Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59314

⸱

9 april 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Samenvatting

Deeltje bijhouden op een videofragment en de achterste analyse van hun trajecten is tegenwoordig een gemeenschappelijke operatie in veel biologische studies. Met behulp van de analyse van de celmembraan receptor clusters als een model, presenteren we een gedetailleerd protocol voor deze afbeelding analyse taak met behulp van Fiji (ImageJ) en Matlab routines voor: 1) definiëren gebieden van belang en ontwerpen van maskers aangepast aan deze regio's; 2) bijhouden van de deeltjes in de fluorescentie microscopie video's; 3) analyseren de kenmerken van de verspreiding en de intensiteit van geselecteerde tracks. De kwantitatieve analyse van de coëfficiënten van de verspreiding, de soorten bewegingen en een clustergrootte verkregen door fluorescentie microscopie en beeldverwerking biedt een waardevol hulpmiddel om objectief vast deeltje dynamiek en de gevolgen van het wijzigen milieu-omstandigheden. In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de analyse van deze functies. De beschreven methode hier kunt niet alleen single-molecuul tracking detectie, maar ook automatiseert de schatting van de parameters voor de laterale verspreiding op het celmembraan, classificeert het type traject en het volledige analyse dus overwinnen stelt de problemen in het kwantificeren van de grootte van de plek over zijn gehele traject op de celmembraan.

Inleiding

Membraaneiwitten ingebed in de lipide dubbelgelaagde zijn in continue beweging als gevolg van thermische diffusie. Hun dynamiek zijn essentieel voor het reguleren van de antwoorden van de cel, zoals Intermoleculaire interacties toestaan vorming van complexen die variëren in grootte van monomeren tot oligomeren en invloed hebben op de stabiliteit van complexen signalering. Het ophelderen van de mechanismen beheersen eiwit dynamiek is dus een nieuwe uitdaging in de celbiologie, vereist voor het begrijpen van signaaltransductie trajecten en omgaan met onverwachte cel.

Sommige optische methodes ontwikkeld om te studeren van deze interacties in levende cellen1. Daaronder staat de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie, ontwikkeld in de vroege jaren 1980, de studie van moleculaire interacties op of vlakbij de celmembraan2. Studeren dynamische parameters membraan eiwit gevaar opleverende verkregen TIRF gegevens in levende cellen, is een enkel deeltje tracking methode (SPT) vereist. Hoewel verschillende algoritmen beschikbaar voor dit zijn, wij gebruiken momenteel die zijn gepubliceerd door Jaqaman et al.3 , die betrekking hebben op particle beweging heterogeniteit in een dichte deeltje veld door deeltjes tussen opeenvolgende frames om verbinding te maken met de resulterende track te koppelen segmenten in volledige trajecten (tijdelijke deeltje verdwijnen). De software vangt het deeltje samenvoegen en splitsen van dat resultaat van aggregatie en dissociatie gebeurtenissen3. Één van de uitvoergegevens van deze software is de detectie van de deeltjes langs het hele traject door hun X- en Y-posities in elk frame te definiëren.

Zodra de deeltjes worden geconstateerd, passen we verschillende algoritmen om te bepalen van de korte tijdsverschil diffusie coëfficiënt (D1-4)4,5. Door het Moment schalen Spectrum (MSS)6,7,8 analyse toe te passen of door het aanbrengen van de 'alpha'-waarde door aanpassing van de verplaatsing (MSD) van de gemiddelde plein aan de kromme9, indelen we ook de deeltjes volgens het type traject.

Analyse van plek intensiteit in fluorescentie beelden is een gedeelde doelstelling voor wetenschappers in het veld10,11. De meest voorkomende algoritme is het zogenaamde aantal en helderheid. Deze methode toch staat geen detectie van de juiste frame-voor-frame intensiteit in deeltjes in de mobiele Fractie. We hebben dus een nieuw algoritme te evalueren deze deeltje intensiteiten frame-voor-frame en te bepalen wat de status van hun aggregatie gegenereerd. Zodra de coördinaten van elk deeltje worden gedetecteerd met behulp van U-Track2 software3, definiëren we de intensiteit in elk frame over het volledige traject, ook rekening houdend met de celachtergrond in elk frame. Deze software biedt verschillende mogelijkheden om te bepalen van de intensiteit van de plek en de achtergrond van de cel en berekent op basis van bekende monomeer en dimeric eiwitten als verwijzingen, het geschatte aantal eiwitten in het deeltje ontdekt (clustergrootte).

In dit artikel beschrijven we een zorgvuldige gids voor het uitvoeren van deze drie stappen: 1) opsporen en volgen enkele deeltjes langs een video van fluorescentie microscopie met behulp van U-track; 2) analyseren de momentane diffusie coëfficiënt (D1-4) van die deeltjes en het soort verkeer (beperkt, vrije of gerichte) van deeltjes met lange trajecten door MSS begint; 3) het meten van de plek intensiteit langs de video gecorrigeerd door de fluorescentie van de geschatte achtergrond voor elke vlek. Hierdoor cluster grootte schatting en identificatie van de photobleaching stappen.

Het gebruik van dit protocol niet vereist gespecialiseerde vaardigheden en kan worden uitgevoerd in een laboratorium met celcultuur, stroom cytometry en microscopie faciliteiten. Het protocol gebruikt ImageJ of Fiji (een verdeling van ImageJ12), U-track3en enkele ad hoc gemaakt routines (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track en ad hoc routines overreden Matlab die kan worden geïnstalleerd in elke compatibele computer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van biologische monsters

  1. Groeien Jurkat cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FCS, NaPyr en L-glutamine (volledige RPMI). Electroporate Jurkat cellen (20 x 106 cellen/400 µL van RPMI 1640 met 10% FCS) met een monomeer GFP-gelabelde chemokine receptor vector (CXCR4-AcGFP, 20 μg) dat de detectie met behulp van fluorescentie microscopie.
    Opmerking: Het is mogelijk om te gebruiken andere monomeer fluorescerende eiwitten zoals mCherry, mScarlet, enz.
  2. 24 uur na de transfectie analyseren cellen in een stroom cytometer om zowel de levensvatbaarheid van de cellen en de CXCR4-AcGFP expressie.
  3. Selecteer de cellen uiten van lage CXCR4-AcGFP door de cel sorteren van GFPlage positieve cellen (Figuur 1), zoals lage expressie van transfected receptor is vereist in TIRFM experimenten met het oog op één deeltje volgen voor tracering individuele trajecten9.
  4. Het aantal receptoren in het celoppervlak te kwantificeren.
    Opmerking: Als een voorbeeld13, ~ 8500-22.000 AcGFP-geëtiketteerden receptoren/cel, komen overeen met ~ 2-4.5 deeltjes/μm2.
  5. Resuspendeer gesorteerd op cellen in volledige RPMI en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Centrifugeer cellen (300 x g, 5 min), en resuspended hen in TIRF buffer (HBSS, 25 mM HEPES, 2% FCS, pH 7.3).
    1. De plaat op 35 mm glassbottom microwell gerechten (2-3 x 105 cel/schotel) bekleed met fibronectine (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) in de aanwezigheid of afwezigheid van passende ligand (dat wil zeggen, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Incubeer de cellen (20 min bij 37 ° C, 5% CO2) vóór Beeldacquisitie.
  6. Uitvoeren van experimenten met behulp van een Microscoop TIRF, uitgerust met een EM-CCD-camera, een 100 x olie-immersie doelstelling (HCX PL APO 100 x / 1,46 nb) en een 488 nm diodelaser. De microscoop kan temperatuurregeling en incubatie met CO2. Zoek en focus van de cellen met de grove en fijne focus knoppen, met heldere veld te minimaliseren photobleaching effecten. Voor fijne focus aanpassing in TIRF modus gebruiken een laser lage intensiteit, onvoldoende voor single-deeltje detectie of ertoe photobleaching effecten (5% laser macht, 28 μW).
  7. Verwerven van films (beeldsequenties) van ongeveer 50 s minimaliseren van het tijdsinterval tussen de frames. Penetratie van het vluchtig veld moet 70-90 nm van diepte. Sla de verworven films voor elke experimentele voorwaarde als ".lif" (video.lif).
    Opmerking: Films in de beschreven voorbeeld werden verworven op 49% op laser kracht (2 mW) met een belichtingstijd van 90 ms en een tijdsinterval van 98 ms, voor 49 s (500 frames). Penetratie van de geselecteerde vluchtig Golf was 90 nm.

2. selectie van beelden en creëren van maskers

  1. Voor elke experimentele voorwaarde (video.lif), maak een nieuwe map (VideoName) die verschillende mappen voor elke reeks moet bevatten. Elke map bevat een "videoSeq"-map voor de videobeelden en een "resultaten" map voor de resultaten van de analyse. Zorg ervoor dat de bestandsstructuur op dit moment de volgende is:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/videoSeq
    VideoName/Series1/resultaten
    Opmerking: Van de Microscoop worden bestanden van de verschillende .lif verkregen met verschillende video's voor elke behandeling aandoening (d.w.z. FN, FN + SDF). "video.lif" komt overeen met het videobestand input.lif met alle TIRF films acquisities (serie) uitgevoerd met de Microscoop. "videoSeq" map bevat de 500 frames van de film dat we analyseren. De "resultaten"-map bevat alle bestanden die voortvloeien uit de analyse uitgevoerd. Nauwkeurige nomenclatuur en lokalisatie van de verschillende mappen zijn essentieel voor het correct functioneren van de algoritmen. Namen in het vet in de bovenstaande lijst worden opgelost (dat wil zeggen, ze moeten op deze manier worden genoemd, omdat deze de namen gezocht door de scripts). Namen niet in vet kunnen aangepast aan het experiment uitgevoerd.
  2. Open de video van de TIRFM (.lif-bestand) met Fiji of ImageJ door slepen en neerzetten het bestand op de menubalk van Fiji en klik op OK om de lif-bestand met behulp van BioFormats (aanvullende figuur 1) te importeren.
  3. Selecteer de reeks wilt verwerken en klik op OK (aanvullende figuur 2A). Als u een masker voor de analyse van deze video, importeren ook een multikanaalafbeelding met de verschillende chromophores (in het voorbeeld wordt reeks 1 is de multikanaalafbeelding en Series 2 de bijbehorende video). De video (en de multikanaalafbeelding) moeten openen als een stapel ImageJ. In het voorbeeld (aanvullende figuur 2B), het beeld is aan de linkerkant en de video is aan de rechterkant.
    Opmerking: Als de oprichting van een masker voor de video is niet nodig, gaat u naar stap 2.5.
  4. Een masker maken. Maak een enkele afbeelding met de kanalen nuttig voor het ontwerp van het masker. In dit geval zijn de interessante kanalen de rode, groene en grijze.
    1. De kanalen van de multikanaalafbeelding (aanvullende figuur 3A) splitsen: Selecteer afbeelding in de bar menu en klik kleur | Kanalen splitsen. De verschillende kanalen weergegeven als afzonderlijke afbeeldingen (aanvullende figuur 3B).
    2. Samenvoegen nogmaals de drie kanalen in een enkel beeld (aanvullende figuur 4A): Selecteer afbeelding in de bar menu en selecteer kleur | Kanalen samenvoegen. Selecteer de daartoe geëigende kanalen en druk op OK (aanvullende figuur 4B). Een nieuwe niet-gestapeld beeld zal worden gegenereerd (aanvullende figuur 4C).
    3. De twee vensters synchroniseren met behulp van het hulpprogramma Windows synchroniseren (aanvullende figuur 5A): Selecteer analyseren in de bar menu | Tools | Synchroniseren van Windows. Een nieuw venster met de synchroniseren afbeelding mogelijkheden getoond (aanvullende figuur 5B).
    4. Met de twee vensters gesynchroniseerd (alleen de video als er geen bijbehorende multikanaalafbeelding), kan dezelfde regio in beide vensters worden bijgesneden. De regio van belang met het rechthoekig gereedschap voor ImageJ zwevende menu tekenen. Selecteer de afbeelding in de bar menu en selecteer gewas (aanvullende figuur 6A). De twee bijgesneden beelden zullen tonen individueel (aanvullende figuur 6B).
    5. Unsynchronize beide vensters (aanvullende figuur 6B) door te drukken op de knop Unsynchronize alles in Sync Windows manager.
  5. Als een masker niet in stap 2.4 aangemaakt, tekent u de regio van belang met het rechthoekig gereedschap voor ImageJ zwevende menu.
  6. De video opslaan als een reeks afbeeldingen in de map videoSeq onder de bijbehorende video directory (aanvullende figuur 7A): Selecteer bestand in de balk menu en klik Opslaan als | Image volgorde... hernoemen van de labels voor het videofragment als video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (aanvullende figuur 7B): hernoemen als video in het vak naam en klik op OK. De volgorde moet zijn alleen in de directory worden met succes gebruikt door U-track.
    Opmerking: Als niet het ontwerpen van een masker voor de video, gaat u naar stap 2.8.
  7. Het ontwerp van een masker. Selecteer de multikanaalafbeelding en open de segmentatie redacteur plugin (aanvullende figuur 8A): Plugins in de bar Selecteer menu en selecteer segmentatie | De redacteur van de segmentatie. Toevoegen en de naam van de etiketten van de segmentatie desgewenst wijzigen door rechts te klikken op de etiketten van de segmentatie editor (aanvullende figuur 8B, C).
    1. Kies het juiste gereedschap in ImageJ zwevende menu (hier, gebruik freehand), selecteer een label (groen) en ontwerpen eerst de ultraperifere masker (aanvullende figuur 9A). Zodra ontworpen, wordt druk de + in de optie van de selectie van samengestelde venster, en de geselecteerde masker getoond op de kijker (aanvullende figuur 9A). Herhaal deze stap met volgende etiketten (interieur, in het rood) (aanvullende figuur 9B).
      Opmerking: Na het ontwerpen van het masker voor de labels groen en interieur, zal het exterieur masker bezetten de rest van de afbeelding.
    2. Maskers zijn gecodeerd in de afbeelding als regio's 0, 1, 2... de volgorde van de labels in het RGB-etiketten-venster. Wanneer alle maskers voor de verschillende labels zijn ontworpen, sla het masker met dezelfde naam als de video, met de naam mask.tif (aanvullende figuur 9C): Selecteer bestand in de balk menu en selecteer Opslaan als | TIFF....
      Opmerking: De geselecteerde maskers zal worden gebruikt in de berekening van de coëfficiënten van de verspreiding en de indeling van de trajecten (zie stap 4.2).
  8. Controleer dat de bestandsstructuur op dit moment de volgende is:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/mask.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Series1/resultaten
    Opmerking: De mask.tif is een beeld met het masker als ontworpen in stappen 2.4 en 2.7. De video*.tiff is de video, zoals opgeslagen in stap 2.6. Zoals hierboven, de namen in vet de bovenstaande lijst worden opgelost, dat wil zeggen, ze moeten op deze manier worden genoemd, omdat deze de namen gezocht door de scripts. Namen niet in vet kunnen aangepast aan het experiment uitgevoerd.

3. het bijhouden van de deeltjes

  1. Het bijhouden van alle deeltjes gezien in de geselecteerde video's met behulp van U-track.
  2. Matlab open en U-track directory toevoegen aan het pad met behulp van ingesteld pad | Voeg toe met submappen optie in het menu. Het pad zodanig opslaan dat in de toekomst de executies van Matlab U-track is in het pad. De padinstelling van dit moet worden gedaan slechts eenmaal.
  3. Ga het werk folder naar de map met de serie te worden geanalyseerd. Beroep doen op U-track door te typen in de console (aanvullende figuur 10) movieSelectorGUI en druk op enter. Het venster film selectie zal worden geopend (aanvullende figuur 11).
  4. Druk op de knop Nieuw film en de film editie -venster verschijnt (aanvullende figuur 11).
  5. Druk op Add kanaal om te kiezen van de map met de video (VideoName/Series1/video) en vul de film informatie parameters. Stel de output-map voor de resultaten van U-track op resultaten (videoName/Series1/resultaten).
    Opmerking: De parameters van de film informatie kunnen worden verkregen van de Microscoop en de algemene inkoopvoorwaarden.
  6. Druk op de Geavanceerde Kanaalinstellingen en vul de parameters die betrekking hebben op de acquisitie. Kijk de waarden van de parameters in het voorbeeld (aanvullende figuur 11C).
  7. Druk op Opslaan in het venster Geavanceerde Kanaalinstellingen en Opslaan in het venster film editie . Het programma zal vragen om bevestiging van het schrijven van het bestand met de naam movieData.mat voor de map resultaten . Bevestigen.
  8. Na het maken van de film, druk op Doorgaan in het venster film selectie. U-track zal vragen over het type object te analyseren. Kies Single-deeltjes (aanvullende figuur 12). De Control panel venster zal verschijnen (aanvullende figuur 13A).
    1. Selecteer de eerste stap stap 1: detectie en drukt u op instelling. Het venster Instelling Gaussian mengsel-Model passend verschijnt (aanvullende figuur 13B). In het voorbeeld is "Alpha waarde voor vergelijking met lokale achtergrond" ingesteld op 0,001 en "Rolling-venster tijd gemiddeld" tot en met 3 (aanvullende figuur 13B).
    2. Druk op toepassen in het venster Instellingen Gaussian mengsel-Model passend en uitgevoerd in het Configuratiescherm. Met de configuratie in aanvullende figuur 13loopt alleen de detectie stap. Deze stap duurt een paar minuten van (2-5). Het resultaat controleren door op de knop van het resultaat van stap 1 (detectie, aanvullende figuur 14).
      Opmerking: Zoals hierboven vermeld, bevat de film rode cirkels op de gedetecteerde deeltjes. Als geen rode cirkel wordt weergegeven, is het vervolgens heeft dat deze stap niet correct gewerkt.
  9. De identificatie van tracks, dat wil zeggen, de deeltjes ontdekt in de vorige stap in tracks die zich uitstrekken over meerdere frames samenvoegen uit te voeren. Dit is de stap 2: Tracking van U-track waarvan de instellingen worden vastgesteld moeten zoals in Aanvullende figuur 15A-C. De stap 2 kosten functie instellingen voor frame-voor-frame koppelen en Gap sluiten, samenvoegen en splitsen in het voorbeeld worden weergegeven in aanvullende figuur 15B en C, respectievelijk.
  10. Na het instellen van de parameters voor stap 2, drukt u op uitvoeren in het Configuratiescherm en alleen stap 2 loopt (aanvullende figuur 16).
  11. Track analyses, stap 3 uit te voeren. De instellingen definiëren zoals in aanvullende figuur 17 (rechtervenster). Druk op toepassen in het deelvenster of instelling-bewegingsanalyse, uitgevoerd in de Control Panel-U-Track. Deze stap duurt een paar seconden.
  12. Controleer of met de knop van het resultaat van stap 3 dat het proces juist alle tracks heeft geïdentificeerd. Klik op Toon nummer van het venster Filmopties voor te doen, en controleren frame voor frame dat elke track is geweest correct geïdentificeerd (aanvullende figuur 18). Handmatig aantekeningen die deeltjes die niet waar deeltjes.
    Opmerking: Als deze handmatige selectie niet gebeurt, kan een zwakkere automatische selectie worden uitgevoerd later wanneer de diffusie-coëfficiënt is berekend (zie stap 4).

4. berekening van de coëfficiënten van de verspreiding en de indeling van de trajecten

  1. Zorg ervoor dat alle scripts worden aangeroepen vanuit de map van de video (in het voorbeeld, VideoName/Serie1) de analyse wordt uitgevoerd.
  2. Lees alle de trajecten to compute de coëfficiënten van de diffusie van afgifte in de Matlab console het commando: trajectories=readTrajectories(0.1), waar 0.1 de tijd in seconden tussen twee opeenvolgende frames (tijdsinterval is, weergegeven in het deelvenster film Informatie, aanvullende figuur 11).
  3. Uitsluiten trajecten overeenkomt met onjuist geïdentificeerd vlekken/trajecten. Geef een lijst van de plaatsen om uit te sluiten. Bijvoorbeeld voor het uitsluiten van vlekken 4, 5 en 28, typt: trajecten = readTrajectories (0.1, [4, 5, 28]).
  4. Bereken de momentane diffusie coëfficiënten voor elke één van de tracks van deze cel. In dit geval het berekenen van de coëfficiënt van de verspreiding voor een vertraging = 4, genaamd D1-4. Daarvoor, in de Matlab-console het commando: D = calculateDiffusion (trajecten, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha') waar trajecten zijn de trajecten verkregen in stap 3, 113.88e-3 is de pixelgrootte van de verworven beelden in micron, 0.0015 is een bovengrens voor de coëfficiënten van de diffusie van immobiel deeltjes gemeten in µm2/s, en 'alpha' is het gepaste model zoals hieronder uitgelegd.
    Opmerking: Bij het gebruik van een snellere camera en de noodzaak meer frames voor het berekenen van de diffusie-parameter verhogen, bijvoorbeeld tot 20, door D = calculateDiffusion (trajecten, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', '', 20). De parameter string vóór 20, in het voorbeeld hierboven, '', is het achtervoegsel toegevoegd aan de output bestanden. Dit achtervoegsel kan worden gebruikt om te onderscheiden van de verschillende analyses.
  5. Passen de MSD met een verschillende functie door het aanroepen van de functie van de calculateDiffusion weer met een verschillende montage-modus ('beperkt', 'gratis' of 'regie'). In dit voorbeeld 'beperkt': D = calculateDiffusion (trajecten, 113.88e-3, 0.0015, 'beperkt').
  6. De resultaten van de montage voor de gerichte model, behalen zoals in aanvullende figuur 20.
  7. Het ontleden van de trajecten in korte en lange trajecten. Gebruik van de opdracht: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) waar 50 is de minimale lengte in frames van een baan beschouwd lang (in het voorbeeld).
  8. Korte trajecten met dezelfde fitting procedure in stap 4.3 beschreven studie: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'regie', 'Korte'). Korte en afwijkende trajecten met de opdracht analyseren: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'Korte').
  9. Analyseren van lange trajecten te classificeren van het type beweging door hun Moment schalen Spectrum (MSS)7. De opdracht: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'Long') toont de analyse in scherm en genereert een bestand genaamd trajectoryClassification < achtervoegsel > .txt in de map results\TrackingPackage\tracks.

5. berekening van de Cluster Ssize door de dichtheid van de deeltjes

Opmerking: Zorg ervoor dat alle scripts worden aangeroepen vanuit de map van de video (in het voorbeeld, VideoName/Serie1) de analyse wordt uitgevoerd.

  1. Het analyseren van de intensiteit van elk deeltje langs hun traject. Daarvoor, het script te starten door te typen in de console van Matlab: analyzeSpotIntensities die als neemt invoer de trajecten berekend door U-track in de eerste sectie. In zijn meest elementaire vorm, bel gewoon het script zonder een van de argumenten van de folder van de video analyse wordt uitgevoerd (in het voorbeeld, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Dit fundamentele probleem op verschillende manieren configureren door middel van argumenten aan het script als in: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, waarde1, ' Arg2´, waarde2,...). Geldige argumenten met de bijbehorende variabele waarden ('ArgN´, ValueN) worden vermeld.
    1. ('spotRadius´, 1)
      Analyseren van de intensiteit van de fluorescentie met behulp van de spotRadius van 1 pixel (standaard) die correspondeert met een patch van formaat 3 x 3 gecentreerd op de plek ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Opmerking: Kies voor een patch van 5 x 5 gecentreerd op de plek, een spotRadius van 2, enz.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Als dit argument is opgegeven, de waarde 1 (waar), analyseren alleen de trajecten die in het eerste frame van de video beginnen. Dit is handig voor het analyseren van beelden van het besturingselement (standaard 0, false).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Als dit argument is ingesteld op 0 (ONWAAR), dan blijven de coördinaat van de plek in het eerste frame voor alle frames (dit is handig voor immobiel vlekken). Als het argument is ingesteld op 1 (standaard 1, true), wordt vervolgens de plek bijgehouden langs de video na de coördinaten berekend door U-track.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Omvatten het traject aantal die trajecten uitgesloten in stap 4.3 (in het voorbeeld 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Als dit argument is ingesteld op 1 (waar), vervolgens analyseren de intensiteit in de patch aan het einde van de video (zelfs als de baan eerder stopt). De coördinaat van de spot is de laatste coördinaat in het traject (als trackTrajectory true is) of de eerste coördinaat in het traject (als trackTrajectory ingesteld op false is). Dit argument is onwaar (0) standaard.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Als deze parameter is ingesteld, dan juist de ruwe fluorescentie gemeten op elke plek van de raming van de fluorescentie van de achtergrond voor die plek (zie hieronder). Dit argument is true (1), standaard.
    7. ('meanLength´, framenummer)
      Als deze parameter is ingesteld, dan is de plek van de gemiddelde intensiteit wordt gemeten aan de aangegeven lengte. 'MeanLength', 20 voor het meten van de gemiddelde plek intensiteit bij de eerste 20 frames instellen Als het argument is niet ingesteld, wordt dan de plek intensiteit berekend op het hele traject (standaard, volledige lengte).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Stel deze parameter in als 1 (standaard 0, false), kunnen worden uitgezet op het profiel van de intensiteit langs de verschillende frames, alsmede hun achtergrond.
      Opmerking: Deze percelen zijn zeer nuttig om te identificeren photobleaching zoals aangegeven in de aanvullende figuur 21. Voor elk pad analyseert de routine automatisch als het is mogelijk dat er photobleaching is geweest. Dit wordt gedaan door het vergelijken van de intensiteitswaarden met een Student t in de eerste en laatste N frames langs het pad. Standaard is N 10, maar deze waarde kan worden gewijzigd via het argument ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, waarde)
      Stel deze parameter om te bepalen van de achtergrond van elke vlek. Dit kan gebeuren op verschillende manieren, en die een te gebruiken kan worden geselecteerde veranderende de "waarde":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Gebruik deze waarde om het handmatig identificeren de achtergrond voor de hele video. Toestaan dat 8 punten in het eerste frame van de video selecteren. Een patch rond deze punten langs de hele video wordt geanalyseerd en de 95% kwantiel van alle deze intensiteiten wordt gekozen als de intensiteit van de achtergrond voor alle spots.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Gebruik deze waarde om de achtergrond voor elk frame handmatig te identificeren. Kies 8 punten voor elke plek en elk frame. Dit is een tijdrovende klus maar het veel controle geeft aan de gebruiker. De 95% kwantiel van de intensiteit in deze patches is gekozen als de intensiteit van de achtergrond voor deze plek in dit frame.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Gebruik deze waarde voor de berekening van de achtergrond van elke plek uit 8 punten zich in een cirkel rond de plek met een straal gecontroleerd door het argument geschat ' backgroundRadius´ (standaard, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Gebruik deze waarde voor de berekening van de achtergrond voor elk frame door eerst het lokaliseren van de cel in de video en vervolgens analyseren van de intensiteiten van de cel in elk frame (aanvullende figuur 22).
        Opmerking: De achtergrond is gekozen als de grijze waarde op een bepaalde kwantiel van deze verdeling (standaard 0,5 (= 50%), hoewel deze parameter kan worden gecontroleerd door middel van het argument ' backgroundPercentile´, deze waarde kan hoger worden ingesteld, bijvoorbeeld 0,9 (= 90%) Als willen allermeest naar de cel die moet worden beschouwd als achtergrond. Om te helpen bij de identificatie van de cel, geven de waarde van de maximale achtergrond verwacht langs de frames met behulp van het argument ' maxBackground´ (bijvoorbeeld, in al de geanalyseerde video's, de achtergrond-waarde normaal nooit overstijgt 6000)13. Standaard is deze optie ingesteld op 0, wat betekent dat deze hulp niet standaard wordt gebruikt. Zie die is het opsporen van de cel en het gebied geselecteerd voor de schatting van de achtergrond door het argument ' showImages´ op 1 (halte de uitvoering op elk gewenst moment door te drukken op CTRL-C).
  2. Verzamel de diffusie en intensiteit voor alle trajecten die zijn berekend in de stappen 4 en 5.1, respectievelijk, op basis van gatherDiffusion.AndIntensity (). Verzamel alleen de diffusie en intensiteit voor korte trajecten. Om te doen, gebruik de achtervoegsels gebruikt in stap 4.7 en typ: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) waar ' Short´ is het achtervoegsel gebruikt in stap 4.7.
  3. Verzamelen van de Moment Spectrum schaal en de informationby intensiteit te typen: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') waar 'Lang' het achtervoegsel in stap 4.7 gebruikt wordt. Een samenvatting van alle bestanden gegenereerd met behulp van dit protocol is afgebeeld in Figuur 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gebruik van dit protocol maakt het geautomatiseerde volgen van deeltjes ontdekt in fluorescentie microscopie films en de analyse van hun dynamische kenmerken. In eerste instantie zijn cellen transfected met de fluorescently-coupled eiwit worden bijgehouden. Het passende niveau van receptoren presenteert op het celoppervlak waarmee dat SPT wordt verkregen door de cel sorteren (Figuur 1). Geselecteerde cellen worden geanalyseerd door TIRF microscopie die vi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De beschreven methode is gemakkelijk uit te voeren zelfs zonder enige eerdere ervaring werken met Matlab. Matlab routines echter uiterst nauwkeurigheid met de nomenclatuur van de verschillende opdrachten en de lokalisatie van de verschillende mappen in dienst van het programma. In de tracking routine analyse (stap 3), meerdere parameters kunnen worden gewijzigd. Het venster van "Instelling Gaussiaans-mengsel Model betaamt" (stap 3.8) bepaalt hoe U-track detecteert enkele deeltjes op de video. Dit wordt gedaan door het aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij zijn Carlo Manzo en Maria García Parajo dankbaar voor hun hulp en source code van de analyse van de coëfficiënt diffusie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Spaanse ministerie van wetenschap, innovatie en universiteiten (SAF 2017-82940-R) en het RETICS-programma van het Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 en RD16/0012/0006; RIER). LMM en JV worden ondersteund door het programma van de COMFUTURO van de Fundación generaal CSIC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Human Jurkat cellsATCCCRL-10915Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator BioRad We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman CoulterDepending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako QifikitDakoCytomationK0078Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishesMatTek corporationP35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasmaSigma-AldrichF0895
Recombinant human CXCL12PeproTech300928A
Inverted Leica AM TIRFLeica
EM-CCD cameraAndor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABThe MathWorks, Natick, MA
U-Track2 softwareDanuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2 softwareMatlab tool.  For installing, download.zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad PrismGraphPad software

Referenties

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Single-molecule trackingparticle trackingdiffusieanalyseclustergrootteanalyseregion of interestmaskerontwerpFiji ImageJMATLAB-routines
Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.