine aan de eindconcentraties van 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L en 7,5 µg/L, respectievelijk.
   2. Een cultuur van 2'-FL stam, bijvoorbeeld, JM109 gwBC-F2, 5 ml van LB-media produceren en laten groeien 's nachts bij 37 ° C, zoals beschreven in Baumgartner et al.¹²starten
   3. Subcultuur op 1% zoals eerder in stap 1.3.3 in 250 mL van de minimale media bereid in stap 3.1.1 beschreven. Glycerol toevoegen om een eindconcentratie van 10 g/L en Incubeer de cultuur bij 37 ° C.
   4. Wanneer de cultuur een OD₆₀₀ van 0,5 – 0,7 bereikt, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toevoegen om een eindconcentratie van 0.5 mM en lactose aan een definitieve concentratie van 2 g/L.
   5. Incubeer bij 37 ° C met continue schudden en laat culturen groeien gedurende 24 uur.
2. Extractie van 2'-FL
   1. De overnachting culturen overbrengen in steriele 50 mL tubes en centrifuge op 900 x g gedurende 15 minuten.
   2. 3.2.2 Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in DI water. Herhaal de stap van wassen drie keer te verwijderen van de resterende lactose en ten slotte resuspendeer in 5 mL DI water.
   3. Gebruik een ultrasoonapparaat op kracht van 30%, in 30 s pulsen om de celsuspensie lyse. Houd de cellen op het ijs te allen tijde.
   4. De lysed cellen voor 25 min op 2.000 x gcentrifugeren. Verwijder het supernatant, passeren het een steriele (b.v. 0,22 µm) filteren en op te slaan bij 4 ° C tot analyse.
3. Kwantificering met biosensor
   1. Enten van een cultuur van 2'-FL biosensing cellen en op mid log fase, induceren met cel lysate gelijkwaardig zijn aan de geschatte concentraties van 2'-FL gebruikt om de kalibratiecurve zoals beschreven in paragraaf 2.2. De kalibratie uit te voeren in de zelfde omgeving als het monster te worden geanalyseerd (bijvoorbeeld cel lysate) door toevoeging van verdunningen van 2'-FL aan controle (dat wil zeggen, niet-producerende) gefilterde cel lysate voordat inducerende biosensor cellen.
   2. De monsters worden uitgevoerd op een cytometer van de stroom. Een dosis-responscurve genereren door het uitzetten van de fluorescentie output tegen de oligosaccharide concentratie. Vergelijk de reactie van de normen op de cel lysate.

4. selectieve verwijdering van lactose

Opmerking: De biosensing cellen zijn gevoelig voor lactose en het is wenselijk dat de biosensor selectief detecteren zorgorganisaties over lactose. Een strategie zou wassen van cellen bevatten, zoals beschreven in paragraaf 3.2. Drie andere strategieën worden hieronder beschreven.

1. Behandeling met commerciële gezuiverde β-galactosidase
   1. Ontbinden gelyofiliseerd β-galactosidase tot 1000 (FCC lactase) eenheden/mL, in 1 mM MgCl₂ of gebruik commerciële β-galactosidase in oplossing.
   2. Om te bepalen van de optimale concentratie van enzym nodig, een entmateriaal van 2'-FL biosensing cellen groeien en veroorzaken met 2 g/L lactose en 2.9 g / L 2'-FL in mid log fase.
   3. 100 µL culturen, voeg van variërende hoeveelheden β-galactosidase, maximaal 12 eenheden, en laat de culturen groeien 's nachts bij 37 ° C met continue schudden.
   4. Meten van de fluorescentie, zoals beschreven in paragraaf 2.1 en bereken de optimale eenheden van enzym die nodig zijn door de bepaling van de concentratie van de minimale enzym om gewenste demping van signaal.
   5. Naar 2'-FL producerende cellen gekweekt voor 24u, optimale units van β-galactosidase toevoegen en na een nacht bebroeden bij 37 ° C. Ga verder met het protocol voor het bepalen van de titer van de 2'-FL zoals beschreven in punt 3.3.
2. Voorbehandeling met LacZ + stam
   1. Start een 25 mL cultuur van 2'-FL produceren stam en zodra geïnduceerde in Mid log fase, Incubeer de cultuur bij 37 ° C gedurende 24 uur.
   2. Enten van een BL21 E. coli (DE3) cultuur in LB, het groeien tot halverwege log fase bij 37 ° C en voeg 50 mL van de cultuur (2:1) aan de cultuur van de 24 h.
   3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 h. doorgaan met het protocol voor het bepalen van de titer van de 2'-FL zoals beschreven in punt 3.3.
3. Lactose precipitatie met ethanol
   Opmerking: Deze sectie is aangepast van Matsuki et al.¹².
   1. Start een 25 mL cultuur van 2'-FL produceren stam en zodra geïnduceerde in Mid log fase, Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
   2. Voeg twee volumes van 100% ethanol tot de cultuur, goed schudden en Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur.
   3. Centrifugeer de schorsing bij 900 x g gedurende 15 min. verzamelen het supernatant en na een nacht bebroeden bij 4 ° C, die de lactose precipitaten.
   4. Verwijder de geprecipiteerde lactose door het passeren van de oplossing door een filtreerpapier (11 µm). Vang het filtraat op die de cel lysate met de 2'-FL, die kan worden gekwantificeerd door volgende punt 3.3.

Resultaten

We ontwierpen een hele cel biosensor specifiek voor 2'-FL die kan worden gebruikt in combinatie met de biotechnologische productie van de oligosaccharide. Dit is gebaseerd op de specifieke enzymatische splitsing van wijzigen terminal suikers genereren van lactose en daarmee activering van het lac -operon, leidt tot expressie van een verslaggever fluorescent proteïne onder een lactose afleidbare promotor, in verhouding staan tot de hoeveelheid 2'-FL. Om aan te tonen van de specifi...

Discussie

We presenteren een high-throughput strategie voor de koppeling-specifieke detectie van fucosylated menselijke melk oligosacchariden. Dit werd bereikt door het bouwen van hele cel biosensoren door genetisch engineering E. coli die na inductie met specifieke glycanen reageren met een fluorescerende signaal. Het protocol is ook van details over hoe de biosensor kan worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een metabolisch gemanipuleerde bacteriële stam.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2’-Fucosyllactose	Carbosynth	41263-94-9
3-Fucosyllactose	Carbosynth	41312-47-4
Agar	Fisher Scientific	BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
Flow Cytometer	BD		FACSCanto Plus RUO
HPLC	Agilent Technologies		1100 Series HPLC systeem
HPLC Column	Luna		C18 omgekeerde fase kolom
Kanamycin	Fisher Scientific	11815024
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	12-795-027
Lactose	Fisher Scientific	64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x	Sigma-Aldrich	M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous	Fisher Scientific	M65-500
MS	Agilent Technologies		Mass Selectieve Trap SL detector
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	13472-35-0