Methodenartikel

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

15.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59294

⸱

19 mei 2019

 , 
1Interdisciplinary School of Health Science, Faculty of Health Sciences and Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Medicine, University of Ottawa

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol te halen, op te lossen en te identificeren mitochondriale supercomplexen die blootstelling aan detergenten en Coomassie blauw minimaliseert. Dit protocol biedt een optimaal evenwicht tussen resolutie, en behoud van enzymactiviteiten, terwijl het minimaliseren van het risico om labiele proteïne-eiwitinteractie te verliezen.

Samenvatting

Complexen van de oxidatieve phosphorylation machines vorm supramoleculaire eiwit regelingen genaamd supercomplexen (SCs), die worden verondersteld om structurele en functionele voordelen te verlenen aan mitochondria. SCs zijn geïdentificeerd in vele soorten, van gist tot zoogdier, en een toenemend aantal studies rapporteren verstoring van hun organisatie in genetische en verworven ziekten van de mens. Als gevolg daarvan is een toenemend aantal laboratoria geïnteresseerd in het analyseren van SCs, die kan worden methodologisch uitdagend. Dit artikel bevat een geoptimaliseerd protocol dat de voordelen van Blue-en Clear-native pagina methoden combineert om SCs op een tijd-effectieve manier op te lossen en te analyseren. Met deze hybride CN/BN-pagina methode, mitochondrial SCs geëxtraheerd met optimale hoeveelheden van de milde wasmiddel digitonin worden kort blootgesteld aan de anionische kleurstof Coomassie blauw (CB) aan het begin van de elektroforese, zonder blootstelling aan andere wasmiddelen. Deze korte blootstelling aan CB maakt het mogelijk om SCs te scheiden en op te lossen zo effectief als met traditionele BN-pagina methoden, terwijl het vermijden van de negatieve impact van hoge CB niveaus op in-gel activiteit assays, en labiele eiwit-Eiwitinteracties binnen SCs. Met dit protocol is het dus mogelijk om nauwkeurige en snelle in de metingen van de gel-activiteit met analytische technieken te combineren die 2D elektroforese, immuun-opsporing, en/of Proteomics voor geavanceerde analyse van SCs impliceren.

Inleiding

Mitochondriën produceren energie door middel van oxidatieve phosphorylation, waar respiratoire complexen I-II-III-IV oxideren substraten en de overdracht elektronen naar zuurstof, het genereren van een gradiënt die het mogelijk maakt phosphorylation van ADP door de ATP synthase (CV). In de afgelopen jaren hebben uitgebreide studies aangetoond dat ademhalingsketen complexen niet uitsluitend lineair in het binnenste mitochondriale membraan zijn verwerkt, maar ook in supercomplexen (SCs) arrangementen1,2zijn ingedeeld. In de mitochondria van zoogdieren, SCs bestaan in verschillende stoichiometries: CI/CIII2/CIV1-4 (die wordt genoemd de respirasome, en die in staat is Nijhuis: O2 oxidoreduction in vitro)2, CI/CIII2, en CIII2 /CIV1-23,4. Bovendien worden Ademhalings complexen verdeeld onder verschillende verhoudingen tussen hun vrije vorm en SCs regelingen. Daarom wordt geschat dat 85%-100% van CI, 55%-65% van de CIII, en 15%-25% van de CIV zijn te vinden in SCs4. Deze supramoleculaire structuren worden verondersteld om de productie van ROS te verminderen, te stabiliseren of in de assemblage van individuele complexen te helpen, de ademhalingsketen activiteit regelen, en eiwit samenvoeging in het eiwitrijke binnen mitochondrial membraan te verhinderen5 ,6,7,8. Hun hermodellering vermogen op variatie in de vraag naar energie en hun belang in de pathogenese van ziekten wordt onderzocht in verschillende laboratoria3,7,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. studies hebben aangetoond dat pathologische veranderingen in de SCs assemblage aanwezig zijn in een verscheidenheid van aandoeningen, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, genetische defect in cardiolipin synthese15, hartfalen16, ischemie-reperfusie17, diabetes12, en het verouderen18.

De inheemse elektroforese en immunodetection worden wijd gebruikt in de studies van SCs om OXPHOS complexen quaternaire regelingen2,19,20,21op te lossen. De inheemse elektroforese kan verder met specifiek in de tests van de gel-activiteit of 2D-sds-pagina worden gecombineerd om nauwkeurige moleculaire bepaling van diverse SCs assemblage1,19toe te laten. De mogelijkheid om SCs te bestuderen is kritisch afhankelijk van de extractie condities, waaronder type en concentratie van wasmiddel, Ionische sterkte en pH, alsmede op elektroforetische migratie omstandigheden, die bestaan uit buffer samenstelling, aanwezigheid van CB, gel grootte, en acrylamide percentage2.

Protocollen en SCs band resolutie variëren sterk onder de papieren, waardoor de vergelijking tussen de studies moeilijk en aanpassing van de methoden uitdagende22. Daarom, dit document stelt een robuust en optimaal protocol om SCs uittreksel uit geïsoleerde mitochondriën van verschillende bronnen met de niet-ionische wasmiddel digitonin, en het oplossen van hoge moleculair gewicht SCs bands. De geoptimaliseerde detergent concentratie, de samenstelling van de extractiebuffer, en de afwezigheid van Coomassie blauw in steekproefvoorbereiding minimaliseren verstoring van eiwitcomplexen. Dit protocol (Zie Figuur 1 voor een overzicht) combineert CN-pagina en bn-pagina voor een optimale SCs assemblage resolutie over grote gel, en is compatibel met in-gel activiteit assays waardoor een betere visualisatie van reactieve bands, samen met het gebruik van immunodetection voor een gedetailleerde analyse SCs regelingen en samenstelling.

Protocol

1. SC extractie

  1. Bereid 100 mL extractiebuffer (Zie tabel 2) door EDTA in water op te lossen. Verhoog de pH met KOH tot volledig opgelost, dan pH aan te passen aan 7,5 met HCl. Voeg de resterende onderdelen aan de oplossing, compleet met het uiteindelijke volume met water, en houden op ijs. In een buis, los digitonin in extractiebuffer om een 10% voorraad oplossing te maken, Vortex grondig tot volledig opgelost, en houden op ijs.
    Opmerking: extractiebuffer kan vooraf worden bereid en bij 4 °C worden gehouden voor maximaal 2 maanden. Als golvende bands beginnen te verschijnen aan de onderkant van de gel, het betekent extractiebuffer is te oud. Bij de voorbereiding van de 10% digitonin oplossing, bereiden een voorraad volume tellen 500 µ L per monster bij gebruik van muis lever mitochondria. Digitonin oplosbaarheid varieert op basis van herkomst en product lot (Zie tabel van materialen).
  2. Mitochondriën geïsoleerd van dierlijk weefsel (muis hart, spier, lever; rat hart) of cellen (humaan fibroblast) met behulp van standaardprotocollen23,24,25 kunnen worden gebruikt voor de extractie van SCs. Zodra mitochondria worden verkregen, kwantificeren eiwitgehalte met behulp van de bicinchoninic acid assay kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Supplement geïsoleerde mitochondriën met proteasen en fosfatasen remmers bij deze stap als nodig is.
    Opmerking: SCs kan worden geëxtraheerd op zowel verse of ontdooide mitochondriën. Het wordt aanbevolen om SCs uit alle monsters op hetzelfde moment, om te verzekeren dat ze worden behandeld met dezelfde partijen van oplossingen en onder dezelfde voorwaarden.
  3. Op basis van de mitochondriale eiwitconcentratie verkregen, en de uiteindelijke digitonin/eiwit ratio gewenst, bereken het volume van de voorraad digitonin oplossing en extractiebuffer vereist volgens tabel 1. Voor SC extractie, voeg 1 µ L van extractiebuffer (tabel 2) met digitonin voor elke 10 µ g van mitochondriale eiwit. De digitonin/eiwit verhouding kan variëren van 2 tot 8 g/g. Een digitonin titratie moet altijd worden uitgevoerd voor elk nieuw type monster dat wordt gebruikt (Zie Figuur 2 voor een voorbeeld).
  4. Pellet mitochondriën, in een 1,5 mL buis door centrifugeren bij 16.000 x g voor 10 min bij 4 °c.
  5. Gooi bovendrijvende en re-Suspend de mitochondriale pellet in het berekende volume van ijskoude extractiebuffer met digitonin. Plaats buizen op een mini buis Rotator en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C bij een gemiddelde rotatiesnelheid. Zorg ervoor dat de monsters worden steeds goed gemengd.
  6. Centrifugeer monsters bij 20.400 x g voor 45 min bij 4 °c om insolubilized fragmenten te verwijderen.
  7. Overdracht bovendrijvende in een nieuwe buis op ijs en kwantificeren eiwitten. Deze fractie staat voor het extract van de Ademhalings supercomplexen. Als de elektroforese niet op de zelfde dag wordt uitgevoerd, bewaar steekproeven bij-80 °C.
    Opmerking: 1) Vermijd Freeze/ontdooicycli van het extract, omdat dit verstoort hogere moleculaire regelingen van SCs. monster vóór de eerste vorst/ontdooicyclus indien nodig. 2) voor het uitvoeren van een standaard BN-pagina experiment, CB moet worden toegevoegd aan de SCs uittreksel bij deze stap. CB moet worden toegevoegd in een 1g/8g verhouding ten opzichte van de hoeveelheid wasmiddel gebruikt.

2. Gradient gel gieten en elektroforese

  1. Bereid 3x gradiënt buffer en acrylamide voorraden voor het maken van de gradiënt gel, hoeveelheid, en op te slaan bij-20 ° c (Zie tabel 3).
  2. Bereid anode-en kathode buffers voor en houd deze bij 4 °C (Zie tabel 5).
  3. Open de giet kamer en plaats een buitenste glazen plaat (20 cm x 22 cm) in de kamer. Plaats een set van afstandhouders (1,5 mm) met behulp van de uitlijning kaart om ervoor te zorgen dat ze stevig zitten tegen de zijkant en hoeken van de kamer. Plaats een binnenste glazen plaat (20 cm x 20 cm) op de top van de afstandhouders (dit vormt de gel sandwich), en zet een plastic scheidings blad op de top van de glazen plaat.
  4. Herhaal stap 2,3 tot het gewenste aantal gels te werpen is bereikt. Voor dit protocol worden 4 gels gegoten. De casting kamersysteem dat we gebruiken (Zie tabel van materialen) kan het gieten van een maximum van 10 gels per keer. Take-up van de resterende ruimte in de kamer door eerst toe te voegen zo veel acryl blokken als nodig is, en vervolgens glazen platen indien nodig.
    Opmerking: de montage moet strak worden afgedicht; Er mag geen ruimte tussen de gel sandwiches in de kamer.
  5. Plaats een strook van Parafilm in de groef alvorens de pakking stevig in de pakking inkeping te plaatsen. Plaats de afsluitplaat op de kamer en draai alle 6 schroeven vast. Tribune de gietende kamer.
  6. Plaats gradiënt voormalige op een roer plaat met een magneetroerder in de "lichte" mengkamer. Sluit de slang van de casting kamer aan de gradiënt voormalige, veilig de slang in de cassette van de peristaltische pomp, en zorg ervoor dat de wegkraan van de gradiënt voormalige is gesloten.
  7. Voor het gieten van 4 gels, bereid 60 mL van 4% en 60 mL van 12% gel-oplossingen (Zie tabel 4) in een erlenmeyer kolf en wervelen grondig te mengen. Giet 60 mL van 4% gel oplossing in de "lichte" mengkamer, en 60 mL van 12% in de "zware" reservoir kamer van de gradiënt voormalige. Stel de roer snelheid van de roer plaat op 350 rpm. Open de wegkraan en zet de pomp op 35 rpm.
  8. Zodra de lichte fractie lager is dan de zware Fractie, pauzeren de pomp en open de klepstam tussen "licht" en "zware" reservoirs, laat fracties volume equilibrate, en herstart de pomp.
    Opmerking: het is belangrijk dat er geen bubbels het systeem in te voeren en vast komen te zitten tussen glasplaten. Als dit gebeurt, ongedaan maken montage, wassen, en opnieuw.
  9. Zodra de gradiënt gel is volledig gegoten, stop de pomp, en overlay water (ongeveer 1 mL) op elke gel sandwich om het drogen van de gel te voorkomen. Laat polymeriseren voor 2 uur.
  10. Bereid 25 mL stapelen gel in Erlenmeyer en Swirl om grondig te mengen. Verwijder water en plaats 15 goed kammen in elke gel sandwich. Giet stapelen gel en laat polymeriseren voor 2 uur.
    Let op: gels kunnen worden gegoten en bewaard bij 4 ° c voor 1 week.
  11. Steek de gel in de sandwich klemmen en verwijder de kam. Met de korte glazen plaat naar beneden, plaatst u de gel sandwich in de koeling kern. Herhaal aan de andere kant, en plaats kern in de elektroforese tank.
  12. Giet 300 mL blauwe kathode buffer binnen kamer van de elektroforese tank. Giet 2 L van de anode buffer in de buitenste kamer van de elektroforese tank.
    Opmerking: de elektrode moet worden ondergedompeld in kathode buffer, die ongeveer 300 mL vereist.
  13. Lading tussen 75 μg en 175 μg van proteïne per put. Run gel op 150 V voor 1,5 h (of totdat de monsters zijn allemaal opgenomen de gradiënt gel) in koude kamer (4 ° c).
    Opmerking 1:1) een minimum van 75 μg per well is vereist voor een goede resolutie van de in-gel activiteit bands. Het laden van meer dan 175 μg eiwit zal leiden tot een verlies van duidelijke banden als gevolg van overmatige enzymactiviteit. 2) replica van het monster moet worden geladen in afzonderlijke putten om parallelle bepaling van de in-gel activiteiten en immunoblot analyse van OXPHOS complexen mogelijk te maken. Parallelle bepaling van IGA voor CI, CII, CIV en CV vereist een minimum van 300 µ g. parallelle immunoblot analyse van CI, CII, CII, CIV en CV vereist een minimum van 375 µ g.
  14. Verwijder blauwe kathode buffer met pipet of vacuüm, vervang door 300 mL Coomassie blauw-vrije kathode buffer, en run gel op 200 V 's nachts (16-20 h) in koude kamer (4 ° c). Ga verder met stap 3 of 4 voor in-gel activiteit meting of immunoblotting.

3. in-gel activiteit voor complexen I, II, IV en CV

  1. Vóór het eind van elektroforese, bereid in-gel activiteit buffers volgens lijst 6voor, en houd in Dark bij RT. 20 ml van de in-gel activiteit buffer is voldoende voor 3 monster Lanes.
    Opmerking: deze CV in-gel activiteit assay is gebaseerd op de omgekeerde activiteit van ATPsynthase (dat wil zeggen, ATP hydrolyse), en maakt gebruik van calcium als een co-factor, die precipitaten in de gel. Calcium is minder schadelijk dan het lood dat in andere protocollen wordt gebruikt. Bovendien is het gebruik van dit protocol niet vereist een pre-activatie/conditionering van de gel23.
  2. Stop elektroforese en herstellen gel. Snij rijstroken, indien nodig, en de overdracht gel rijstroken in plastic zakken (3 zijden knippen, en plastic zak geopend als een boek). Seal 2 van de 3 zijden met een Heat sealer.
    Opmerking: om de samenstelling van SC-banden tussen experimentele groepen te vergelijken, is het raadzaam om dezelfde samples uit te voeren in replica's op dezelfde gel. Snijd rijstroken te bebroeden elke repliceren in verschillende in-gel activiteit buffers (CI, II, IV, V). Om de specificiteit van de analyses te bevestigen, kunnen extra replicaties worden bereid om in gel-activiteiten in aanwezigheid van specifieke ademhalingsketen inhibitors te lopen.
  3. Voor 3 experimentele monsters (dwz 3 Wells), Voeg 20 mL van de in-gel activiteit buffer, verwijder bubbels, en Seal 4th kant van plastic zak.
    Nota: Voeg inhibitors in negatieve controle experimenten toe indien uitgevoerd: CI: rotenon 1 µ M; CII: natrium malonaat 10 mM; CIII: Antimycin-A 8 µ M; CIV: KCN 0,6 mM; CV: Oligomycin 0,5 µ M.
  4. Incubeer gel rijstroken bij 37 °C in het donker en controleer elke 15 min. incubatietijd varieert afhankelijk van de hoeveelheid eiwitten en complexen. CI reageert sneller dan CIV of CV. optimale kleuring treedt meestal op na 2 uur voor CI, 4 h voor CIV en 6 u voor CII en CV.
  5. Spoel gel rijstroken in het water om de reactie te stoppen, en het beeld op een witte achtergrond voor CI, CII, CIV, of zwarte achtergrond voor CV.
    Let op: gels kunnen gedurende enkele maanden in plastic zakken bij RT of 4 °C bewaard worden.

4. immunoblotting

  1. Bereid Transfer buffer volgens tabel 7, en houden op rt. bereid TBST en houden bij RT.
  2. Plaats de hele gel, of geselecteerde rijstroken, in een container en voeg de overdracht buffer aangevuld met SDS (0,25% Final in Transfer buffer). Plaats de container op rocker en incubeer voor 1 uur.
  3. Snij PVDF membraan (grootte die overeenkomt met de grootte van de gel) en activeer in 20 mL methanol onder agitatie gedurende 2 minuten. Vervang door 20 mL overdrachts buffer en plaats onder agitatie gedurende 2 minuten.
  4. Bereid Transfer sandwich, van onder naar boven, zorg ervoor dat er geen zeepbel tussen gel en geactiveerd PVDF membraan: duidelijke kant van de cassette/zwarte spons/bevloeien papier/membraan/gel/Vloeipapier/zwarte spons/zwarte kant van de cassette. Sluit en vergrendel de cassette.
  5. Plaats Transfer sandwich in Transfer tank, met duidelijke kant van de sandwich geconfronteerd met de rode kant van de elektrode, en giet de overdracht buffer om de gel te imfusen. Sluit het koelsysteem aan op de transport tank en stel deze in op 4 °C. Verbind met de machtslevering, die bij 40 mA wordt geplaatst, en looppas voor 24 h.
  6. Ophalen membranen, blok voor 1 h in 5% BSA in TBST, en incubeer in primaire antilichaam oplossing bereid in 5% BSA in TBST overnachting bij 4 ° c.
    Opmerking: Zie tabel 8 voor gebruikte antilichamen.
  7. Spoel membranen in TBST 3x voor 10 min elk.
  8. Incubeer membranen in secundaire antilichaam oplossingen bereid in 5% BSA in TBST voor 2 uur bij kamertemperatuur.
  9. Spoel membranen in TBST 3x voor 10 min elk.
  10. Voeg chemiluminescentie oplossing voor membranen en beeld.

5. analyse

  1. In-gel activiteit assay beelden of immunoblots kan worden gebruikt om SCs te analyseren. Voor het analyseren van de samenstelling van bands, align repliceert en valideren welke complex positief reageerde voor elke bepaalde band.
  2. Voor het analyseren van de verdeling van complexen, in verschillende supramoleculaire assemblages, open afbeeldingen in ImageJ en gebruik de gel analyse tool (Zie Figuur 5 voor een voorbeeld).
    1. Selecteer rijstroken met de rechthoek gereedschap, en plot rijstroken.
    2. Teken lijnen om het gebied onder de kromme van elke banden van belang te sluiten en op elk gebied met het toverstokje te klikken om een lijst te produceren die het gebied onder de kromme waarden bevat.
    3. Voor de berekening van de verdeling van het complex, het verslag van de waarden voor elke band ten opzichte van die van het monomeer.

Resultaten

Figuur 2 toont de resultaten van een digitonin titratie experiment gericht op het identificeren van de juiste hoeveelheid digitonin die nodig is voor de extractie van SCs. Dit bedrag zal variëren afhankelijk van het type weefsel/cel en of het monster is bevroren of niet. Voor dit experiment werd een CIV in-gel activiteit uitgevoerd om te visualiseren SCs geïsoleerd van verse muis lever mitochondriën. De verhoudingen van 2/1 tot 10/1 g digitonin/g van proteïne werden getest. De optimale hoeveelheid digitonin voor dit monster is 4 g/g, want het biedt een goede resolutie van monomeer CIV, en een hoog moleculair gewicht SCs. Bij een lagere verhouding, zijn de banden niet duidelijk en lossen in een vlek tijdens elektroforese op, terwijl het gebruik van hogere verhouding van digitonin tot verstoring van hoog moleculair gewicht SC leidt.

Figuur 3 en Figuur 4 tonen de resultaten van een volledig experiment uitgevoerd op een voorbereiding van de muis lever mitochondriën geëxtraheerd met 4 g digitonin/g eiwit. De proteïnen werden gescheiden gebruikend hybride BN/CN-pagina, standaard BN-pagina, of CN-pagina. Alle drie gels werden gegoten op hetzelfde moment en de rijstroken werden geladen met replica's van dezelfde steekproef. Na elektroforese, werden de individuele stegen gesneden en werden verwerkt voor in de meting van de gel activiteit (CI, CII, CIV en CV op Figuur 3) en IMMUNOBLOTTING (CI, CII, CIII, CIV, CV op Figuur 4).

De toevoeging van CB of snel voorbijgaand in kathode buffer (d.w.z. hybride CN/BN-pagina) of in steekproef en kathode buffer door elektroforese (d.w.z. BN-pagina), verbetert aanzienlijk de mobiliteit en de resolutie van SC banden, en individuele Ademhalings complexen vergeleken met de GN-pagina (Figuur 3). Bands zijn gemakkelijk te onderscheiden met de hybride techniek of BN-pagina na in-gel activiteit voor CIV, terwijl in hetzelfde monster opgelost door CN-PAGE, SCs en monomeer CIV reactieve bands niet kunnen worden geïdentificeerd.

Figuur 3 en Figuur 4 tonen aan dat de resolutie en het band patroon van OXPHOS monomeren en supramoleculaire samenstellingen kwalitatief vergelijkbaar zijn tussen de hybride CN/BN-pagina en bn-pagina. Er bestaan echter opmerkelijke verschillen. Ten eerste, de elektroforetische mobiliteit van OXPHOS complexen is licht verminderd wanneer eiwitten worden gescheiden met behulp van hybride CN/BN-pagina voorwaarden VS standaard bn-pagina, als gevolg van verminderde hoeveelheid CB. Deze mobiliteitsverschuiving is groter voor de CIV-monomeren, gevolgd door CV-monomeren, en CI (Figuur 3 en Figuur 4). Ten tweede, de blauwe achtergrond is lager in de hybride CN/BN-pagina ten opzichte van BN-pagina (Figuur 3, left Lanes). Als gevolg hiervan, hoge achtergrondniveaus na BN-pagina volledig maskeert de in-gel activiteit kleuring voor CII, en verbetert de achtergrondgeluid in verband met de activiteit van de CIV dimeers (Figuur 3). Ten derde, de activiteit van CV is hoger wanneer monsters worden uitgevoerd onder hybride CN/BN-pagina voorwaarden ten opzichte van BN-pagina (Figuur 3), als gevolg van de verminderde hoeveelheid CB, waarvan bekend is dat interfereren met de CV-katalytische activiteit. 26 CN/bn-pagina maakt het ook mogelijk een betere bewaring van CV supramoleculaire samenstellingen, zoals blijkt uit een groter deel van de totale CV-activiteit wordt GEASSOCIEERD met CV dimeer (Figuur 3). Bovendien zijn CV oligomeren zichtbaar onder de GN/BN-pagina, terwijl ze volledig gescheiden zijn onder BN-pagina voorwaarden. Interessant is dat de verschillende bands die de CV-activiteit tonen ook worden waargenomen tussen CV-monomeren en dimeers, wanneer monsters worden uitgevoerd onder GN/BN-pagina (Figuur 2).

Figuur 5 toont een representatieve analyse van OXPHOS complexe distributie in supramoleculaire assemblages. Het beeld toont CI in gel activiteit van monsters verkregen uit 4 verschillende gezonde muis lever mitochondria preparaten. Densitometry analyse maakt het mogelijk om het gebied te meten onder de curve van CI-reactieve bands, en de relatieve verdeling van de C1-activiteit in de monomeer (I1) en supramoleculaire vormen (i1III2, i1III2IV te presenteren 1, I1III2IVn). Soortgelijke analyse kan worden uitgevoerd na immunoblot.

figure-results-1
Figuur 1: assay workflow. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Digitonin titratie om supercomplexen uittreksel uit verse muis lever mitochondria. Dit voorbeeld toont de hoeveelheid muis lever mitochondria, geïsoleerd van een dier dat werd behandeld met toenemende hoeveelheden van digitonin te halen respiratoire supercomplexen. Monsters werden vervolgens opgelost door hybride CN/BN pagina, en in-gel activiteit van CIV werd bepaald. CIV1: complexe IV monomeren; CIV2: complexe IV dimeer; SC: supercomplexen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: in-gel activiteit van OXPHOS complexen na hybride CN/bn-pagina, bn-pagina of CN-pagina. Lever mitochondriën geïsoleerd van de ene muis werden behandeld met digitonin (4 g/g verhouding digotonin/eiwit) om respiratoire supercomplexen te halen. De hoeveelheid van dit monster werd vervolgens op meerdere putten in drie verschillende gels geladen en naar GN/BN-pagina, BN-pagina of CN-pagina gezonden. Elke herhaling rijstrook binnen elke gel werd vervolgens gesneden en onmiddellijk gebruikt voor in-gel activiteit assays (gelabeld CI, CII, CIV en CV). Één steeg werd gebruikt als controle om achtergrond (geëtiketteerde BG) te tonen bevlekt met Coomassie blauw. OXPHOS complexen en supramoleculaire samenstellingen worden geïdentificeerd met behulp van de standaard nomenclatuur, met getallen in indices met vermelding van de moleculaire stoichiometrie van elk OXPHOS complex. Opgemerkt moet worden dat de positie van CIII-bevattende supramoleculaire assemblages is gebaseerd op immunodetection, omdat in-gel activiteit voor CIII werd niet uitgevoerd in dit specifieke experiment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: immunoblot analyse van OXPHOS complexen na hybride CN/bn-pagina of bn-pagina. Repliceert van de experimenten beschreven in de Figuur 3 legende werden Electro-overgedragen op een enkel membraan. Na overdracht, werden de individuele stegen gesneden en werden uitgebroed met specifieke antilichamen die CI, CII, CIII, CIV, en CV erkennen. OXPHOS complexen en supramoleculaire assemblages worden geïdentificeerd met behulp van de standaard nomenclatuur, met cijfers in indices met vermelding van de moleculaire stoichiometrie van elk OXPHOS complex. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: kwantificering van de CI-verdeling in monomeer en supramoleculaire assemblages. (A) CI in-gel activiteit bepaald na hybride CN/bn-pagina van in de lever mitochondria SC extracten verkregen uit 4 muizen. BDensitograms verkregen met behulp van de gel-analyse tool van ImageJ met verschillende pieken die overeenkomen met de CI-monomeren (i1) en diverse CI-bevattende supramoleculaire-complexen (i1III2, i1III2IV1 , en I1III2IVn). Ckwantificering van de relatieve verdeling van de C1-activiteit. De gegevens vertegenwoordigen betekenen en SEM van de 4 muizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Digitonin/eiwit verhouding (g/g)2 g/g4 g/g6 g/g8 g/g
Volume van de extractiebuffer (µ L)400300200100
Volume van 10% voorraad digitonin (µ L)100200300400
Totale extractiebuffer volume (µ L)500500500500

Tabel 1: volumes die nodig zijn om SCs te halen uit 5 mg mitochondriale eiwitten met behulp van verschillende digitonin/eiwit ratio's.

SamengesteldeEindconcentratie
EDTA, pH 7,51 mM
HEPES30 mM
Kaliumacetaat150 mM
Glycerol12
6-aminocaproic zuur2 mM

Tabel 2: SC extractiebuffer (eindconcentraties). Houd bij 4 °C voor een maximum van 3 maanden.

SamengesteldeEindconcentratie
3X gel buffer: Hoeveelheid en houd bij-20 °c, pH 7,5
Imidazool/HCl pH-7,075 mM
6-aminocaproic zuur1,5 M
Acrylamide buffer: Hoeveelheid en houd bij-20 °c
Acrylamide99,5%
Bis-acrylamide3

Tabel 3: gel voorraad buffers.

Voor 2 gels:4% (60 mL)12% (60 mL)Stapelen (4%) (25 mL)
3X gel buffer19,8 mL19,8 mL8,25 mL
Acrylamide buffer4,8 mL14,4 mL2 mL
H2O35 mL13,1 mL14,6 mL
Glycerol-12 mL-
APS 10%360 l60 l150 l
TEMED24 l12 l10 l

Tabel 4:4% – 12% gradiënt gel.

SamengesteldeEindconcentratie
Anode buffer: Houd bij 4 °C, pH 7,5
Imidazool25 mM
Kathode buffer: Houd bij 4 °C, pH 7,5
Tricine50 mM
Imidazool7,5 mM
Met of zonder Coomassie blauw (G250)0,022%

Tabel 5: elektroforese buffers.

SamengesteldeEindconcentratie
Complexe I activiteit buffer: bereiden vers in 5 mM TRIS-HCl pH 7,4
Nitrotetrazolium blauw3 mM
NIKS14 mM
Complex II activiteit buffer: bereiden vers in 5 mM TRIS-HCl pH 7,4
Succinaat20 mM
PMSF0,2 mM
Nitrotetrazolium blauw3 mM
Complex IV activiteit buffer: bereiden vers in 50 mM na-fosfaat pH 7,2
Cytochroom Callebaut0,05 mM
Diaminobenzidine2,3 mM
ATPsynthase activiteit buffer: bereiden vers in het water, aan te passen pH tot 8 met KOH
Glycine50 mM
MgCl2 5 mM
HEPES50 mM
CaCl2 30 mM
Atp5 mM

Tabel 6: in-gel activiteit assay buffers.

SamengesteldeEindconcentratie
Overdracht buffer
Tris base25 mM
Glycine192 mM
Sds4
Methanol20
TBST
Tris base20 mM
Nacl137 mM
Tween 200,1%

Tabel 7: immunoblotting buffers.

ComplexeSubunitKloon
INDUFA920C11B11B11
IiSDHA2E3GC12FB2AE2
IiiUQCRC213G12AF12BB11
IvCOX41D6E1A8
VATPB3D5

Tabel 8: antilichamen gebruikt voor immunoblotting te detecteren respiratoire keten SC. Zie tabel met materialen voor bedrijven en lotnummers.

Discussie

Mitochondriale supercomplexen worden actief bestudeerd om hun fysiologische rol te verhelderen, en hun belang in de pathogenese van tal van menselijke ziekten, of ze zijn verworven of genetische mitochondriale ziekten3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. om betrouwbare resultaten te behalen, moeten verschillende aspecten in overweging worden genomen. Dit protocol is getest met muis lever mitochondriën, muis skeletspier mitochondria (resultaten niet getoond), rat Heart mitochondria, en de menselijke fibroblast mitochondriën (resultaten niet getoond), maar kan zeker worden aangepast aan andere bronnen van geïsoleerde Mitochondria. De methode combineert verschillende aspecten van bn-en CN-pagina protocollen, die het mogelijk maken de blootstelling aan detergenten en anionische verbindingen tot een minimum te beperken ten opzichte van de gepubliceerde protocollen20,27,28.

Monstervoorbereiding

Monstervoorbereiding is een cruciale stap voor een succesvolle scheiding van SCs. buffer samenstelling moet zorgvuldig worden geselecteerd om een goede oplosbaar maken van eiwitten en eiwitten samenstellingen te bereiken, met behoud van zoveel mogelijk hun functionele en structurele integriteit. Ionische sterkte en pH van de extractiebuffer zijn twee belangrijke factoren te overwegen. Zoutconcentraties die te laag zijn (< 50 mM K-acetaat of NaCl) zal resulteren in een slechte oplosbaar maken van eiwitten in aanwezigheid van niet-ionische detergenten, terwijl de zoutconcentraties boven 500 mM zal bevorderen eiwit stapelen/aggregatie, en neerslag van CB en proteïnen29. SCs moet daarom worden geëxtraheerd met behulp van buffers in de buurt van fysiologische Ionische sterkte. Met betrekking tot pH, wordt het gebruik van een dichtbijgelegen fysiologische pH geadviseerd.

Wasmiddel type en detergent/eiwit ratio zijn ook van cruciaal belang voor een optimale SC extractie. Voor het maximale behoud van native SCs, digitonin heeft de voorkeur26. Zoals blijkt uit het huidige protocol en andere gepubliceerde methoden23,30,31,32, dit milde wasmiddel behoudt de supramoleculaire samenstelling van meerdere SC assemblages, en de dimeer en Oligomere structuur van ATPsynthase (Figuur 3 en Figuur 4). De titratie van de steekproeven van belang met diverse hoeveelheden van digitonin is kritiek om de voorwaarden te identificeren die optimale oplosbaar maken, terwijl het bewaren van enzymactiviteit en fysiologische eiwitinteractie toelaten. Titratie moet worden uitgevoerd met ratio's variërend tussen 2 en 8 g/g26. Optimale resultaten voor lever, skeletspieren en cardiale mitochondriën zijn respectievelijk verkregen met 4,5, en 6 g digitonin/g eiwit. Opgemerkt moet worden dat digitonin kan worden vervangen door Triton X-100, die in optimale omstandigheden resulteert in soortgelijke migratie en SC samenstelling als die waargenomen met digitonin2. Echter, dit wasmiddel moet worden gebruikt met de nodige voorzichtigheid, omdat relatief kleine stijging van het wasmiddel/eiwit ratio (bijvoorbeeld van 1 tot 1,5 g/g) kan resulteren in een volledige dissociatie van SCs assemblies2, wat kan resulteren in experimentele inconsistenties. Na extractie, worden de steekproeven traditioneel aangevuld met Coomassie blauw om proteïnen een last te geven wanneer toegepast op de gel, behalve traditionele CN-pagina20,26. Om eiwit blootstelling aan Coomassie blauw en potentiële scheiding van labiele proteïnen te minimaliseren, worden de steekproeven niet aangevuld met Coomassie blauw in dit protocol.

Elektroforese

Zowel CN-PAGE en BN-pagina zijn gebruikt om mitochondriale OXPHOS complexen studie, elk van hen met verschillende voordelen en beperkingen. De mildere voorwaarden die onder CN-pagina worden gebruikt (hoofdzakelijk het ontbreken van CB, die een detergens-als effect heeft), staat beter behoud van ATP synthase in-gel activiteit toe, en beperkt de scheiding van labiele proteïnen in hoog moleculair gewicht SCs en ATP synthase samenstellingen26. Nochtans, veroorzaakt de afwezigheid van de anionic kleurstof CB in het eiwit uittreksel en de elektroforese buffers de proteïnen om te migreren gebaseerd op hun intrinsieke last en ISO punt, dat de elektroforetische mobiliteit van proteïnen binnen gel26vermindert. Bovendien, in de afwezigheid van CB, eiwitten met onvoldoende negatieve lading de neiging om aggregaat, waardoor de resolutie van eiwitcomplexen in de gel20,26. Om deze beperkingen te omzeilen, is de zogeheten hoge-resolutie CN-pagina ontwikkeld door Wittig en Schragger20. In dit protocol, natrium deoxycholate (DOC) en diverse milde niet-ionische detergenten (DDM, Triton X100) worden toegevoegd aan de kathode buffer te houden membraaneiwitten solubilized en een negatieve lading verschuiving op te leggen eiwitten, wat resulteert in een aanzienlijke verbetering van resolutie20.

Een onderscheidend kenmerk van het huidige hybride CN/BN-protocol is dat zonder deze detergenten een vergelijkbare resolutie kan worden bereikt. Kortstondige toevoeging van CB aan de kathode buffer aan het begin van de elektroforese volstaat om eiwit aggregatie te beperken en de mobiliteit in de gel te verbeteren (Figuur 3 en Figuur 4). Als gevolg hiervan, deze hybride techniek maakt een uitstekende resolutie van verschillende SC assemblages en zeer lage of geen blootstelling aan detergenten. De aanwezigheid van lage bedragen van CB maakt het ook mogelijk een betere bewaring van CV-activiteit, een betere bewaring van dimeer en oligomere CV samenstellingen (Figuur 3 en Wittig en Schägger 200526), en een vermindering van de blauwe achtergrondgeluid dat kan de kwantificering van de gel-activiteiten belemmeren, met name voor CII en CIV (Figuur 2). Bovendien beperkt de afwezigheid van CB in het eiwit extract de verstoring van labiele-Eiwitinteracties binnen SCs. Bijvoorbeeld, fysieke vereniging van de ATP synthase met ANT om de synthasome 33 of met Cyclophilin-D te vormen om PTP opening 34 te reguleren zijn beter te zien in afwezigheid van CB. Kortstondige blootstelling aan CB tijdens elektroforese slechts kan daarom nuttig zijn om nieuwe eiwitinteractie binnen SCs te openbaren. in het algemeen maakt dit hybride CN/BN-pagina Protocol het mogelijk om nauwkeurige en snelle gel-activiteit metingen te combineren met analytische technieken die 2D elektroforese, immuun-opsporing en/of Proteomics voor geavanceerde analyse van SCs impliceren. Opgemerkt moet worden dat met de groeiende belangstelling voor SCs, een toenemend aantal studies gebruik kleine 10 x 10 cm gels voor native pagina. Hoewel deze aanpak kan voldoende zijn om grove veranderingen in de overvloed SC assemblages te identificeren, de lagere scheiding capaciteit van kleine gels is waarschijnlijk beperkt tot subtiele herschikkingen op te lossen of om verschillende bands gesneden voor Proteomic analyse. Bovendien, verschillende studies met behulp van kleinere gels hebben gemeld dat de respirasome migreert op dezelfde grootte als de ATPsynthase dimeer, waardoor het moeilijk is om ze te scheiden22. Daarom moet het gebruik van grote gels worden begunstigd.

Dankbetuigingen

De auteurs willen bedanken Jenna Rossi voor technische bijstand, en Dr. Mireille Tina, Dr. David Patten en Dr. Joeri Anil Kumar voor nuttige discussie, terwijl de ontwikkeling van deze methode. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese instituten van het onderzoek van de gezondheid (CIHR) en de nationale wetenschappen en techniek Raad van Canada (NSERC). AC is een ontvanger van Doctoral Award-Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate beurzen (CIHR).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrateSigmaD5637
6-amino caproic acidsigmaA2504
AcrylamideSigmaA3553
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydratesigmaA3377
Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial MarkerAbcamab14730Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438
Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2]Abcamab14715Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433
Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11]Abcamab14745Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640
Bis N,N'-Methylene-Bis-AcrylamideBiorad1610201
Brilliant Blue GSigma27815
COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8)Invitrogen459600Lot number TI2637158, RRID AB_2532240
Cytochrome c from equine heartsigmaC7752
DigitoninSigmaD141
Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic PumpsThermo Fisher13-310-660
ImidazoleSigmaI0250
Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plateBiorad1651823
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systemsBiorad1654120
NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11)Invitrogen459100Lot number TD2536591, RRID AB_2532223
Nitrotetrazolium Blue chlorideSigmaN6639
Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plateBiorad1651824
Phenylmethanesulfonyl florideSigmaP7626
Powerpack 1000BioradSerial Number 286BR 07171
PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 rightBiorad1651902
PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combsBiorad1651811
PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cellBiorad1651873
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cardsBiorad1652025
PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cellBiorad1651849
SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100VWR11215-388
Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassetteBiorad1703956
Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paperBiorad1703939

Referenties

  1. Shagger, H. Respiratory Chain Supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  2. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  3. Greggio, C., et al. Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
  4. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  5. Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
  6. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  7. Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly. Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria. The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).
  10. Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
  11. D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids. Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).
  12. Antoun, G., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals. Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).
  13. Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -E. Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. , (2018).
  14. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  15. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients. Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).
  16. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).
  17. Jang, S., et al. Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).
  18. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).
  19. Krause, F. Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).
  20. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
  21. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  22. Jang, S., Javadov, S. Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles. Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).
  23. Cuillerier, A., et al. Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion. Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).
  24. Pallotti, F., Lenaz, G. Methods in Cell Biology. 80, Academic Press. 3-44 (2007).
  25. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nature Protocols. 4, 1582(2009).
  26. Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  27. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  28. Beutner, G., Porter, G. A. Jr Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. Journal of Visualized Experiments. (124), e55738(2017).
  29. Von Hagen, J. Proteomics Sample Preperation. , Wiley InterScience. 485(2008).
  30. Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., García-Trejo, J. J. Structure of dimeric F1F0-ATP synthase. The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).
  31. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  32. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  33. Wittig, I., Schägger, H. Structural organization of mitochondrial ATP synthase. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).
  34. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887(2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hybride Clear Blue Native PAGEsupercomplex scheidingsanalysedigitonine extractie van mitochondri ngradi ntgelelektroforesein gel activiteitsassaysCoomassie Blue blootstellingeiwit eiwitinteracties2D elektroforese analyseimmunodetectie proteomics

Gerelateerde artikelen