Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping

Summary

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor het resuspenderen en kweken van menselijke stamcel afgeleide neuronen die eerder werden onderscheiden van neurale voorlopercellen in vitro voor meerdere weken. De procedure vergemakkelijkt op beeld gebaseerde assays van neurites, synapsen, en laat-uitdrukken neuronale markers in een formaat dat compatibel is met lichte microscopie en High-content screening.

Abstract

Neuronen onderscheiden in tweedimensionale cultuur van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neurale voorlopercellen (Npc's) vormen een krachtig modelsysteem om ziekte mechanismen te onderzoeken en High content screening (HC'S) uit te voeren voor interrogaat verbinding bibliotheken of Identificeer genmutatie fenotypes. Echter, met menselijke cellen de overgang van NPC naar functioneel, volwassen neuron vereist enkele weken. Synapsen beginnen meestal te vormen na 3 weken van differentiatie in monolaag cultuur, en verschillende neuron-specifieke eiwitten, bijvoorbeeld de later uitdrukken pan-neuronale marker neun, of de laag 5/6 cerebrale corticale neuron marker CTIP2, beginnen te uiten ongeveer 4-5 weken na differentiatie. Deze lange differentiatie tijd kan onverenigbaar zijn met optimale cultuuromstandigheden die worden gebruikt voor kleine volumes, multi-well HCS-platformen. Onder de vele uitdagingen zijn de behoefte aan goed-nageleefd, uniform verdeelde cellen met minimale celclustering, en cultuur procedures die lange termijn levensvatbaarheid en functionele Synapse rijping bevorderen. Een benadering is het differentiëren van neuronen in een groot volume formaat, en ze vervolgens opnieuw op een later tijdstip in HCS-compatibele multi-Wells. Enkele belangrijke uitdagingen bij het gebruik van deze replating aanpak betreffen reproduceerbaarheid en de levensvatbaarheid van de cel, als gevolg van de stressvolle verstoring van het dendritische en axonale netwerk. Hier demonstreren we een gedetailleerde en betrouwbare procedure voor enzymatisch resuspenderende menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen na hun differentiatie voor 4-8 weken in een groot volume formaat, overbrengen naar 384-well micro titer platen, en kweek ze voor nog eens 1-3 weken met uitstekende overleving van de cel. Deze replating van menselijke neuronen kan niet alleen de studie van Synapse assemblage en rijping binnen twee weken na het replating, maar maakt ook studies van neuriet regeneratie en groei kegel kenmerken. We bieden voorbeelden van schaalbare assays voor neuritogenesis en synaptogenese met behulp van een 384-well platform.

Introduction

Menselijke pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen worden steeds relevanter op het gebied van fundamenteel onderzoek, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Workflows en procedures om hun cultuur en onderhoud te optimaliseren en de efficiëntie van differentiatie in specifieke neuronale subtypen te verbeteren, evolueren snel^1,2. Om het nut en de kosteneffectiviteit van menselijke stamcel afkomstige neuronen te verbeteren als modelsystemen die vatbaar zijn voor analyses met een hoog gehalte in geneesmiddelen ontdekking en doel validatie, is het nuttig om de kweektijd te verlagen die nodig is voor het genereren van volwassen, functionele neuronen, met behoud van maximale robuustheid, reproduceerbaarheid en fenotype relevantie. Hoewel 3-dimensionale organoïde-culturen doorbraken in neuroontwikkelingsonderzoek rijden, zijn 2-dimensionale monolaag-culturen met name compatibel met geautomatiseerde beeldvormings toepassingen vanwege hun minimale weefsel dikte.

Echter, de aanpassing van Imaging-gebaseerde screeningmethoden aan modellen van menselijke neurologische en neuroontwikkelingsziekte wordt geconfronteerd met een grote uitdaging. Het langdurige tijdsbestek waarover het menselijk zenuwstelsel in vivo rijpt, vereist uitgebreide tijd in cultuur om tegemoet te komen aan natuurlijke Programma's van genexpressie en neuronale rijping te bereiken.

Een praktisch gevolg van het lange neuronale differentiatie programma is dat het onderhoud van de met hipsc afgeleide monolaag culturen gedurende vele weken moet worden gehandhaafd om een adequate Synapse maturiteit te bereiken. Gedurende deze tijd, neurale voor ouders die ongedifferentieerde blijven blijven verdelen. Deze kunnen de cultuur snel overgroeien en de nutriënten-inhoud die nodig is om levensvatbare postmitotische neuronen te behouden. Krachtig verdelen neurale voorlopercellen (Npc's) kan ook concurreren met neuronen voor de groei substraat. Hierdoor kunnen dergelijke culturen worden onderworpen aan problemen met een slechte hechting, een aandoening die ongeschikt is voor op beeldvorming gebaseerde assays. Bovendien vinden veel onderzoekers dat hoe kleiner het cultuur volume, hoe groter de moeilijkheid bij het handhaven van gezonde populaties van gedifferentieerde neuronen lang genoeg om de late stadia van neuronale differentiatie te observeren. Met andere woorden, assays van Synapse rijping met behulp van High content screening (HCS) benaderingen kunnen zeer uitdagend voor menselijke-afgeleide neuronen.

Om sommige van deze problemen te omzeilen, is een procedure voor het opnieuw opschorten en replating van eerder gedifferentieerde hiPSC-afgeleide neuronen gebruikt. Ten eerste, het maakt de studie van neuriet uitgroei (of, nauwkeuriger, neuriet regeneratie) in een populatie van volledig betrokken neuronen. Ten tweede, de herbeplating van eerder gedifferentieerde neuronen uit een groot volume formaat (zoals 10 cm platen of groter), tot kleine volume formaten (zoals HCS-compatibele 96-of 384-well microtiterplaten) maakt een significante reductie in de totale kweektijd in de kleine volume conditie. Dit vergemakkelijkt de studie van Synapse assemblage en rijping in de daaropvolgende weken in vitro.

Echter, de replating van volwassen neuronen die al hebben vastgesteld lange neurites en een complex connectiviteits netwerk presenteert verschillende uitdagingen, waarvan één is de soms hoge en variabele snelheid van celdood. Hier beschrijven we een replating procedure die resulteert in uitstekende celoverleving en reproduceerbaarheid. Gewoonlijk worden neuronen blootgesteld aan Proteolytische enzymen voor korte incubatie perioden (meestal ~ 3-10 min) om cellen los te maken van het substraat voorafgaand aan de trituratie. Deze korte proteolyse tijd wordt gewoonlijk gebruikt voor het resuspenderen en doorvoeren van vele soorten scheidings cellen, waaronder niet-neuronale cellen en ongedifferentieerde voor ouders^4,5,6. Echter, voor gedifferentieerde neuronen met lange, onderling verbonden neurites, is het essentieel niet alleen om cellen los te koppelen van het substraat, maar ook om het dendritische en axonale netwerk te verstoren om individuele cellen te isoleren terwijl de schade wordt geminimaliseerd. Inderdaad, een dik gevlochten van neuronen meestal de neiging om los te koppelen van het substraat als een enkel blad, in plaats van als individuele cellen. Als er geen zorg wordt genomen om het dikke netwerk van neurites los te maken, worden neuronen niet alleen onomkeerbaar beschadigd tijdens de trituratie, maar velen van hen verzuimen het filter te passeren dat wordt gebruikt om klonten te verwijderen, wat resulteert in een slechte celopbrengst. Hieronder beschrijven we een eenvoudige wijziging van een veelgebruikte incubatie procedure voor protease om deze moeilijkheden tegen te gaan.

In het hieronder beschreven protocol worden neuronen gedurende 40-45 minuten geïnnobeerd met een milde protease, zoals het Proteolytische enzym (bijv. Accutase). Tijdens de eerste 5-10 min na het toevoegen van het enzym, het neuronale netwerk Tilt van de ondergrond als een blad. De incubatie met de protease gaat nog 30-40 minuten mee voordat de zachte trituratie en filtering wordt voortgezet. Deze extra incubatietijd zorgt ervoor dat de vertering van het materiaal het intercellulaire netwerk ontspant, zodat de daaropvolgende trituratie een suspensie van individuele cellen oplevert. Deze procedure maximaliseert de uniformiteit van de celverdeling bij het replating, terwijl de celdood wordt geminimaliseerd. We hebben deze replating methode met succes toegepast op door hipsc afgeleide neuronale culturen, gegenereerd door verschillende differentiatie protocollen^7,8 en verschillende lijnen van hipscs. De procedure is nominaal geschikt voor gebruik met de meeste of alle lijnen van stamcel afgeleide neuronen. We hebben geconstateerd dat een verlengde incubatietijd van de protease niet absoluut noodzakelijk is voor het replating van culturen uit kleine formaat platen (bijv. 35 mm diameter); echter, zoals we hier laten zien, biedt het een significant voordeel bij het replating van platen met grote diameter (bijv. 10 cm diameter of groter), waarschijnlijk omdat neurites in dergelijke platen zeer lange processen kunnen verlengen en een dicht met elkaar verbonden array vormen.

Hier demonstreren we deze methode en illustreren kort de toepassing ervan in assays voor vroege neuritogenesis en voor Synapse rijping, waarbij clustering van pre-en postsynaptisch eiwitten langs de dendrieten en axonen, gevolgd door hun latere colokalisatie op synaptische sites. De voorbeelden wijzen op de voordelen die dit protocol biedt bij het behoud van de levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid van cellen. Ten eerste staat het onderzoekers toe om vroege stappen in menselijke neuritogenese te bestuderen. De experimentele instelling is vergelijkbaar met de veelgebruikte primaire culturen van knaagdieren corticale of hippocampal neuronen, waar cellen worden geëxtraheerd uit de late foetale of vroege postnatale hersenen, gezien door trituratie na milde protease behandeling, en toegestaan om te initieert neurites of regenereren neurites die in de procedure^9,10werden verbroken. Vergelijkbaar met dergelijke knaagdieren primaire neuronen, hiPSC-afgeleide neuronen beginnen te vormen of hun neurites regenereren binnen enkele uren na het replating, waardoor Imaging van groei kegels en neuriet morfologie in een omgeving die optimaal is voor hoge spatiotemporele beeldvorming met minder Omringende ongedifferentieerde cellen. We hebben geconstateerd dat neuriet uitgroei is meer gesynchroniseerd in vergelijking met de variabele vertragingen en verschillende uitgroei percentages gezien wanneer neuronen beginnen te onderscheiden van een voorlopercellen populatie. Bovendien, replating maakt assays van neuronen die neuronale subtype markeringen die meestal verschijnen later in neurale ontwikkeling, zoals de corticale laag 5/6 transcriptiefactor CTIP2 (kip ovalbumine upstream Promoter transcriptie factor-interactie eiwit 2), of de pan-neuronale marker NeuN¹¹. Een bijzonder nuttig kenmerk van de replating aanpak is dat synaptogenese verloopt binnen een tijdsbestek compatibel met HCS.

Protocol

1. differentiatie periode voorafgaand aan de Herbeplating

1. Differentiëren neuronen op 10 cm gerechten, met behulp van een protocol van keuze^7,8 totdat neuronen een dik netwerk met hun processen hebben gevormd en uiten niet alleen vroege neuronale markers zoals map2 of TuJ1, maar ook late markers zoals neun.
2. Verander de helft van het medium naar keuze elke 4 dagen tijdens het neuronale differentiatieproces.
   Opmerking: meer uitgebreide of frequente veranderingen in het medium verdunnen essentiële trofische factoren, en zou de rijping kunnen verteren.
   1. Voor de IPSC-afgeleide WT126 neuronen, gebruik maken van de volgende post-differentiatie kweekmedia: 5 ml 100x N2 supplement, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml gdnf, 1 μg/ml laminin, 200 μM ascorbinezuur, 1 μM dibutyryl-Camp en 10 ml SM1 voor 500 ml dulbecco's gemodificeerde eagle's medium/ mengsel van nutriënten F-12 (DMEM/F12). Geleidelijk, met behulp van half-media veranderingen, vervangen door neurale basale medium (tabel van materialen) en dezelfde supplementen.
   2. Voor de IPSC-afgeleide CVB WT neuronen, gebruik de volgende post-differentiatie kweekmedium: 500 ml neurale basal een medium (tabel van de materialen) en 500 ml DMEM/F12 medium met 2 μg/ml laminin, 10 ml glutamine supplement (tabel van de materialen), 0,75 mg/mL natriumbicarbonaat, 5 mL minimaal essentieel medium (MEM) niet-essentiële aminozuren, 0,2 mM ascorbinezuur, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 en 10 mL 100x N2 supplement.

2. coating multi Wells

1. De dag voor het replating, vacht met poly-L-Ornithine (PLO). Los PLO in steriel water op om een stamoplossing te maken (10 mg/mL). Bewaar deze kolf bij-20 °C. Verdun de PLO 1:100 in water om een concentratie van 50 μg/mL te leveren bij coating glas en 1:1.000 ratio (10 μg/mL) bij het coaten van kunststof.
2. Breng de coating direct op de doelplaten aan. Gebruik het volume van de coating die past bij de plaatgrootte (d.w.z. voor een 24-goed plaat Breng 500 μL PLO-oplossing per put aan).
3. Laat de platen 's nachts in het donker zitten bij kamertemperatuur.
4. Haal de gecoate platen op de dag van het replating op en breng deze over naar een steriele bioveiligheidskast.
5. Aspireren de PLO-oplossing en spoel tweemaal met steriel water.
6. Verdund laminine (1,15 mg/mL) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 1:400 verdunning.
   Opmerking: Ontdooien laminine bij 4 °C en voeg snel toe aan PBS om aggregatie van laminine en ongelijke coating te voorkomen.
7. Aspireren steriel water en breng 500 μL laminine coating aan putten eerder bedekt met PLO.
8. Plaats de platen in een incubator van 37 °C voor een minimum van 4-6 h. gebruik langere incubaties tot 16 uur voor glazen oppervlakken. Gebruik consistente incubatie tijden.

3. replating gedifferentieerde neuronen

1. Reinig de plaat van gedifferentieerde neuronen met PBS eenmaal zachtjes. Dispergeer PBS zachtjes langs de wand van de plaat, en niet rechtstreeks op de cellen, om te voorkomen dat ze worden verstoord.
2. Zachtjes aspireren PBS, voorzichtig zijn om te voorkomen dat het aanraken van de cellen rechtstreeks, maar te aspireren vanaf de rand van het gerecht terwijl het kantelen naar de onderzoeker.
3. Breng ten minste 1 mL van het Proteolytische enzym (tabel met materialen) per 10 cm plaat aan en keer de cellen terug naar de incubator. Voeg iets hogere volumes toe als de weefselkweek kamer een hoge verdampingssnelheid vertoont als gevolg van een lage luchtvochtigheid.
4. Incuberen cellen met proteolytisch enzym voor 40-45 min om ze los te maken van de plaat en ze los te maken van andere neuronen binnen het neuronale netwerk.
   Opmerking: Timing bij deze stap is van cruciaal belang. De protease te vroeg afschrikken kan leiden tot een verhoogde celdood na het replating. De fabrikant van het Proteolytische enzym raadt aan dat temperaturen die veel lager zijn dan 37 °C worden gebruikt met langere incubatie perioden voor het doorvoeren van cellijnen (bijv. 's nachts bij 4 °C). Het hanteren van neuronen bij 4 °C dient echter te worden vermeden, omdat ze vaak een slechte overleving vertonen na een koude blootstelling. De fabrikant verklaart ook dat een incubatie van 60 minuten met het enzym bij 37 °C leidt tot de enzymatische inactivatie. Echter, in de ervaring van de auteurs, een 40-45 min incubatie van de hiPSC afkomstige neuronale culturen bij 37 ° c is voldoende voor efficiënte dissociatie en uitstekende neuronale overleving bij het replating.
5. Controleer de neuronen op een fase-contrast Microscoop tijdens de incubatietijd en laat de protease behandeling doorgaan tot het neurale netwerk volledig loskomt van de plaat en begint te breken in kleinere vellen bij het kort schudden van de plaat onder de Microscoop.
6. Quench de protease activiteit met 5 mL verse DMEM-media per 1 mL protease in de 10 cm-plaat om de spijsvertering te stoppen. Schud de cellen voorzichtig tegenplaat 5-8 keer om het netwerk te verstoren met behulp van serologische pipetten. Wees voorzichtig niet te veel druk toe te passen bij het tritureren, als gedifferentieerde neuronen zijn kwetsbaar. Gebruik niet een P1000 tip, als het einde is te scherp en smal, en dus kan pure of beschadiging van de neuronen.
7. Breng oplossing met cellen aan via een celzeef met een diameter van 100 μm mesh in een verse 50 mL conische buis druppel voor druppel.
8. Spoel de zeef af met nog 5 mL verse DMEM media, nadat de cellen zijn gefiltreerd.
9. Spin cellen in tafel centrifuge bij 1.000 x g gedurende 5 min.
10. Keer de conische buis terug naar de bioveiligheid-kast en zuig het grootste deel van de media op en laat ongeveer 250 μL om ervoor te zorgen dat de cellen vocht vasthouden.
11. Respendeer cellen zachtjes in 2 mL verse DMEM media. Pipetteer de pellet niet tegen de zijkant van de buis. Inverteer in plaats daarvan de conische 2-3 keer zachtjes en geef cellen door aan het einde van een serologische Pipet van 5 mL om ze af te maken.
12. Breng 10 μL geresuspendeerde neuronen aan op de rand van een hemocytometer.
13. Voeg 8-10 μL trypan Blue toe aan de druppeltjes cellen om de levensvatbaarheid van de cel te beoordelen tijdens deze resuspensie stap. Breng 10 μL van dit mengsel aan op de hemocytometer of andere automatische celloketten. Beoordelen als levensvatbaar die cellen die fase helder zijn en uitsluiten van de trypan blauwe kleurstof.
14. Bepaal de hoeveelheid levensvatbare cellen/mL en bereid u voor om de inhoud van de conische buis te verdunnen volgens de gewenste celdichtheid.
15. Plaat ~ 10.000 cellen per put voor een 384-goed plaat; plaat ~ 150000-200000 cellen per put voor een 24-goed plaat.
16. Voeg verse DMEM toe aan de conische buis van geresuspendeerde cellen om de juiste verdunning te bereiken en Voeg aanvullende passende supplementen zoals B27 en/of BDNF toe, afhankelijk van de vereisten van de specifieke cellijn.
17. Kantel de conische buis zachtjes om 2-3 keer te mengen.
18. Aspirate laminine coating van de 24-Well plaat, of van de 384-well multi well plaat met behulp van een 16-kanaals pipet en spoel één keer met PBS.
19. Aspirate PBS met behulp van een P1000 voor de 24-Well plaat, of de 16-kanaals pipet voor 384-well platen.
20. Breng de celoplossing aan op elk goed in een figuur 8-beweging om klontering te voorkomen. Plating uniformiteit kan ook worden geoptimaliseerd door gebruik te maken van geautomatiseerde vloeistofbehandelings apparaten.
    Opmerking: De toevoeging van laminine aan de media vanaf 2-4 dagen na het replating ook helpt bij het handhaven van een homogene verdeling van de cellen.
21. Herhaal stap 3,19 en 3,20 voor elke put.
22. Keer de plaat terug naar de incubator ingesteld op 37 °C en 5% CO₂.
23. Na 2 dagen, beginnen met het veranderen van de helft van het medium elke 4 dagen met behulp van de post-differentiatie kweekmedia beschreven in paragraaf 1,2. Na de gewenste rijpingstijd, fixeer culturen met behulp van 3,7% formaldehyde bij 37 °C en vlekken cellen volgens de experimentele eisen.

4. levensvatbaarheid van de cel assays post-replating

1. Voeg de Early Cell Death Reporter (VivaFix: 0,5 μL van de 50 μL stamoplossing per goed van 500 μL kweekmedia per put) toe na een korte voorraad van de stamoplossing.
2. Beeld de levende en dode cellen gekweekt op glazen bodem multi Wells, na 20 min, zonder enige wasstap, aangezien de kleurstof fluoresceert slechts eenmaal in de cellen, of Fix en co-vlek met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en/of andere antilichamen voorbeeld vorming met behulp van een confocale Microscoop.

5. immunokleuring

1. Repareer culturen met 3,7% formaldehyde in PBS Plus 120 mM sucrose gedurende 20 minuten bij 37 °C.
2. Spoel en permeabilize met 0,2% Triton X-100 gedurende 5 min bij kamertemperatuur en blok vervolgens gedurende 30 minuten met 2% boviene serumalbumine (BSA).
3. Aspirate de BSA zonder spoelen en inbroed voor 1 uur bij kamertemperatuur met konijn anti-MAP2 antilichaam 1:1000, muis anti-β3 tubuline (TuJ1) antilichaam 1:2000, kip anti-NeuN antilichaam (1:100) en rat anti-CTIP2 antilichaam (1:500), of met muis anti-PSD95 ( 1:200), konijn anti-synapsin 1 (1:200) en kip anti-MAP2 antilichaam voor synaptische kleuring.
4. Spoel af met PBS en inincuberen met de met fluor geconjugeerde secundaire antilichamen plus DAPI voor 45 min bij 37 °C.
5. Spoel ten slotte tweemaal met PBS voor Imaging.

6. calcium beeldvorming

1. Besmetten gekweekte cellen met AAV8-SYN-jGCAMP7f-WPRE (het Salk Instituut voor biologische studies, GT3 kern faciliteit) op 10 dagen na replating en beeld om spontane calcium transiënten te beoordelen op 3-4 weken na het replating.

7. beeld verwerving en-analyse

Opmerking: Voor meer informatie over het acquisitie systeem verwijzen wij u naar Calabrese et al.¹².

1. Gebruik een Imaging module voorhand matige of geautomatiseerde beeld verwerving en een software module voorbeeld analyse, zoals CellProfiler¹³, voor morphometrische metingen.
2. Bereken de gemiddelde lengte van TuJ1 positieve neurites en MAP2 positieve dendrites door het meten van de totale lengte per gezichtsveld gedeeld door het aantal neuronen (DAPI + MAP2 of TuJ1 positieven cellen) binnen hetzelfde veld.

Results

De replating van de hiPSCs-afgeleide neuronen die zijn gedifferentieerd voor meerdere weken biedt verschillende voordelen. Echter, loskoppelen en replating gedifferentieerde neuronen die lange, onderling verbonden dendrites en axonen hebben (Figuur 1A) kan resulteren in een hoge Fractie van onomkeerbaar beschadigde neuronen.

Zoals beschreven in het protocol gedeelte gebruikten we incubatie met een proteolytisch enzym om de neuronen los te maken va...

Discussion

Wij hebben blijk gegeven van een rechtlijnig proces voor de resuspensie en herbeplating van menselijke neuronale culturen die de levensvatbaarheid, het succes van differentiatie en de subcellulaire beeldvorming optimaliseren op een manier die verenigbaar is met platforms voor het screenen van hoge inhoud, en andere assays die relevant zijn voor de opsporing van geneesmiddelen. Figuur 6 illustreert de algemene workflow en voorbeelden van dergelijke toepassingen.

Ho...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Post Replating Media
L-Ascorbic Acid	Sigma	A4403	Voeg 1 mL van 200 mM stock toe aan 1 L van N2B27 media
Dibutyryl-cAMP	Sigma	D0627	Voeg 1 µM toe
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml eindconcentratie
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	Voeg 20 mL toe aan 1 L N2B27 media
DMEM/F12 met Glutamax	Thermofisher Scientific	31331093	Voeg N2 toe en verdeel in 50 mL kegelvormige buisjes; deksels afdichten met parafilm
Human GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/mL eindconcentratie
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	Voeg 10 ml toe aan 1 L N2B27 media; glutamine supplement
Mouse Laminin	Sigma	P3655-10mg	Voeg 100 µL toe aan 50 mL N2B27
MEM Nonessential Amino Acids	Thermofisher Scientific	11140035	Voeg 5 mL toe aan 1 L N2B27 media
N2 (100x) Supplement	Life Technologies	17502048	Voeg 5 mL toe aan 500 mL media
Neurobasal A Media	Thermofisher Scientific	10888022	Combineer met DMEM/F12 om N2B27 media te genereren voor CVB wt cellen; neurale basale A media
Neurobasal Media	Thermofisher Scientific	21103049	voor WT126 cellen; neurale basale media
SM1 Supplement	StemCell Technologies	5711	Voeg 1:50 toe aan media
Sodium bicarbonate	Thermofisher Scientific	25080-094	Voeg 10 mL toe aan 1 L N2B27 media
Platenvoorbereiding
10 cm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	08772-E	Kunststof TC-behandelde schalen
6-well Tissue Culture Dishes	Thomas Scientific	1194Y80	NEST platen
Mouse Laminin	Life Technologies	23017-015	Voeg 1:400 toe op plastic
Poly-Ornithine	Sigma	P3655-10mg	Voeg 1:1.000 toe op plastic
UltraPure Gedistilleerd Water	Life Technologies	10977-015	Om Poly-L-Ornithine te verdunnen
Replating Reagents
100 mM Cell Strainer	Corning	431752	Steriele, individueel verpakte
384-well plate, ongecoat	PerkinElmer	6007550	Coat met PLO en Laminin
DPBS	Life Technologies	14190144	Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing
Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates	PerkinElmer	6057500	Spoel voor het coaten met laminine
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	Breng 1 mL/10 cm plaat aan gedurende 30-45 min; proteolytisch enzym
Fixatiematerialen
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-1	Opgelost in PBS
Sucrose	Fisher Scientific	S5-12	0,8 g per 10 mL van de fixeervloeistof
Immunostaineringsmaterialen
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse	Invitrogen	A-11001	secundaire antilichaam
Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken	Invitrogen	A-11041	secundaire antilichaam
Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken	Invitrogen	A-21449	secundaire antilichaam
Alexa Fluor 561 Goat anti-rat	Invitrogen	A-11077	secundaire antilichaam
DAPI	Biotium	40043	visualiseert DNA
Muisantilichaam tegen b3-tubuline (TuJ-1)	Neuromics	MO15013	vroeg stadium neuronaal marker
Ratantilichaam tegen CTIP2	Abcam	ab18465	laag 5/6 corticale neuronen
Kippenantilichaam tegen MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	vroeg stadium neuronaal marker
Kippenantilichaam tegen NeuN	Millipore	ABN91	laat stadium neuronaal marker
Konijnantilichaam tegen MAP2	Shelley Halpain	N/A	vroeg stadium neuronaal marker
Muisantilichaam tegen PSD-95	Sigma	P-246	post-synaptisch marker
Konijnantilichaam tegen Synapsin 1	Millipore	AB1543	pre-synaptisch marker
Bovine serum albumine (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574.02	10% in PBS voor blokkering
Titon X-100	Sigma	9002931	Verdun tot 0,2% op PBS voor permeabilisatie
Viabiliteitsmarkers
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118	celdood marker
Calciumbeeldvorming
Naam van Reagens/Apparatuur	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen/Beschrijving
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	calcium reporter in een viraal bezorgsysteem
hiPSC-afgeleide NPCs
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	ongepubliceerd