Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Summary

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Abstract

Deeltje bijhouden op een videofragment en de achterste analyse van hun trajecten is tegenwoordig een gemeenschappelijke operatie in veel biologische studies. Met behulp van de analyse van de celmembraan receptor clusters als een model, presenteren we een gedetailleerd protocol voor deze afbeelding analyse taak met behulp van Fiji (ImageJ) en Matlab routines voor: 1) definiëren gebieden van belang en ontwerpen van maskers aangepast aan deze regio's; 2) bijhouden van de deeltjes in de fluorescentie microscopie video's; 3) analyseren de kenmerken van de verspreiding en de intensiteit van geselecteerde tracks. De kwantitatieve analyse van de coëfficiënten van de verspreiding, de soorten bewegingen en een clustergrootte verkregen door fluorescentie microscopie en beeldverwerking biedt een waardevol hulpmiddel om objectief vast deeltje dynamiek en de gevolgen van het wijzigen milieu-omstandigheden. In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de analyse van deze functies. De beschreven methode hier kunt niet alleen single-molecuul tracking detectie, maar ook automatiseert de schatting van de parameters voor de laterale verspreiding op het celmembraan, classificeert het type traject en het volledige analyse dus overwinnen stelt de problemen in het kwantificeren van de grootte van de plek over zijn gehele traject op de celmembraan.

Introduction

Membraaneiwitten ingebed in de lipide dubbelgelaagde zijn in continue beweging als gevolg van thermische diffusie. Hun dynamiek zijn essentieel voor het reguleren van de antwoorden van de cel, zoals Intermoleculaire interacties toestaan vorming van complexen die variëren in grootte van monomeren tot oligomeren en invloed hebben op de stabiliteit van complexen signalering. Het ophelderen van de mechanismen beheersen eiwit dynamiek is dus een nieuwe uitdaging in de celbiologie, vereist voor het begrijpen van signaaltransductie trajecten en omgaan met onverwachte cel.

Sommige optische methodes ontwikkeld om te studeren van deze interacties in ....

Protocol

1. bereiding van biologische monsters

1. Groeien Jurkat cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FCS, NaPyr en L-glutamine (volledige RPMI). Electroporate Jurkat cellen (20 x 10⁶ cellen/400 µL van RPMI 1640 met 10% FCS) met een monomeer GFP-gelabelde chemokine receptor vector (CXCR4-AcGFP, 20 μg) dat de detectie met behulp van fluorescentie microscopie.
   Opmerking: Het is mogelijk om te gebruiken andere monomeer fluorescerende eiwitten zoals mCherry, mScarlet, enz.
2. 24 uur na de transfectie analyseren cellen in een stroom cytometer om zowel de levensvatbaarheid van de cellen en de CXCR4-AcGFP expressie.
3. Selec....

Results

Het gebruik van dit protocol maakt het geautomatiseerde volgen van deeltjes ontdekt in fluorescentie microscopie films en de analyse van hun dynamische kenmerken. In eerste instantie zijn cellen transfected met de fluorescently-coupled eiwit worden bijgehouden. Het passende niveau van receptoren presenteert op het celoppervlak waarmee dat SPT wordt verkregen door de cel sorteren (Figuur 1). Geselecteerde cellen worden geanalyseerd door TIRF microscopie die vi.......

Discussion

De beschreven methode is gemakkelijk uit te voeren zelfs zonder enige eerdere ervaring werken met Matlab. Matlab routines echter uiterst nauwkeurigheid met de nomenclatuur van de verschillende opdrachten en de lokalisatie van de verschillende mappen in dienst van het programma. In de tracking routine analyse (stap 3), meerdere parameters kunnen worden gewijzigd. Het venster van "Instelling Gaussiaans-mengsel Model betaamt" (stap 3.8) bepaalt hoe U-track detecteert enkele deeltjes op de video. Dit wordt gedaan door het aa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Jurkat cells	ATCC	CRL-10915	Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator	BioRad		We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands.
Cytomics FC 500 flow cytometer	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinant human CXCL12	PeproTech	300928A
Inverted Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD camera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism	GraphPad software