Methodenartikel

Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit

DOI:

10.3791/59290

⸱

19 april 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol voorziet een nieuwe methode van lipide druppel isolatie en zuivering van muis levers, met behulp van een gevestigde endoplasmatisch reticulum isolatie kit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipide druppels (LDs) zijn bioactieve organellen binnen het cytosol van de meeste eukaryotische en sommige prokaryote cellen gevonden. LDs bestaan uit neutrale lipiden ingekapseld door een monolayer van fosfolipiden en eiwitten. Hepatische LD lipiden, zoals Ceramiden en eiwitten zijn betrokken bij verschillende ziekten die leiden hepatische steatosis tot. Hoewel vorige methoden zijn vastgesteld voor LD isolatie, ze vereisen een tijdrovende voorbereiding van reagentia en zijn niet bedoeld voor de isolatie van meerdere subcellular compartimenten. We geprobeerd om een nieuw protocol zodat het isolement van de LDs, endoplasmatisch reticulum (ER) en lysosomen uit de lever van een simpele muisklik.

Verder alle reagentia gebruikt in het protocol hier gepresenteerd zijn commercieel verkrijgbaar en vereisen minimaal reagens voorbereiding zonder in te boeten LD zuiverheid. Hier presenteren we gegevens vergelijken van dit nieuwe protocol aan een standaard sacharose kleurovergang protocol, vergelijkbare zuiverheid, morfologie en opbrengst demonstreren. Bovendien, kunnen we isoleren ER en lysosomen met behulp van hetzelfde monster, gedetailleerde inzicht bijbrengen in de vorming en de intracellulaire flux van lipiden en hun geassocieerde eiwitten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDs zijn bioactieve organellen gevonden in het cytosol meest eukaryotische cellen en sommige prokaryotische cellen1,2,3. De LD-kern bestaat uit neutrale lipiden zoals triglyceriden (TG) en cholesterol esters. Ze bevatten ook Ceramiden, bioactieve lipiden die betrokken zijn bij cellulaire signalering trajecten4,5. LDs zijn omgeven door een fosfolipide enkelgelaagde en bekleed met eiwitten, met inbegrip van de perilipin eiwitten perilipin 2 (PLIN2) en 3 (PLIN3)1,5,6. Ook aanwezig zijn lipogenic enzymen, lipasen en mensenhandel membraaneiwitten die zijn gekoppeld aan verschillende hepatische steatotic ziekten, met inbegrip van vette leverziekte en alcoholische leverziekte hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs worden verondersteld om te vormen van de buitenmembraan van de ER en nieuw samengestelde TG afkomstig uit vrije vetzuren ER afkomstige11bevatten. Het blijft echter onbekend of de gepoolde lipiden bud, verbonden blijven, of worden weggesneden uit het ER6,11, waardoor het isolement van LDs vrij van ER technisch uitdagende. Vrije vetzuren kunnen worden bevrijd uit LDs door de inwerking van oppervlakte lipasen energieproductie of membraan synthese te voorzien. Bovendien kunnen de LDs via lipophagy worden afgebroken als een regelgevende mechanisme en voor de productie van vrije vetzuren12.

Naast de ER en lysosomen, zijn er andere organellen — zoals mitochondriën, Endosomen, peroxisomen en het plasma membraan — die zijn te vinden in nauwe samenwerking van LDS-11. Deze strakke polygamie maakt het moeilijk om uit te voeren van een zuivere LD-extractie. Echter, neutrale lipiden aangeboren lage dichtheid kan worden benut via centrifugeren5.

Traditioneel, zijn LDs geïsoleerd met behulp van een sacharose dichtheid kleurovergang1,5,,13. Deze methoden zijn echter niet ontworpen om te isoleren van andere organellen. Bovendien vereisen ze de tijdrovende voorbereiding van reagentia. Dit protocol past een verkrijgbare ER isolatie kit (Zie de Tabel van materialen) om LD isolatie voorzien. We gebruiken de buffer van de extractie geboden door de kit, een LD isolatie stap toe te voegen. Bovendien kan het protocol ook worden gebruikt om ER en lysosomale isolatie met behulp van de dezelfde monsters, waardoor een vollediger beeld van de hele levenscyclus van LDs. Voor het valideren van deze nieuwe methode, assay wij LD opbrengst, de morfologie, de grootte en de zuiverheid. We vergelijken de resultaten die hier gepresenteerd die verkregen met een gebruikte protocol met behulp van een kleurovergang van sacharose voor LD isolatie.

We gebruikten een 10 - tot 12-weken oude, 20 g vrouwelijke C57BL/6 muis gevast voor 16 h (voedsel verwijdering op 17.00 uur voor een 9.00 LD isolatie keer) met gratis toegang tot water. De typische opbrengst voor TG is 0,6 mg/g lever, en voor LD eiwit, het is 0,25 mg/g lever. Dit biedt genoeg materiaal voor 10 ~ immunoblots door SDS-PAGE. Het protocol hieronder details de gebruikte reagentia en een protocol geschikt voor een enkele 1 g lever. Het protocol van de kleurovergang isolatie sacharose is aangepast van Sato14 en Wu15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd op een laboratorium bankje met persoonlijke beschermingsmiddelen die geschikt is voor bioveiligheidsniveau 1, met inbegrip van een lab-jas, handschoenen en veiligheidsbril. Experimenten werden uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Pennsylvania. Alle inspanningen werden gedaan om het dier ongemak te minimaliseren, en de dieren werden behandeld met humane zorg.

1. LD isolatie met behulp van een ER isolatie kit

  1. Voorbereiding
    Opmerking: De genoemde bedragen zijn geschikt voor een enkele 1 g muis lever.
    1. 10 mL 1 x isotone extractie buffer (IE buffer, uit de ER isolatie kit) voor te bereiden door 2 mL 5 x IE buffer met 8 mL ultrazuiver water verdunnen. Koel de buffer door deze te plaatsen op het ijs.
    2. 100 mL, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor te bereiden door 10 mL 10 x PBS in 90 mL ultrazuiver water verdunnen. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    3. 10 mL 5% polyethyleenglycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl ether (PGPE) bereid door verdunnen 500 µL van PGPE in 9.5 mL ultrazuiver water. Gebruik een 1 mL spuit om te meten uit PGPE aangezien het viskeus. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    4. Alle buizen cool door ze te plaatsen op het ijs: 1,7 mL microcentrifuge buizen, centrifuge buizen van 15 mL en 50 mL high-speed centrifuge buizen 13 mL ultracentrifuge buizen.
    5. Cool alle vereiste centrifuges tot en met 4 ° C: een microcentrifuge, een hoge capaciteit centrifuge voor 15 mL tubes, een snelle centrifuge voor 50 mL buizen en een ultracentrifuge.
    6. Pincet en dissectie schaar in autoclaaf steriliseren.
  2. Weefsel voorbereiding
    1. De muis door deze te plaatsen in een kamer gevuld met 100% CO2 voor 10 min. bevestigen euthanasie door het uitvoeren van cervicale dislocatie euthanaseren.
    2. Met behulp van steriele pincet en dissectie schaar, snijden de lagen van de huid en spieren van de buik op de achterste/anterior as bloot van de lever.
    3. Snijd de ligamenten die de lever verbinden met het middenrif en de darm. Gebruik pincet te trekken van de darm uit de buurt van de lever, richting de posterior, bloot de ligamenten.
    4. Gesneden tussen de lever en de dorsale ribbenkast, verplaatsen van anterior to posterior totdat de lever is bevrijd.
    5. De lever overbrengen in een koude 5 cm petrischaal met 10 mL koude 1 x PBS.
    6. Wassen van de lever 2 x op een rockende platform in 10 mL koude 1 x PBS voor 5 min bij 4 ° C in de 5 cm petrischaal. Giet af 1 x PBS na de laatste wasbeurt.
    7. Gebruik een steriele chirurgische mes grootte-10 (Zie de Tabel van materialen) aan de lever dobbelstenen in 3 – 5 mm stukken in de 5 cm petrischaal (figuur 1A).
    8. Wassen van de blokjes lever 2 x met 10 mL koude 1 x PBS voor 5 min bij 4 ° C in de 5 cm petrischaal.
      Opmerking: Voor lysosoom isolatie, 0,5 g lever overbrengen in een schone 45 mL homogenizer en volg de aanwijzingen geleverd door het lysosoom extractie kit (Zie de Tabel van de materialen).
    9. 1 x PBS decanteren en breng de blokjes lever stukken naar de koude 45 mL Dounce homogenizer. Zorgen dat alle stukken Ga naar de onderkant van de homogenizer.
    10. Voeg 7 mL koude 1 x IE buffer (uit de ER isolatie kit) en meng op ijs door het bewegen van de stamper op en neer 20 x. Zorg ervoor dat de stamper naar de onderkant van de homogenizer tijdens elke streek gaat.
    11. Het homogenaat (figuur 1B) overbrengen in een centrifugebuis koude 15 mL.
    12. Spoel de homogenizer met 1 mL koude 1 x IE buffer (uit de ER isolatie kit) en voeg dit toe aan de rest van het homogenaat.
  3. LD isolatie
    1. Verwijder de kernen door centrifugering van het homogenaat in een centrifuge van de hoge capaciteit bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C (Figuur 1 c).
    2. Het postnuclear supernatant (PNS) overbrengen in een centrifugebuis nieuwe, koude 50 mL. LD om verlies te voorkomen, ervoor zorgen dat elke lipide verzamelden zich bij de bovenkant van de tube van 15 mL is geresuspendeerde vóór de overbrenging van de PNS.
    3. Neem een 100 µL aliquoot van de PNS zuiverheid p.a. en plaats het in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis. Zet het opzij op het ijs.
    4. Als u wilt verwijderen van mitochondriën, Centrifugeer het PNS monster, niet het afgepipetteerde deel, in een gekoelde snelle centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
      1. Optioneel: voor ruwe LD (CLD) isolaten (met cytosol en celmembraan besmetting), de bovenste lipide-laag met behulp van een precisiepipet glas verzamelen en overbrengen naar een tube van 1,7 mL microcentrifuge. Blijven sectie 1.4.
    5. Het postmitochondrial supernatant (PMS) overbrengen in een buis van de ultracentrifuge. LD om verlies te voorkomen, ervoor zorgen dat elke lipide verzameld aan de bovenkant is geresuspendeerde vóór de overbrenging van het PMS.
    6. Neem een 100 µL aliquoot van de PMS zuiverheid p.a. en plaats het in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis. Zet het opzij op het ijs.
    7. Vul een ultracentrifuge buis aan de rand met koude 1 x IE buffer om te voorkomen dat de buis bezwijken tijdens ultracentrifugatie.
    8. Evenwicht van de monsters en centrifugeer ze in een ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 60 min bij 4 ° C (Figuur 1 d).
    9. Als u wilt verwijderen van de LD-laag, kantelen van de buis onder een hoek van 45° en gecombineerd met een glazen pipet. De pellet overbrengen in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis.
      Opmerking: De pellet bevat geïsoleerde ER. Gebruik dit gedeelte stroomafwaarts om ER te isoleren.
    10. Het verzamelen van 100 µL van het supernatans dat post-ER (PER) onder de lipide-laag voor zuiverheid analyse.
  4. LD wassen
    1. 1 x PBS op de breuk van de LD verzameld in een 1.7 microcentrifuge buis, tot een totaal volume van 1.3 mL toevoegen.
    2. Vortex het monster.
    3. Centrifugeer in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende 5 minuten bij 4 ° C tot elke cel puin pellet. Warm de tube zachtjes met de handen om te helpen resuspendeer de LD-laag. Overdracht van de bovendrijvende substantie, met inbegrip van de lipide laag, een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis.
    4. Herhaal stappen 1.4.1–1.4.3 2 x-3 x, totdat de pellet is niet meer zichtbaar.
    5. 1 x PBS aan de pellet-vrije LD supernatant tot een eindvolume van 1,5 mL toevoegen. Wassen van de lipide breuk door centrifugeren in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    6. Verwijder 1 mL 1 x PBS (onder de lipid layer) met een glazen pipet zonder verstoring van de lipide-laag.
    7. Herhaal stap 1.4.5 en 1.4.6 4 x-5 x, totdat de 1 x PBS is visueel transparant met geen turbiditeit.
    8. Verwijder alle PBS van de 1 x onder de lipide-laag, met behulp van een glazen pipet (figuur 1E).
    9. Het resultaat, een zuivere LD Fractie, stroomafwaarts p.a. gebruiken
  5. LD eiwit kwantificatie door zure test van bicinchoninic
    Opmerking: Gebruik geen een bicinchoninic zuur assay (BCA) als LD morfologie worden beoordeeld.
    1. Resuspendeer de LD in 500 μL van 5% PGPE.
    2. Kook de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C, vortex, en broeden van de monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten afkoelen.
    3. Herhaal stap 1.5.2 een extra 2 x.
    4. Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters gedurende 5 minuten met een 30 s in- / uitschakelen cyclus, bij een gemiddelde intensiteit.
    5. Normaliseren de monsters door het meten van de eiwitconcentratie in alle zuiverheid analyse monsters en in de LD-fractie door BCA assay.

2. LD isolatie met behulp van sacharose dichtheid verloop

  1. Voorbereiding
    1. Breng 200 mL TE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    2. 100 mL van 60% (m/v) sacharoseoplossing in buffer TE maken door ontbinding van 60 g van sacharose in TE buffer, het eindvolume te brengen tot 100 mL. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    3. 6 mL sacharoseoplossing 40% (m/v) door toevoeging van 4 mL van 60% sucrose aan 2 mL buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    4. 6 mL sacharoseoplossing 25% (m/v) door toevoeging van 2.5 mL van 60% sucrose aan 3,5 mL buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    5. 4 mL 10% (m/v) sacharoseoplossing door toevoeging van 0,7 mL van 60% sucrose 3,3 ml buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    6. 10 mL protease en phosphatase remmer oplossing door toevoeging van een tablet van zowel protease en phosphatase inhibitors tot 10 mL van de buffer TE maken.
    7. Bereiden weefsel homogenaat buffer door toevoeging van 4 mL protease en phosphatase remmer oplossing aan 50 mL stockoplossing van 60% sucrose. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    8. Overlay buffer door toevoeging van 2 mL van protease en phosphatase remmer oplossing aan 50 mL buffer TE bereiden. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    9. 100 mL 1 x PBS bereid door verdunning van 10 mL 10 x PBS in 90 mL ultrazuiver water. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    10. Bereiden van 10 mL 5% PGPE door verdunnen 500 µL van PGPE in 9.5 mL ultrazuiver water. Gebruik een 1 mL spuit om te meten uit PGPE aangezien het viskeus. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
    11. De volgende centrifuge buizen cool door ze te plaatsen op het ijs: 1,7 mL microcentrifuge buizen, centrifuge buizen van 15 mL en 50 mL high-speed centrifuge buizen 13 mL ultracentrifuge buizen.
    12. Koel de vereiste centrifuges tot en met 4 ° C: een microcentrifuge, een hoge capaciteit centrifuge (voor 15 mL tubes), een snelle centrifuge (voor 50 mL tubes) en een ultracentrifuge.
  2. Weefsel voorbereiding
    1. Gebruik de stappen 1.2.1–1.2.9 voor te bereiden op het weefsel homogenisering.
    2. Voeg 7 mL koude weefsel homogenaat buffer en meng het op ijs door het bewegen van de stamper op en neer 20 x. Tijdens de eerste vijf lijnen, waarborgen dat de stamper gaat naar de onderkant van de homogenizer.
    3. Het homogenaat overbrengen in een centrifugebuis koude 15 mL.
    4. Spoel de homogenizer met 1 mL koude weefsel homogenaat buffer en het overbrengen van de centrifugebuis eerder gebruikte 15 mL.
    5. Breng het volume van het homogenaat tot 10 mL met weefsel homogenaat buffer.
    6. Centrifugeer het monster in een centrifuge van de hoge capaciteit bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    7. 8 mL van het supernatans overbrengen in een centrifugebuis 50 mL.
    8. Overdragen 100 µL van de resterende bovendrijvende substantie als PNS ingewogen analysemateriaal zuiverheid.
  3. Sacharose verloop
    1. De 50 mL centrifugebuis waarin de 8 mL PNS in een hoek van 45° te kantelen. Voeg voorzichtig 6 mL 40% sacharoseoplossing, ervoor te zorgen dat de twee fasen gescheiden blijven.
    2. Op een gelijkaardige manier, Voeg langzaam 6 mL 25% sacharoseoplossing; Voeg vervolgens 4 mL 10% sacharoseoplossing; Ten slotte voeg 8 mL overlay buffer.
    3. Centrifugeer het monster in een high-speed centrifuge bij 30.000 x g bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    4. Overdracht van de bovenste laag met de LDs tot een koker van 1,7 mL microcentrifuge.
    5. Voor het wassen van de LD, volg de stappen in sectie 1.4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij hebben de LD-isolatie met de kit ER uitgevoerd op ongeveer 30 muizen en vergeleken de resultaten met degenen die het protocol van de isolatie van sacharose volgen op ongeveer 40 muizen. De gerapporteerde bevindingen zijn typisch voor beide protocollen. Muizen werden 's nachts met gratis toegang tot water, te verhogen van het rendement van de LD gevast. LD isolatie met een verloop van sacharose is uitgevoerd in parallel met de kit ER LD isolatie protocol. Monsters van PNS, PMS, PER, CL...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatische LD biologie wordt steeds meer erkend als een belangrijke regulator van hepatocellulaire fysiologie in zowel de volksgezondheid als de ziekte. Als bonafide organellen, LDs zijn dynamische interactie met andere cellulaire structuren en bevatten binnen hen bioactieve componenten betrokken bij zowel lipide en glucose homeostase. Het verloop van sacharose wordt routinematig gebruikt voor LD isolatie en kan onderzoekers bestuderen LD structuur, maar het vereist hen om talrijke buffers. We hebben aangetoond dat het g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Carr krijgt ondersteuning van het onderzoek van farmaceutica van de onderscheppen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de Abramson familie Cancer Research Institute. Dit werk wordt ondersteund door de volgende subsidies: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation Harold Amos medische faculteit Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.C.M.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH P30-DK050306 en de faciliteiten van de kern (moleculaire pathologie en Imaging Core, moleculaire biologie/gen expressie Core en cel cultuur Core) en haar piloot verlenen programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BioExpress Vortex MixerGeneMateS-3200-1Vortex Mixer
Centrifuge 54242 REppendorf54242 RGekoelde Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+Gekoelde Hoge Snelheid Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+Thermo ScientificLegend RT+Gekoelde Hoge Capaciteit Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor CocktailSigma Aldrich04 693 116 001Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200Sonicatie Systeem
Dounce Tissue Grinder (45 mL)Wheaton357546Gebruik Losse stamper
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x)Corning21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation KitSigma AldrichER0100Voor ER kit Extractie:
Bevat:
Isotone Extractie Buffer 5X 100 mL
Hypotone Extractie Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M oplossing 5 mL
OptiPrep Dichtheidsgradiënt Medium 100 mL
Botsnaald met ronde neus 1 st.
Externe lichtbron voor fluorescente excitatieLeicaLeica EL6000
ZoutzuurSigma AldrichH1758Zoutzuur
ImageJBeeldanalyse Software
Omgekeerde Modulerende Contrast MicroscoopLeicaLeica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit voor Weefsels en Gekweekte CellenThermo Fisher Scientific89839Voor Lysosoom Isolati
Microscoop CameraQimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K UltracentrifugeBeckman-CoulterXL-100KUltracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur PipettesFisher Scientific22-042817
Petrischaal 5 cmFisher ScientificFB0875713A
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Fosfatase Inhibitor Tablets
Steriele Chirurgische Blad #10PioneerS2646
SucroseFisher ScientificS5-500Kristallijn/Gecertificeerd ACS
Triglyceride Liquicolor KitStanbio 2200-225Colorimetrische Triglyceride kit
Tris BaseFisher ScientificBP152-1Voor TE buffer
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, Polyethyleenglycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenylether, Proteïne Lysis Reagens
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)Thermo Fisher Scientific15575-038Voor TE buffer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118(2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Endoplasmic Reticulum IsolationLysosome IsolationLiver Tissue PreparationDifferential CentrifugationUltracentrifugation ProtocolLipid Droplet Purity AnalysisPLIN2 Marker DetectionSEC61A Protein Assay

Gerelateerde artikelen