Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Dagelijkse fototherapie met rood licht te reguleren Candida albicans Biofilm groei

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59326

⸱

23 april 2019

 ,  , 
1Department of Cariology, Operative Dentistry and Dental Public Health, Indiana University School of Dentistry, 2Department of Restorative Dentistry, Ceará Federal University, School of Dentistry

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de resultaten van de toepassing van het rood licht op de groei van Candida albicans biofilm. Een niet-coherente rood licht apparaat met de golflengte van 635 nm en dichtheid van de energie van 87.6 J·cm-2 werd toegepast in de groei van Candida albicans biofilms gedurende 48 uur.

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de resultaten van per dag rood licht behandeling op de groei van Candida albicans biofilm. Het vergroten van de planktonische groei van C. albicans SN425, groeide de inoculums op gist stikstof Base media. Voor de vorming van de biofilm, waren RPMI 1640 media, die hoge concentraties van aminozuren hebben toegepast om te helpen biofilm groei. Biofilms 48 uur twee keer per dag gedurende 1 min werden behandeld met een niet-coherente lichtapparatuur (rood licht; golflengte = 635 nm; energiedichtheid = 87.6 J·cm-2). Zoals een positieve controle (PC), 0,12% chloorhexidine (CHX) werd toegepast, en als een negatieve controle (NC), 0,89% NaCl werd toegepast op de biofilms. Kolonievormende eenheden (kve), droog gewicht, oplosbare en onoplosbare exopolysaccharides na behandelingen werden gekwantificeerd. Kort, het protocol hier gepresenteerd is eenvoudig, reproduceerbare en biedt antwoorden met betrekking tot de levensvatbaarheid, droog gewicht en extracellulaire polysaccharide bedragen na rood licht behandeling.

Inleiding

De toename van diabetes, immunosuppressieve therapie toepassingen, HIV, AIDS-epidemie, invasieve klinische procedures en breedspectrum antibiotica verbruik in de afgelopen jaren gestegen de incidentie van Candida albicans gerelateerde ziekten1,2. C. albicans infecties zijn meestal gerelateerd aan biofilm ontwikkeling en Klinische manifestaties, zoals candidiasis of systemische weerslag, zoals candidemia1,2kunnen veroorzaken. Een van de opmerkelijkste virulentiefactoren van biofilm groei is de polysacharide extracellulaire matrix vestiging. Biofilm vorming samenwerkt om te verhogen van de weerstand tegen bestaande antifungale geneesmiddelen, milieudruk en host immuun mechanismen3.

De groei van de biofilm van C. albicans begint met de vroege hechting van planktonische cellen op een substraat, gevolgd door de verspreiding van gistcellen door middel van het oppervlak van het substraat, en hyphal groei. De laatste fase van de groei van de biofilm is de maturatie fase, waarin gist-achtige ontwikkeling wordt onderdrukt, de hyphal ontwikkeling breidt en de extracellulaire matrix omsluit de biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) in de matrix samen vormen de mannan-glucaan complexe5,6. De interactie van exopolysaccharides is van cruciaal belang voor de verdediging van de biofilms tegen drugs7. Vandaar, de vermindering van EPS uit de extracellulaire matrix van C. albicans kan ondersteunen de ontwikkeling van nieuwe antibiofilm protocollen voor orale candidiasis controle

Licht regelt de groei, de ontwikkeling en het gedrag van verschillende organismen8 en deze is vereffend als een antimicrobiële in Fotodynamische antimicrobiële chemotherapie (PACT). PACT is een zichtbaar licht van een specifieke golflengte en een licht absorberende fotosensitizer9van toepassing. De photosensitizers hebben echter problemen in de biofilm, doordringende veroorzaakt lagere werkzaamheid10. Het falen van therapeutische agenten om te infiltreren volledig biofilms is een reden dat biofilms, af en toe van zich verzetten tegen traditionele antimicrobiële therapie3,5. Deactiveren van de bijgevoegde Microbiële cellen, moeten antimicrobiële stoffen doordringen via de extracellulaire matrix; Toch is het EPS kenmerkt een diffusional obstakel voor dergelijke moleculen door te vragen hun niveau van vervoer in de biofilm of door het beïnvloeden van de reactie van de antimicrobiële met de matrix zelf11.

Gezien de nadelen van het PACT, het gebruik van licht vanzelf naar voren komt als een waardevolle verbetering. Voorlopige gegevens bleek dat de behandeling met blauw licht twee keer per dag de productie van EPS-onoplosbaar in Streptococcus mutans biofilm aanzienlijk geremd. Door de daling van de EPS-onoplosbaar, blauw licht verminderd biofilm groei. De resultaten van fototherapie rood licht met C. albicans biofilms zijn echter schaars. Vandaar, is het doel van dit onderzoek was om te evalueren in welke wijze fototherapie met behulp van rood licht de groei en de rangschikking van C. albicans biofilm beïnvloedt. Voor de behandeling tweemaal daags, aangepast we onze laboratory's eerdere protocollen9,12 te bieden een gemakkelijk en reproduceerbaar biofilm model dat antwoorden met betrekking tot de levensvatbaarheid levert, droog gewicht en extracellulaire polysacchariden bedragen na rood licht behandeling. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt voor het testen van andere therapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van de voedingsbodems

  1. Sabouraud dextrose agar (SDA) voor te bereiden. Schorten 65 g van SDA aangevuld met chlooramfenicol (50 mg/L) in 1000 mL gedestilleerd water. Kook om volledig los van het medium. Steriliseren in autoclaaf bij 15 PSI (121° C) gedurende 30 minuten afkoelen tot 45-50 ° C. Meng goed en giet in steriele Petri platen 20 mL van de SDA (grootte: 100 x 15 mm).
  2. Voorbereiding van gist stikstof base (YNB) medium aangevuld met 100 mM glucose door het mengen van 6,7 g YNB en 18 g dextrose tot 1000 mL ultrazuiver water. Meng met behulp van een roerder en steriliseren van het medium gebruik een vacuüm 0,22 µm-filtersysteem.
  3. RPMI voor te bereiden door het mengen van 10.4 g RPMI 1640 en 34.32 g van 3-(N-morfolino) propanesulfonic zuur (MOPS) tot 1000 mL ultrazuiver water. Meng in een roerder zonder warmte en breng de pH op 7 door toevoeging van 1 N NaOH (toevoegen 2 g NaOH aan 50 mL ultrazuiver water). Steriliseren het medium gebruik een vacuüm 0,22 µm-filtersysteem.

2. pre entmateriaal en entmateriaal

  1. Verwijder het micro-organisme C. albicans SN425 uit de −80 ° C diepvriezer en laat het ontdooien bij kamertemperatuur. Zaad van 10 µL van de voorraadculturen op petrischalen met SDA aangevuld met chlooramfenicol (50 mg/L). Incubeer de petrischaaltjes aëroob bij 37 ° C gedurende 48 uur.
  2. Na 48u van incubatie, toevoegen 10 kolonies van C. albicans tot 10 mL van de gist stikstof base (YNB) gemiddeld aangevuld met 100 mM glucose en Incubeer bij 37 ° C voor 16 h voor de pre entmateriaal aëroob.
  3. Na incubatie voor 16 h, de inoculums bereid door verdunning van de starterculturen in verse YNB medium aangevuld met 100 mM glucose in een 1:10 verhouding (1 mL van de cultuur van de starter verdund in 9 mL YNB). De eerste optische dichtheid (OD) meten bij 540 nm.
  4. Incubeer de inoculums aëroob bij 37 ° C gedurende 8 uur totdat de stammen de mid log groeifase bereikt en meten van de definitieve OD bij 540 nm. Aftrekken van de uiteindelijke OD van de initiële OD om te controleren of de OD van de inoculums op de mid log groeifase (8 h, gebaseerd op de groeikrommes in Figuur 1).
  5. Om te bereiken een entmateriaal met 107 cellen mL-1, het entmateriaal voor 5 min bij 5.500 x gcentrifugeren, verwijder het supernatant en concentreren van het entmateriaal tot de helft van het volume van de buizen.

3. de Biofilm vorming en fototherapie

  1. Voeg 1 mL van het entmateriaal aan de putjes van een 24-well polystyreen plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 90 minuten dat cel adhesie naar de onderkant van de putten aëroob.
  2. Gebruik een niet-coherente rood licht (Zie Tabel van materialen) als de lichtbron met een golflengte van 635 ± 10 nm en een vaste uitvoergegevens vermogen van 1.460 mW cm−2.
  3. Een energiemeter gebruiken voor het meten van de vermogensdichtheid van het licht. De bestralingsdosis toegepast is 87.6 J cm-2, gelijkwaardig aan ongeveer 1 min van blootstelling. Gebruik de formule energie dichtheid (J/cm2) = vermogensdichtheid (W/cm2) x bestraling tijd (s). Een afstand van 5 mm tussen de lichtbron en de biofilm om te voorkomen dat opwarming van de aarde de steekproef toepassing.
  4. Behandeling van de positieve controle biofilms met 0,12% chloorhexidine voor 1 min en negatieve controle biofilms met 0,89% NaCl voor 1 min.
  5. Na behandelingen, wassen alle biofilms tweemaal met 0,89% NaCl-oplossing.
  6. Voeg vervolgens 1 mL van RPMI 1640 gebufferd met 3-(N-morfolino) propanesulfonic zuur (MOPS) met een pH van 7 naar de biofilms en Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts.
  7. In de ochtend, gelden de dezelfde behandelingen zoals stappen 3.2-3.6, wassen de biofilms tweemaal met 0,89% NaCl, toevoegen van nieuwe RPMI gebufferd met MOPS (1 mL, pH 7) de putjes en incubeer aëroob bij 37 ° C.
  8. Op dezelfde dag, na 6 uur, bloot de biofilms aan het rode licht. Behandeling van de positieve controle biofilms met 0,12% chloorhexidine voor 1 min en negatieve controle biofilms met 0,89% NaCl voor 1 min. Na behandelingen, wassen de biofilms tweemaal met 0,89% NaCl-oplossing.
  9. Herhaal de stappen 3.2-3,8 tot 48u van biofilm ontwikkeling te bereiken.
    Opmerking: In principe één behandeling zal gebeuren in de ochtend en andere zal gebeuren in de middag op dezelfde dag (6 h uit elkaar).

4. verwerking van de

  1. Voeg 1 mL steriele 0,89% NaCl naar de waterput om de biofilm door het krabben van de goed met behulp van een pipet tip. De verwijderde biofilm aan een steriele buis toevoegen.
  2. Voeg een ander 1 mL steriele 0,89% NaCl naar de waterput. Kras er opnieuw en voeg de schorsing aan de dezelfde buis voor een totaal volume van 2 mL.
  3. Kolonie-vormende eenheden (kve)
    1. Krachtig vortex de biofilm schorsing voor 1 min. De schorsing van de biofilm, gebruiken een aliquoot gedeelte van 0,1 mL voor de seriële verdunning.
    2. Verdun de opschorting van de biofilm van 10-1 tot 10-4 in 0,89% NaCl-oplossing.
    3. Zaad van 50 μl van elke verdunning op SDA platen en Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 48 uur.
    4. Tellen van de kolonies en toepassing van de formule CFU/mL = aantal kolonies x 10n / q (n = verdunning; q = geplaatste volume).
  4. Droog gewicht
    1. Wegen en etiketteren van microcentrifuge buizen.
    2. Gebruik vanaf de biofilm schorsing, 0,1 mL voor bepaling van het droge gewicht (biomassa).
    3. 1 mL van absolute ethanol toevoegen aan een bekende hoeveelheid van 0,1 mL van de biofilms en opslaan bij-20 ° C gedurende 18 uur. Na 18u, centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten.
    4. Verwijder het supernatant, plaatst u de buizen op een exsiccator tot het drogen van de monsters gedurende één week en wegen de buizen van de microcentrifuge opnieuw.
  5. In water oplosbare polysacchariden (WSPs) en alkali-oplosbare polysacchariden (ASPs)
    1. Uit de biofilm suspensie, krachtig vortex de rest van het volume (1.8 mL) voor 1 min en centrifugeer bij 5.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Bewaar het supernatant in een nieuwe buis en was het neerslag tweemaal met de cellen die de onoplosbare bestanddelen van de extracellulaire matrix met steriele ultrazuiver water (5.500 × g, 10 min bij 4 ° C) bevatten.
    2. Resuspendeer de onoplosbare inhoud op 1.8 mL steriele ultrazuiver water.
    3. In water oplosbare polysacchariden (WSPs)
      Opmerking: Voer dit experiment in een zuurkast.
      1. Reserveren van het opgeslagen supernatant, 1 mL voor de kwantificering van de in water oplosbare polysacchariden (WSPs).
      2. Meng het opgeslagen supernatant voor 1 min. Vervolgens overbrengen in steriele buizen en toevoegen van 2,5 volumes van 95% ethanol. Bewaar de buizen voor 18u bij-20 ° C voor WSPs neerslag.
      3. Na 18u, centrifugeer de buizen bij 9.500 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Na het centrifugeren, gooi het supernatant.
      4. De monsters driemaal met 75% ethanol wassen en drogen van de pellets. Resuspendeer de pellet met 1 mL steriele ultrazuiver water en kwantificeren van de WSP fenol-zwavelzuur zuur methode.
      5. 0,1% glucose (0,01 g glucose tot 10 mL ultrazuiver water) gebruiken voor de standaard curve (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 en 25 µL van glucose per buis).
      6. 200 µL van 5% fenol (2,7 mL van 90% fenol 47.3 ml ultrazuiver water) toevoegen aan een glazen buis, bestaande uit 200 µL van het monster of standaard curve wijs (in drievoud per monster) en meng voorzichtig.
      7. Voeg 1 mL zwavelzuur aan de buis en meng. Wacht 20 min voor de reactie en de monsters met behulp van een spectrofotometer meten (490 nm).
    4. Alkali-oplosbare polysacchariden (ASPs)
      Opmerking: Voer dit experiment in een zuurkast.
      1. Scheiden van het onoplosbare opnieuw opgeschorte bedrag, 1 mL voor de bepaling van ASPs. Centrifugeer het aliquots van elke opschorting van de biofilm (13.000 x ggedurende 10 minuten bij 4 ° C).
      2. Verwijder voorzichtig het supernatant van elke buis. Leg vervolgens de monsters op een vacuüm concentrator te drogen van de pellets.
      3. Weeg de pellets en voeg 300 µL van 1 N NaOH (2 g NaOH aan 50 mL ultrazuiver water) per 1 mg van het droge gewicht. Incubeer hen gedurende 2 uur bij 37 ° C en vervolgens Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 10 minuten.
      4. Microcentrifuge buizen, behoud van de pellet voorzichtig het supernatant met een pipet en overdracht verzamelen.
      5. Nogmaals, een gelijk volume 1 N NaOH toevoegen aan de buizen bestaande uit de pellets, en herhaal de zelfde stappen zoals hierboven voor de winning van ASP.
      6. Na incubatie gedurende 2 uur, centrifugeren van de monsters (13.000 x g gedurende 10 minuten), zorgvuldig verzamelen het supernatant en toevoegen aan de eerder verzamelde supernatant.
      7. Voor de derde extractie, herhaal de zelfde stappen zoals hierboven, maar dit keer, doen niet de monsters gedurende 2 uur voordat het centrifugeren uit te broeden.
      8. Daarna drie delen ethanol 95% aan elk monster toevoegen. Vervolgens voorraad de monsters op −20 ° C gedurende 18 uur bij precipitatie van ASP.
      9. Centrifugeer de buizen (9.500 × g gedurende 20 minuten bij 4 ° C) en gooi het supernatant.
      10. Elke pellet driemaal met 75% ethanol wassen en drogen (dezelfde procedures deed voor WSP). Resuspendeer de pellets in gelijke totaalvolume van de eerste extractie met 1 N NaOH.
      11. Lees de monsters voor de kwantificering van ASP met behulp van de fenol-zwavelzuur (dezelfde als voor de WSP analyse).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 2 weergegeven de uitkomsten van Log10 CFU/mL C. albicans na per diem behandelingen met rood licht voor 1 min. Roodlicht aanzienlijk verminderd de Log10 CFU/mL vergeleken met de NC (p = 0.004). Figuur 3 geeft de resultaten van de biomassa (mg) van C. albicans biofilms na dagelijkse behandelingen. Alle behandelde groepen bleek van vermindering van de biomassa ten opzichte van de NC (p ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest kritische stappen voor het succesvol kweken van C. albicans biofilm zijn: 1) om te doen de pre entmateriaal en het entmateriaal in YNB medium aangevuld met 100 mM glucose; 2) te wachten 90 min op de fase van de hechting en zorgvuldig was tweemaal de putjes met 0,89% NaCl voor het verwijderen van niet-naleving cellen; en 3) toe te voegen RPMI medium aan de zelfklevend cellen om te beginnen de vorming van de biofilm, aangezien RPMI schimmeldraden groei zal stimuleren. Aneuploidies kan optreden wanneer kwe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Malvin N. Janal en Dr. Iriana Zanin voor de ontwikkeling van deze studie. We erkennen ook Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) voor het doneren van de spanning in dit onderzoek geanalyseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Clorhexidine 20% Sigma-AldrichC9394
Dextrose (D-Glucose) AnhydrousFisher ChemicalD16-500
Ethanol 200 proofDecon LaboratoriesDSP-MD.43
LumaCare LC-122 A LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA 
NaCl Fisher ChemicalS641-500
NaOH Fisher Bioreagents BP 359-500
Phenol 5%Milipore Sigma843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)SigmaR7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicolAcumedia7306A
Sulfuric acid Fisher ChemicalSA200-1
Yeast nitrogen base DifcoDF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPSSigma-AldrichM1254
 24-well polystyrene plate Falcon353935

Referenties

  1. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
  2. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
  3. Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
  4. Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
  5. Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
  6. Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
  7. Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828(2016).
  8. Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
  9. de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941(2015).
  10. Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
  11. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
  12. Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372(2017).
  13. Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).
  14. Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
  15. Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
  16. Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
  17. Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
  18. Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

RoodlichttherapieBiofilmvormingKolonievormende eenhedenDrooggewichtanalyseExtracellulaire polysacharidenFototherapiebehandelingRPMI 1640-mediumChloorhexidinecontroleNatriumchloride
Dagelijkse fototherapie met rood licht te reguleren Candida albicans Biofilm groei
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.