Een mini-invasieve interne fixatie techniek voor het bestuderen van immobilisatie-geïnduceerde knie Flexion contractuur bij ratten

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om een minimaal invasieve techniek voor knie gewrichts immobilisatie in een rat-model te beschrijven. Dit reproduceerbare protocol, dat zich baseert op de scheidings modus van de spier kloof en de mini-incisie vaardigheid, is geschikt voor het bestuderen van het onderliggende moleculaire mechanisme van verworven gewrichts contractuur.

Samenvatting

Gezamenlijke contractuur, als gevolg van een langdurige gezamenlijke immobilisatie, is een gemeenschappelijke complicatie in orthopedie. Momenteel is het gebruik van een interne fixatie om knie gewrichts mobiliteit te beperken een algemeen aanvaarde model om experimentele contractuur te genereren. Echter, implanterende toepassing zal onvermijdelijk leiden tot chirurgische trauma aan de dieren. Gericht op het ontwikkelen van een minder invasieve aanpak, combineerden we een spier-kloof scheidings modus met een eerder gemelde mini-incisie vaardigheid tijdens de chirurgische ingreep: twee mini huid incisies werden gemaakt op de laterale dij en been, gevolgd door het uitvoeren van spier-gap scheiding om het botoppervlak bloot te leggen. Het Rat kniegewricht werd geleidelijk geïmmobiliseerd door een voorgebouwde interne fixatie bij ongeveer 135 ° knie flexon zonder storende essentiële zenuwen of bloedvaten. Zoals verwacht, deze eenvoudige techniek maakt snelle postoperatieve revalidatie bij dieren mogelijk. De juiste positie van de interne fixatie werd bevestigd door een x-ray of micro-CT scan analyse. Het bewegingsbereik was significant beperkt in het geïmmobiliseerde kniegewricht dan dat waargenomen in de contralaterale kniegewricht aantonen van de effectiviteit van dit model. Bovendien onthulde histologische analyse de ontwikkeling van de vezelafzetting en adhesie in de posterior-superieure knie gewrichtscapsule na verloop van tijd. Dit mini-invasieve model kan dus geschikt zijn voor het nabootsen van de ontwikkeling van geïmmobiliseerde kniegewricht contractuur.

Inleiding

Gewrichtscontracturen worden gedefinieerd als een beperking van het passieve bewegingsbereik (ROM) van een diarthrodial gewricht^1,2. De huidige therapieën gericht op het voorkomen en behandelen van gezamenlijke contractuur hebben succes bereikt^3,4. Het onderliggende moleculaire mechanisme van verworven gezamenlijke contractuur blijft echter grotendeels onbekend⁵. De etiologie van gezamenlijke contracturen in verschillende sociale gemeenschappen is zeer divers en omvat genetische factoren, posttraumatische toestanden, chronische ziekten en langdurige immobiliteit⁶. Het wordt algemeen aanvaard dat immobiliteit een kritieke kwestie is bij de ontwikkeling van verworven joint contractuur⁷. Mensen die lijden aan grote gezamenlijke contractuur kunnen uiteindelijk resulteren in lichamelijke handicap⁸. Zo is een stabiel en reproduceerbaar diermodel noodzakelijk voor het onderzoeken van de mogelijke pathofysiologische mechanismen van verworven gewrichts contractuur.

De momenteel gebouwde immobilisatie-geïnduceerde kniegewricht contractuur modellen worden meestal bereikt door gebruik te maken van niet-invasieve werpt, externe bevestigingen, en interne fixaties. Watanabe et al. meldde de mogelijkheid van het gebruik van cast immobilisatie op rat kniegewrichten⁹. Door het dragen van een speciale jas, één kant van de onderste ledematen gewricht van de rat wordt geïmmobiliseerd door een cast. Het Rat kniegewricht kan volledig worden gebogen zonder chirurgische trauma^10,11. Echter, zowel de heup en enkel gezamenlijke bewegingen worden ook beïnvloed door deze vorm van immobilisatie, die kan verhogen de mate van spieratrofie in de quadriceps musculus femoris of gastrocnemius¹². Bovendien moeten oedeem en congestie van de achterledematen worden vermeden door de cast op ingestelde tijdstippen te vervangen, wat de continuïteit van immobiliteit kan aantasten. Een andere geaccepteerde methode voor de oprichting van een kniegewricht contractuur model is het gebruik van externe chirurgische fixatie. Nagai et al. gecombineerde Kirschner draad en staaldraad in een externe fixator, die het kniegewricht geïmmobiliseerd tot ongeveer 140 ° van flexie¹³. Bij deze methode wordt een hars gebruikt om het oppervlak te bedekken om krassen op de huid te voorkomen. Hoewel externe fixatie immobilisatie robuust en betrouwbaar is^14,15, percutane Kirschner Wire PIN tracks kunnen verhogen het risico van infectie¹⁶. In onze eigen ervaring kan het gebruik van de externe fixatie techniek de dagelijkse activiteit van ratten verminderen als gevolg van een toename van het geconditioneerde lik gedrag.

Als alternatief Trudel et al. beschreef een goed geaccepteerde model van gezamenlijke contractuur in het Rat kniegewricht op basis van een chirurgische interne fixatie¹⁷ (deze methode werd gewijzigd door Evans en collega's¹⁸). Met name, deze methode benadrukt het belang van het gebruik van een mini-incisie techniek om de chirurgische wonden te minimaliseren. De efficiënte ontwikkeling van gezamenlijke contractuur is bewezen in dit model¹⁹. Het Protocol over het uitvoeren van een minimale dissectie om het botoppervlak bloot te leggen is echter nog onduidelijk²⁰. Ook is de precieze positie waar de schroef boren niet volledig begrepen. De implantatie van de inwendige fixatie via een subcutane of submusculaire manier is nog steeds omstreden²¹. Om deze problemen op te lossen, hebben we deze methode aangepast door een passende scheiding van de spier kloof te maken, waardoor een mini-invasieve blootstelling van het botoppervlak en de plaatsing van de implantatie door een submusculaire kanaal mogelijk is. Dit protocol leidde tot snelle postoperatieve revalidatie bij ratten na de operatie. Dieren ontwikkelden een beperkt gezamenlijk bewegingsbereik na gewrichts immobilisatie, wat consistent was met morfologische veranderingen van de capsulaire adhesie verkregen uit de histologische analyse. We beschrijven ook een exacte mogelijke locatie van de geboorde schroeven, zoals bevestigd door Röntgen analyse of micro-CT-analyse. Dus, deze studie gericht op gedetailleerd beschrijven een minimale-invasieve techniek in een kniegewricht contractuur model dat werd vastgesteld door een spier-kloof scheidings modus gecombineerd met een mini-incisie methode. Wij zijn van mening dat minimaal invasieve technieken zowel dierlijk trauma kunnen verminderen als effectief het pathologische proces van joint flexie contractuur nabootsen.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door het derde aangesloten ziekenhuis van de Universiteit voor institutionele dierenverzorging en-gebruik van de Sun Yat-sen University (machtigings nummer: 02-165-01). Alle dier experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor aankomst.

1. preoperatieve voorbereiding

Opmerking: afbeelding 1 toont het ontwerp van de chirurgische ingreep.

1. Het kniegewricht stevig immobiliseren met een kunststof plaat en twee metalen schroeven bij ongeveer 135 ° flexon.
   Opmerking: Voer de operatie uit bij het proximale dijbeen en de distale tibia zonder de gewrichts component te schenden.
2. Materialen en instrumenten voor interne fixatie voorbereiden.
   1. Bouw een polypropyleen plastic platen van medische kwaliteit door een 5 mL spuit (Figuur 2a) te snijden met behulp van een chirurgische schaar om aan de volgende afmetingen te voldoen: lengte, 25 mm; breedte, 10 mm; dikte, 1 mm (Figuur 2b). Glad de omtrek van de plaat met een scalpel verticaal. Spoel de plaat met een steriele zoutoplossing om het puin drie keer af te spoelen.
      1. Steriliseren met 75% ethanol voor 4 uur, gevolgd door bestraling met ultraviolet licht gedurende 3 uur.
   2. Boorgaten in de kunststof plaat: bereid een met de hand gehouden lage-snelheid elektrische boor met een snelheid van ongeveer 0-4000 rpm (figuur 2c). Boor twee gaten aan beide uiteinden van de plaat, diameters zijn 1 mm en 0,9 mm, respectievelijk (figuur 2D). Overeenkomen met beide uiteinden van de plaat met respectievelijk M 1,4 mm x 8 mm en M 1,2 mm x 6 mm stalen schroeven (figuur 2e).
      1. Veeg met 75% ethanol en steriliseren met UV-licht voor 3 uur voor gebruik.
3. Bereiden chirurgische instrumenten: 1 rechte mug-type hemostatische klem, 1 gladde gebogen Tang, 2 ooglid oprolmechanismen, 1 naald houder, 1 weefsel Tang, 1 hecht schaar, 1 micro weefsel schaar en 1 scalpel (figuur 2F). Steriliseren de chirurgische instrumenten door autoclaveren bij 121,3 °C gedurende 20 minuten en drogen.
4. Proefdieren
   1. Gebruik specifieke pathogeen vrije (SPF) grade volgroeid skelet rijpe mannetjes Sprague-Dawley (of Wistar) ratten, met een gewicht tussen 250-350 g in het experiment.
      Opmerking: Kies een vrouwelijke of mannelijke rat voor het experiment.
   2. Plaats de ratten in kooien en houd in een 12 h licht/12 h donkere cyclus gecontroleerde laboratoriumruimte. Zorg voor voldoende voedsel en water.

2. chirurgie

1. Pas de temperatuur aan. Plaats een verwarmend pad op een chirurgisch platform in een thermostatische operatiekamer.
2. Anesthesie en huid voorbereiding
   1. Weeg de rat af met een elektronische weegschaal en record.
   2. Restrain de rat en voer een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (30 mg/kg) tot geïnduceerde anesthesie. Beoordeling dat het dier voldoende verdoofd met behulp van de teen pinch²². Dien de ogen met smeermiddel om het hoornvlies te beschermen tegen drogen tijdens de operatie.
   3. Scheer het onderlichaam van de rat met inbegrip van de twee achterpoten met een elektrische klipper en desinfecteer met een tinctuur van Povidon jodium tweemaal en 75% ethanol drie keer.
   4. Plaats de rat lateraal, en bedek met de chirurgische draperen bloot aan de ene kant achterpoten en heup.
   5. Desinfecteer het chirurgische gebied opnieuw met Povidon jodium.
3. Immobiliseer het kniegewricht met inwendige fixatie met behulp van een mini-invasieve techniek.
   Opmerking: Houd de incisie goed vochtig met steriele zoutoplossing tijdens de operatie. De operatie vereist meestal twee chirurgen.
   1. Markeer de richting van de huid incisie. Teken aan het distale uiteinde van het dijbeen groter Trochanter een lijn langs het lichaam oppervlak projectie van de spier kloof tussen de quadriceps lateralis en biceps musculus femoris (Figuur 3a). Insnijden van de epidermis huid langs de teken lijn ongeveer 1,5 cm (Figuur 3b).
   2. Deuntly de spier kloof tussen quadriceps lateralis en biceps musculus femoris met een weefsel Tang totdat de femorale schacht ongeveer 1 cm lang is blootgesteld (figuur 3c). Gebruik het oprolmechanisme om een continue scheiding van de spier kloof te vergemakkelijken.
   3. Incise de epidermis huid ongeveer 1 cm langs het lichaam oppervlak projectie van de spier kloof tussen het tibialis voorste en fibularis Longus op de distale onderste extremiteit (figuur 3D). Deuntly de spier kloof totdat het scheenbeen ongeveer 1 cm lang wordt blootgesteld (figuur 3e).
   4. Scheid de zachte weefsels door de oprolmechanisme en de gladde Tang, houd loodrecht en boor één 1,0 mm diameter gat in de femorale as met een snelheid van 1.500 rpm met behulp van een elektrische boor (figuur 3F). De juiste boor positie is ongeveer 8 mm onder de onderrand van de grotere Trochanter. Druk snel op de wond om de bloeding te stoppen.
      Opmerking: de juiste Boordiameter kan intraoperatieve fracturen voorkomen.
   5. Boor een gat van 0,9 mm diameter in de Tibia ongeveer 4 mm onder de rand van de tibiofibulaire fusie (figuur 4a). Voer het boren zorgvuldig uit om het breken van spieren of pezen te voorkomen.
   6. Gebruik de rechte mug-type hemostatische klem om een submusculaire koers te vormen van het Tibia-gat tot het dijbeen. De submusculaire tunnel passeert onder het gastrocnemius in het uiteinde van de tibia en boven de Gluteus medius, onder de biceps musculus femoris in het dijbeen.
   7. Gebruik één M 1,4 mm x 8 mm stalen schroef om één uiteinde van de kunststof plaat te beveiligen (met het gat van 1,0 mm diameter) in het proximale dijbeen (figuur 4b). Gebruik één M 1,2 mm x 6 mm stalen schroef om een ander uiteinde van de kunststof plaat te beveiligen (met het gat van de 0,9 mm diameter) in de distale tibia (figuur 4c). Zorg voor het kniegewricht zonder Varus-vervorming.
4. Sluit de wond: hecht aan de myofascia, diepe fasciae en het onderhuidse weefsel met behulp van 4-0 absorbabele hechtingen (figuur 4D). Sluit de huid met polyamide hechtingen (figuur 4F).

3. postoperatieve leiding

1. Breng postoperatieve analgesie aan via subcutane injectie van buprenorfine (0,03 mg/mL) bij 0,05 mg/kg. Voeg 5 mg/mL neomycine toe aan drinkwater gedurende 5 dagen na de operatie.
2. Injecteer het analgesie mengsel (buprenorfine en carprofen) respectievelijk op 0,05 mg/kg en 5 mg/kg subcutaan tweemaal daags gedurende ten minste 72 uur na de operatie.
3. Controleer of de achterledemaat had over-oedeem in geval van vasculaire letsel. Zorgde ervoor dat de ratten normaal kunnen lopen in het geval van zenuw letsel tijdens de operatie.

4. postoperatieve behandeling

1. Observeer de genezing van de chirurgische incisie en onderzoek het kniegewricht fysiek om vroege tekenen van infectie om de andere dag postoperatief te evalueren. Controleer de mate van zwelling van de enkel en metacarpophalangeale gewricht in geval van continu oedeem.
   Opmerking: vroege postoperatieve infectie kan wond exsudaat, zwelling van het been en vertraagde wondgenezing veroorzaken.
2. Voer röntgenbeelden van de achterledemaat uit om ervoor te zorgen dat de schroeven op de eerste postoperatieve dag correct worden geplaatst.
   Opmerking: een micro-CT-scan analyse is een andere alternatieve optie om de juiste locatie en de richting van de stalen schroeven weer te geven.
3. Meet het passieve bewegingsbereik (ROM) om de ontwikkeling van contractuur te evalueren. Neem een kniegewricht ROM-meting op verschillende tijd cohorten postoperatief zoals eerder beschreven²⁰.
   1. In het kort, euthanceren de ratten en de huid de achterpoten. Verwijder de Immobilizer en meet de knie gewrichts hoek met behulp van een mechanische gelede meter bij twee koppels (667 of 1.060 g/cm)²³.
   2. Bereken de ROM als gevolg van de totale contractuur, de myogenic contractuur, en de arthrogenic contractuur afzonderlijk op basis van de onderzoeksdoelstellingen²⁴.
      Opmerking: Stel verschillende tijd cohorten in (d.w.z. 1, 2, 4, 8, 16 en 32 weken) volgens de onderzoeksdoelstellingen. De contralaterale kniegewricht (niet-operatieve of Sham-bediend) kan dienen als een controle².
4. Histologische analyse van de posterieure knie gewrichts capsules.
   1. Bereid de gewrichtsweefsels voor. Ontleden het gewrichtsweefsel van de knie en fixeer het met 4% Paraformaldehyde. Decalcify en insluiten in paraffine zoals eerder gemeld²⁵. Snijd de secties (5 μm) op mediale midcondylar niveau in het sagittale vlak.
      Opmerking: Kies ervoor om verschillende evaluatie-kleuring uit te voeren, waaronder HE, aldehyde-fuchsin-Masson Goldner (AFMG), Elastica-Masson of immunohistochemie voor histologisch onderzoek in de gewrichtscapsule op basis van uw studie doelstellingen^{15, 26}.
   2. Observeer histomorphometrische veranderingen in de achterste kniegewricht capsules. Foto van de achterste regio van het kniegewricht. Houd rekening met vezelig afzetting en adhesie veranderingen tussen de diaphysis-synovium Junction en de meniscus⁶.
      Opmerking: pathologische veranderingen van gewrichtscapsule worden beschouwd als een pathogene factor voor kniegewricht contractuur. Meet de lengte, de dikte en de capsulaire gebieden van de achterste capsule zoals eerder beschreven op basis van het onderzoek inhoud²⁷.

Resultaten

We hebben geconstateerd dat ratten minimaal invasieve chirurgie kregen, kunnen slechts één dag na de operatie terugkeren naar het reguliere dieet. In het bijzonder heeft de chirurgische incisie littekens zonder exsudaat (figuur 5a). De zwelling van de enkel en metacarpophalangeale gewrichten in de operatieve achterledemaat is bijna volledig verdwenen twee dagen postoperatief (Figuur 5b) in vergelijking met de contralaterale kant ...

Discussie

Deze studie was gericht op het verhelmaken van een stap-voor-stap kniegewricht immobilisatie methode met behulp van een mini-invasieve techniek die snelle postoperatieve revalidatie in dieren na chirurgie toestaat. Conventioneel wordt gedacht dat de scheiding tussen de spieren en de kloof een minimaal invasieve techniek is in orthopedische chirurgie. Zoals verwacht, ontdekten we dat ratten kunnen terugkeren naar een normaal dieet en activiteiten slechts één dag postoperatief, wat consistent was met de vorige studie. Bove...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterieel
Buprenorfine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesie
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesie
Kruiskopschroevendraaier	STANLEY	PH0*125mm	schroeven vastdraaien
Elektrische boor	WEGO	185	gat boren(met roestvrijstalen boor 0,9mm;1,0mm)
Microchirurgische instrumenten	RWD	/	Orthopedische chirurgische instrumenten voor dieren
Neomycine	Sigma	N6386	antibacterieel
Natriumpentobarbital	Sigma	P3761	anestheseren
Roestvrijstalen schroeven	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	schroef(onderdeel van interne fixatie)
Spuit	WEGO	3151474	gebruiken voor kunststofplaat(onderdeel van interne fixatie)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT-scan