Methodenartikel

Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59320

⸱

10 april 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia, Augusta University, 2Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om Transient hartfunctie bij Duchenne spierdystrofie muizen door exosomes afgeleid van normale myogenic voorlopercellen verplanten.

Samenvatting

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is een X-gebonden recessieve genetische ziekte die wordt veroorzaakt door een gebrek aan functionele Dystrofine-eiwit. De ziekte kan niet worden genezen, en naarmate de ziekte vordert, ontwikkelt de patiënt symptomen van verwijde cardiomyopathie, aritmie en congestief hartfalen. De DMDMDX mutant muizen doen niet express Dystrofine en worden vaak gebruikt als een muismodel van DMD. In onze recente studie, die we hebben vastgesteld dat intramyocardial injectie van brede type (WT)-myogenic voorlopercellen cellen afkomstige exosomes (MPC-Exo) Transient hersteld de uitdrukking van Dystrofine in het myocardium van DMDMDX mutant muizen, die werd geassocieerd met een tijdelijke verbetering van de hartfunctie suggereren dat kan WT-MPC-Exo bieden een optie voor het verlichten van de cardiale symptomen van DMD. Dit artikel beschrijft de techniek van MPC-Exo-zuivering en transplantatie in het hart van DMDMDX mutant muizen.

Inleiding

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is een X-gebonden recessieve, progressieve neuromusculaire ziekte veroorzaakt door een mutatie in gen DMD en het verlies van functionele Dystrofine1. Dystrofine voornamelijk in skeletspieren en myocard wordt uitgedrukt, en minder wordt uitgedrukt in gladde spieren, endocriene klieren en neuronen2,3. DMD is de meest voorkomende vorm van spierdystrofie met een incidentie van één per 3.500 tot 5.000 pasgeboren jongens wereldwijd4,5. Individuen ontwikkelen meestal progressieve spier necrose, verlies van onafhankelijke wandelen door vroege adolescentie, en dood in de decennia van de tweede naar de derde van hun leven als gevolg van hartfalen en respiratoir falen6.

Verwijde cardiomyopathie, aritmieën en congestief hartfalen zijn gemeenschappelijke cardiovasculaire uitingen van DMD7,8. De ziekte kan niet worden genezen, ondersteunende behandeling kan symptomen verbeteren of vertragen van de progressie van hartfalen, maar het is heel moeilijk om het hart functie9,10.

Soortgelijk aan DMD patiënten, spierdystrofie X-gebonden (MDX) muizen hebben een tekort in het Dystrofine-eiwit en huidige symptomen van cardiomyopathie11, en worden daarom veel gebruikt bij DMD verbonden cardiomyopathie onderzoek. Om te herstellen van Dystrofine in betrokken spieren, heeft allogene stamcel therapie bewezen een effectieve behandeling voor DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm membraan blaasjes uitgescheiden door verschillende celtypes, spelen een sleutelrol in de cel-naar-cel communicatie via genetische materiaal vervoer, zoals messenger-RNA (mRNA) en niet-coderende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.

Onze vorige studies hebben aangetoond dat exosomes afgeleid van myogenic voorlopercellen (MPC), zoals C2C12 cellijn, Dystrofine kunt overbrengen mRNA naar host cardiomyocytes na directe cardiale injectie22, waarmee wordt aangegeven dat allogene levering van MPC-afgeleide exosomes (MPC-Exo) kunt Transient DMD genexpressie in MDX-muizen herstellen. Dit artikel richt zich op de zuivering en -transplantatie technieken MPC-Exo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dieren werden verwerkt volgens goedgekeurde protocollen en het welzijn van dieren verordeningen van de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Medical College of Georgia Augusta Universiteit.

1. isolatie en zuivering van MPC afkomstige Exosomes

  1. Zaad 5 x 106 C2C12 cellen in een 15 cm cel cultuur schotel met 20 mL volledige Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline G en 100 μg/mL streptomycine. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Voorbereiden op middellange exosome-uitgeput door ultracentrifugatie van FBS bij 100.000 x g 18 uur bij 4 ° C met behulp van een swingende emmer rotor. Gooi de pellet.
  3. Vervang de complete DMEM met exosome-verarmd medium wanneer enkelgelaagde cellen 80% samenvloeiing in de cultuur-schotel bereiken.
  4. Gebruik een pipet overdracht voor het verzamelen van de bovendrijvende substantie van de cel cultuur schotel elke 48 uur voor een totaal van drie keer. Verzamelen het supernatant in 50 mL centrifuge buizen en centrifuge bij 150 x g gedurende 10 minuten te verwijderen van de resterende cellen.
  5. Filtreer het supernatant door een 0,22 μm-filter om te elimineren cel puin. Ultracentrifuge het gefilterde medium in ultra-heldere buizen met behulp van de swingende emmer rotor op 100.000 x g gedurende 120 minuten bij 4 ° C te precipiteren exosomes.
  6. Resuspendeer de pellet exosome-bevattende in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vul de hele ultra-heldere buis met PBS. Uitvoeren ultracentrifugatie deze schorsing bij 100.000 x g gedurende 120 minuten bij 4 ° C tot het elimineren van contaminerende eiwitten.
  7. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet exosome in 100 µL PBS. -80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.
  8. P.a. van elektronenmicroscopie, 3 µL van schorsing van de exosomal op een 200 netraster met koperen elektronenmicroscoop formvar beklede gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te plaatsen. Ga verder met standaard uranyl acetaat kleuring van23. Het raster van semi-droge onderzoeken door transmissie-elektronenmicroscopie.

2. Intramyocardial Exosome levering

Opmerking: We hebben zes muizen gebruikt in elke groep.

  1. DBA/2J-DMDMDX muizen (man, leeftijd > 10 maanden; lichaamsgewicht (BW) > 18 g) met intraperitoneaal (i.p.) injectie van 100 mg/kg BW van ketamine gecombineerd met 10 mg/kg BW xylazine anesthetize, en bevestig de diepte van de verdoving door teen snuifje.
  2. Corrigeer elke muis in liggende positie op een chirurgische platform met behulp van tape om te beveiligen elke ledemaat en plaatsen van een 3-0 hechtdraad horizontaal onder de bovenste tanden aan de bovenkaak op zijn plaats houden.
  3. De ontharende room van toepassing op de linkerkant van de borst van de muis te verwijderen van de vacht van de huid.
  4. Endotracheale intubatie via de mondholte met behulp van een katheter 24 G uitvoeren en ventileren van de muis met kamer lucht met een snelheid van 195 adem/min met behulp van een knaagdier ventilator (Zie de Tabel van de materialen).
  5. Desinfecteren van de huid met 75% alcohol en 10% Povidon jodium.
  6. Maken van een 10\u201215 mm schuine snede vanaf de linkerrand van de sternale aan de linker oksel, knipt de m. pectoralis major en pectoralis minor door een schaar en daarna een linker Thoracotomie maken door de Vierde intercostale ruimte. Zachtjes invoegen de oprolmechanisme bands te verspreiden van de borstholte tot een breedte van 10 mm. Zorg om te voorkomen dat schade aan de linker long.
  7. Gebruik twee rechte pincet te verwijderen van het hartzakje, trek ze uit elkaar en plaats ze achter de oprolmechanisme tips om het hart bloot te stellen. MPC-Exo injecteren (50 μg in 30 µL PBS) of 30 μL PBS (als een besturingselement) intramyocardially in de voorste wand van de linkerventrikel met behulp van een naald van de insuline 31 G op één site.
  8. Gebruik 6-0 nylon hechtingen te sluiten van de borstholte, de pectoralis spieren en de huid in de juiste volgorde.
  9. Herstellen van muizen. Zodra ritmische, spontane ademhaling aanwezig is, verwijdert u de muizen van de ventilator, en extubate. Observeren en registreren de muizen voorwaarde na de operatie.

3. echocardiografie

Opmerking: Een enkele waarnemer verblind aan de experimentele groepen voert echocardiografie en data analyse.

  1. Twee dagen na de transplantatie van PBS/exosome, anesthetize de muizen met 1\u20122% Isofluraan.
  2. Los van een muis in liggende positie met behulp van tape en de voorverwarmde akoestische gel van toepassing op het gebied van de linker borst.
  3. Beoordelen ventriculaire functie left door echocardiografie als eerder beschreven16,24.
    1. Verkrijgen van de parasternal lange as weergave van de linker ventrikel (LV) in twee dimensies (B-modus) en vervolgens de ultrasone sonde 90° worden gedraaid zodat ze een LV korte-axis Bekijk papillaire spier niveau te verkrijgen.
    2. Record echocardiographic beelden van de M-stand en maatregel links ventriculaire einde-diastolische diameter (LVEDD), linker ventriculaire einde-systolische volume (LVESD), linker ventriculaire einde-diastolische volume (LVEDV) en linker ventriculaire einde-systolische volume (LVESV).
      Opmerking: Fractionele verkorting (FS-%) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 en linker ventriculaire ejectie fractie (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4. Immunohistochemistry

  1. Twee dagen na de transplantatie van PBS/exosome, anesthetize van muizen (zie stap 2.1) en het borstbeen opengesneden om de borstholte bloot te stellen. Ontleden van de vena cava inferior en perfuse van het hart via de apex van de linkerventrikel met 3 mL PBS, gevolgd door 3 mL 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur, met behulp van een katheter vlinder met een 25 G naald aangesloten op een 5 mL spuit.
  2. Vaste harten inbedden in paraffine, en snijd in 5 μm dik secties.
  3. Deparaffinize van de dia's in xyleen en hydrateren in ethanol oplossingen in volgende volgorde: 100% xyleen (3 min), 100% xyleen (3 min), 100% ethanol (1 min), 100% ethanol (1 min), 95% ethanol (1 min), 80% ethanol (1 min), H2O (1 min).
  4. Fix weefselsecties met 4% paraformaldehyde gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Onderdompelen van dia's in Natriumcitraat (0,01 M, pH 6.0) en het uitvoeren van antigeen ophalen met behulp van een antigeen retriever.
  6. Permeabilize secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1% polyethyleenglycol tert-octylphenyl ether in PBS.
  7. Secties met 5% geit serum in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te blokkeren.
  8. Incubeer secties met verdunde primair antilichaam (anti-Dystrofine antilichaam) in PBS (1:100) 's nachts bij 4 ° C, dan Spoel driemaal met PBS voor 5 min.
  9. Secties met verdunde secundair antilichaam (Alexa Fluor 488 geconjugeerd geit anti-konijn IgG) in PBS (1:400) voor 45 min bij kamertemperatuur incuberen.
  10. Controle autofluorescence met behulp van een autofluorescence blussen kit (Zie de Tabel van de materialen).
  11. Gebruik montage opslagmedium met DAPI (Zie de Tabel van materialen) te monteren op de dia's.
  12. Observeren van dia's onder een confocal microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een stroomschema om te isoleren en zuiveren van exosomes van C2C12 cellen wordt weergegeven in Figuur 1A. Controleer de aanwezigheid van exosomes, we Transmissie Electronenmicroscopie analyse uitgevoerd. Transmissie Electronenmicroscopie beeld (Figuur 1B) toont de morfologie van de blaasjes helder en ronde vorm van C2C12 afgeleide exosomes. Westelijke vlekkenanalyse bevestigde de aanwezigheid van markeringen in exosome, met inbe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De methode van het isoleren van pure exosomes is essentieel voor de studie van de functie van exosomes. Een van de gebruikte technieken voor exosome isolatie is polyethyleen glycolen (pinnen) gemedieerde neerslag17,18,25. Exosomes kunnen worden neergeslagen in haringen en Ingehuld door lage snelheid centrifugeren. PEG-gemedieerde zuivering is erg handig, goedkope, hoeft niet alle geavanceerde apparatuur, maar er bestaat bezorgdh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaart dat zij hebben geen conflicten van interesse.

Dankbetuigingen

Tang werden slechts gedeeltelijk ondersteund door de American Heart Association: GRNT31430008 NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 μm FilterFisherbrand09-720-004
15 cm Cell Culture DishThermo Fisher Scientific157150
24 G catheterTERUMOSR-OX2419CA
31 G insulin needleBD328291
4% paraformaldehyde AffymetrixAAJ19943K2
50 mL Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific339652
6-0 suturePro Advantage by NDCP420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11008
Antibiotic Antimycotic SolutionCorning 30-004-CI
Anti-Dystrophin antibodyAbcamab15277
Antigen retriever Aptum BiologicsR2100-USAntigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit Vector LaboratoriesSP-8400
C2C12 cell lineATCCCRL-1772
CentrifugeUnicoC8606
Change-A-Tip High Temp CauteriesBovie Medical CorporationHIT
Confocal microscopyZeissZeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx miceThe Jackson Laboratory013141
DMEMCorning 10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning 35-011-CV
Goat serum MP Biomedicals, LLC191356
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
KetamineHenry Schein056344
Mounting Medium with DAPI Vector LaboratoriesH-1500
Mouse Retractor SetKent ScientificSURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl etherFisher ScientificBP151-100
Rodent ventilatorHarvard Apparatus55-7066
SW-28 Ti rotorBeckman342207
The Vevo 2100 Imaging PlatformFUJIFILM VisualSonicsVevo 2100Ultrasound System 
UltracentrifugeBeckman365672
Ultra-Clear TubesBeckman344058
Xylazine (XylaMed)Bimeda-MTC Animal Health Inc.1XYL003 8XYL006

Referenties

  1. Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
  2. Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
  3. Rae, M. G., O'Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
  4. Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
  5. D'Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
  6. Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
  7. Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
  8. Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  9. Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
  10. Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
  11. Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
  12. Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
  13. Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
  15. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
  16. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
  17. Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
  18. Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
  19. Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
  20. Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268(2016).
  21. Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
  22. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  23. Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381(2012).
  24. Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
  25. Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
  26. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  27. Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
  28. Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
  29. Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
  30. Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Myogene progenitorcellenexosoomzuiveringintramyocardiale injectieDuchenne spierdystrofieechocardiografische analysetransmissie elektronenmicroscopieWestern blot analyseimmunofluorescente kleuringexosoom uitgeput mediumultracentrifugatieprotocol

Gerelateerde artikelen