Methodenartikel

Identificatie van Nucleollaire factoren tijdens de HIV-1-replicatie via Rev-immunoprecipitatie en massaspectrometrie

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59329

⸱

26 juni 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we Rev immunoprecipitatie in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. De beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor de identificatie van nucleollaire factoren die betrokken zijn bij de HIV-1-infectieuze cyclus en zijn van toepassing op andere ziekte modellen voor de karakterisering van onderbestudeerde trajecten.

Samenvatting

De HIV-1 infectieuze cyclus vereist virale eiwit interacties met gastheerfactoren om virale replicatie te vergemakkelijken, verpakking, en vrijlating. De infectieuze cyclus verder vereist de vorming van virale/gastheer eiwitcomplexen met HIV-1-RNA te reguleren van de splicing en het inschakelen van nucleocytoplasmorische transport. Het HIV-1 rev-eiwit bereikt de nucleaire export van HIV-1 Mrna's door middel van multimerisatie met intronic CIS-acteer doelen-het Rev Response element (RRE). Een nucleolar lokalisatie signaal (NoLS) bestaat binnen het COOH-eindpunt van de Rev arginine-Rich motief (ARM), waardoor de accumulatie van Rev/RRE complexen in de Nucleolus. Nucleollaire factoren worden gespeculeerd ter ondersteuning van de HIV-1-infectieuze cyclus door middel van verschillende andere functies naast het bemedieren van mRNA-onafhankelijke nucleaire export en splicing. We beschrijven een immunoprecipitatie methode van wild-type (WT) Rev in vergelijking met Rev nucleolar mutaties (deletie en single-point Rev-NoLS mutaties) in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. Nucleollaire factoren die betrokken zijn bij het nucleocytoplasminezuur transport (nucleophosmin B23 en nucleolin C23), evenals cellulaire splicing factoren, verliezen interactie met Rev in de aanwezigheid van Rev-NoLS mutaties. Verschillende andere nucleollaire factoren, zoals snoRNA C/D Box 58, zijn geïdentificeerd om interactie met Rev-mutaties te verliezen, maar hun functie in de HIV-1-replicatiecyclus blijft onbekend. De hier gepresenteerde resultaten tonen het gebruik van deze aanpak voor de identificatie van virale/host-nucleollaire factoren die de HIV-1-infectieuze cyclus behouden. De begrippen die in deze benadering worden gebruikt, zijn van toepassing op andere virale en ziekte modellen die de karakterisering van onderbestudeerde trajecten vereisen.

Inleiding

De Nucleolus wordt gepostuleerd als de interactie grond van verschillende cellulaire host en virale factoren die nodig zijn voor virale replicatie. De Nucleolus is een complexe structuur onderverdeeld in drie verschillende compartimenten: het fibrillar compartiment, het dichte fibrillar compartiment en het granulaire compartiment. Het HIV-1 rev-eiwit lokaliseert specifiek binnen korrelvormige compartimenten; echter, de reden voor dit lokalisatie patroon is onbekend. In aanwezigheid van éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev mutaties 4, 5 en 6), handhaaft Rev een nucleolar patroon en is eerder aangetoond dat het HIV-1HXB2 replicatie moet redden, maar met een verminderde efficiëntie vergeleken met WT Rev1 . Alle éénpuntmutaties zijn niet in staat om de HIV-1NL4-3 infectieuze cyclus te ondersteunen. In de aanwezigheid van meerdere éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev-NoLS mutaties 2 en 9), is Rev waargenomen om te dispergeren in de Nucleus en het cytoplasma en heeft het niet kunnen redden van HIV-1HXB2 replicatie1. Het doel van deze proteomica studie is het ontcijferen van nucleollaire en niet-nucleollaire cellulaire factoren die betrokken zijn bij de Rev-mediated HIV-1 infectieuze pathway. Rev immunoprecipitatie voorwaarden worden geoptimaliseerd door interactie met de nucleolar B23 fosfoproteïne, die eerder is aangetoond dat het verliezen van interactie met Rev in de aanwezigheid van nucleollaire mutaties.

Rev cellulaire factoren zijn uitgebreid bestudeerd in het verleden; Dit is echter gebeurd bij afwezigheid van virale pathogenese. Een eiwit, in het bijzonder, dat wordt gekenmerkt in deze studie door middel van Rev interactie tijdens HIV-1 replicatie is de nucleolar fosfoprotein B23-ook wel nucleophosmin (NPM), numatrin, of NO38 in amfibieën2,3, 4. B23 wordt uitgedrukt als drie isovormen (NPM1, NPM2, en NPM3)-alle leden van de nucleophosmin/nucleoplasmin nucleaire chaperonne familie5,6. De NPM1 moleculaire chaperonne functies in de juiste assemblage van nucleosomes, in de vorming van eiwitten/nucleïnezuur complexen die betrokken zijn bij chromatine hogere orde structuren7,8, en in de preventie van aggregatie en het verkeerd vouwen van doel eiwitten via een N-terminaal kern domein (residuen 1-120)9. NPM1 functionaliteit strekt zich uit tot ribosoom Genesis door het transport van preribosomale deeltjes tussen de Nucleus en cytoplasma10,11, de verwerking van preribosomale RNA in de interne getranscribeerde spacer sequentie 12,13, en het arresteren van de nucleollaire aggregatie van eiwitten tijdens de ribosomale assemblage14,15. NPM1 is betrokken bij de remming van apoptosis16 en in de stabilisatie van tumor suppressors ARF17,18 en p5319, onthullen zijn dubbele rol als een oncogene factor en tumor suppressor. NPM1 neemt deel aan de cellulaire activiteiten van genoom stabiliteit, centrosoom replicatie, en transcriptie. NPM1 is gevonden in nucleoli tijdens celcyclus Interphase, langs de chromosomale periferie tijdens mitose, en in prenucleolar lichamen (PNB) aan het einde van de mitose. NPM2 en NPM3 zijn niet zo goed bestudeerd als NPM1, die ondergaat veranderde expressieniveaus tijdens maligniteiten20.

NPM1 is gedocumenteerd in de nucleocytoplasmische pendelen van verschillende nucleaire/nucleollaire eiwitten via een interne NES en nls9,21 en werd eerder gerapporteerd aan de nucleaire import van HIV-1 tat en Rev eiwitten rijden. In aanwezigheid van B23-bindende-Domain-β-galactosidase fusie eiwitten, TAT mislocaliseert binnen het cytoplasma en verliest trans activatie activiteit; Dit toont een sterke affiniteit van TAT voor B232. Een andere studie vestigde een Rev/B23 stabiel complex in de afwezigheid van RRE-bevattende Mrna's. In aanwezigheid van RRE mRNA, Rev dissocieert van B23 en bindt bij voorkeur aan de HIV RRE, wat leidt tot de verplaatsing van B2322. Het is niet bekend waar, op het subnucleaire niveau, TAT trans activatie en de Rev Exchange process van B23 voor HIV mRNA plaatsvinden. Beide eiwitten zijn gepostuleerd om gelijktijdig via B23-interactie de Nucleolus binnen te gaan. De betrokkenheid van andere cellulaire eiwitten van de host in de HIV-nucleollaire pathway wordt verwacht. De in dit Proteomica-onderzoek beschreven methoden zullen helpen om het samenspel van de Nucleolus met gastheer cellulaire factoren die betrokken zijn bij HIV-1-pathogenese te verhelden.

Het Proteomica onderzoek werd geïnitieerd door de uitdrukking van Rev nols single-point mutaties (M4, M5 en M6) en meerdere arginine substituties (m2 en M9) voor HIV-1HXB2 productie. In dit model is een HeLa-cellijn dat stabiel de Rev-deficiënte HIV-1HXB2 (hlfb) UITDRUKT met WT rev en Rev nucleolar mutaties met een flag tag op het 3 ' einde. De aanwezigheid van WT Rev zorgt ervoor dat virale replicatie plaatsvindt in de HLfB-cultuur, in vergelijking met Rev-NoLS-mutaties die geen Rev-deficiëntie (m2 en M9) redden, of toestaan dat virale replicatie plaatsvindt, maar niet zo efficiënt als WT Rev (M4, M5 en M6)1. Het celllysaat wordt 48 h later verzameld na virale proliferatie in aanwezigheid van Rev expressie en onderworpen aan immunoprecipitatie met een lysisbuffer geoptimaliseerd voor rev/B23 interactie. Lysis buffer optimalisatie met behulp van variërende zoutconcentraties wordt beschreven, en eiwit elutie methoden voor HIV-1 rev worden vergeleken en geanalyseerd in zilver gebeitst of Coomassie-gekleurd SDS-PAGE gels. De eerste proteomica-benadering omvat de directe analyse van een geeluteerde steekproef van geuite WT Rev, m2, M6 en M9 door massaspectrometrie met tandem. Een tweede benadering waarbij de eluaten van WT Rev, M4, M5 en M6 een gel-extractieproces onderging, wordt vergeleken met de eerste benadering. Peptide affiniteit met Rev-NoLS mutaties in vergelijking met WT Rev wordt geanalyseerd en de eiwit identificatie waarschijnlijkheid weergegeven. Deze benaderingen onthullen mogelijke factoren (nucleolar en nonnucleolar) die deelnemen aan HIV-1 mRNA transport en splicing met Rev tijdens HIV-1 replicatie. In het algemeen zijn de beschreven cellysis, IP-en elutie-omstandigheden van toepassing op virale eiwitten die van belang zijn voor het begrijpen van cellulaire factoren van de host die infectieuze trajecten activeren en reguleren. Dit is ook van toepassing op de studie van cellulaire gastheerfactoren die nodig zijn voor de persistentie van verschillende ziekte modellen. In dit proteomica-model is HIV-1 rev-IP geoptimaliseerd voor B23-interactie om nucleollaire factoren te verhelden die betrokken zijn bij nucleocytoplasmorische pendelen activiteit en HIV-1 mRNA-binding. Bovendien kunnen cellijnen die stabiel zijn voor infectieuze ziekte modellen die een tekort hebben aan belangrijke eiwitten van belang, worden ontwikkeld, vergelijkbaar met de HLfB-cellijn, om infectieuze trajecten van belang te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. celcultuur

  1. Handhaaf hlfb in het gemodificeerde eagle's medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mm L-glutamine en 1 mm natrium pyruvaat binnen met weefselcultuur behandelde 100 mm platen. Houd de celculturen bij 37 °C in een bevoficeerde incubator die wordt geleverd met 5% CO2. Passage confluente cellen naar een celdichtheid van 1 x 106 cellen/ml.
  2. Gooi de celkweek media weg. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder en gooi de 1x PBS weg zonder de cellaag te verstoren.
  3. Voeg 2 mL 1x trypsine-EDTA-oplossing toe aan de cellen. Steen het gerecht om de monolaag te kapen en inincuberen bij 37 °c binnen een bevoficeerde kamer gedurende 5 minuten.
  4. Tik stevig aan de zijkant van de schaal met de Palm van de hand om de cellen los te maken. Respendeer de losgekoppelde cellen in 8 mL verse kweekmedia. Draai de cellen op 400 x g gedurende 5 minuten.
  5. Gooi de kweekmedia weg zonder de celpellet te verstoren. Respendeer de celpellet in 10 mL verse kweekmedia. Subcultuur 1 mL geconcentreerde cellen met 9 mL verse kweekmedia binnen met weefselcultuur behandelde 100 mm platen.
    NB: voor elke Rev-NoLS mutatie zal 3x 100 mm HLfB of HeLa cultuur platen voldoende proteïne lysaat opleveren voor Western Blot analyse en massaspectrometrie. Voeg extra platen toe voor een WT Rev positieve controle en negatieve controle. Het subcultuurcelvolume moet worden geoptimaliseerd met het gebruik van verschillende celtypen.

2. expressie van Rev-NoLS-3'flag mutaties tijdens HIV-1 replicatie

  1. Laat de celcultuur van de HLfB groeien tot een celdichtheid van 2 x 106 cellen/ml. Bereid 4 mL calciumfosfaat-DNA suspensie voor elke 100 mm plaat als volgt.
    1. Label 2 15 mL buizen als 1 en 2. Voeg 2 mL 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl en 1,5 mM na2HPO4 [pH 7,12]) toe aan buis 1. Voeg TE 79/10 (1 mM tris-HCl en 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) toe aan buis 2. Het volume van TE 79/10 is 1,760 mL-het volume van het DNA.
    2. Voeg 20 μg plasmide toe met de Rev-NoLs-3'flag-mutatie van belang voor buis 2 en meng de inhoud door resuspensie. Voeg 240 μL 2 M CaCl2 toe aan buis 2 en meng opnieuw door resuspensie.
    3. Breng het mengsel van buis 2 naar buis 1 dropwise, zachtjes mengen. Laat de suspensie op kamertemperatuur 30 minuten zitten. Vortex de neerslag.
  2. Voeg 1 ml van de suspensie druppelsgewijs toe aan elk van de 3-celculturen, 100 mm platen terwijl u de media zachtjes zwenkende. Breng de platen terug naar de incubator en laat het transfectie mengsel 6 uur staan. Vervang het transfectie mengsel door 10 mL verse kweekmedia en incumener de cellen voor 42 h.

3. verzameling van virale eiwit lysaat

  1. Gooi de celmedia 48 h posttransfectie. Plaats elke 100 mm plaat op een bed van ijs. Label 15 mL buizen voor elk Rev-NoLS mutatie monster en plaats de buizen op ijs.
  2. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 mL voorgekoelde 1x PBS zonder de cellaag te verstoren. Gooi de 1x PBS weg. Voeg 3 mL lysisbuffer (50 mM tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl en 1% X-100 wasmiddel [Zie de tabel van de materialen]), behandeld met cocktail van proteaseremmer, toe aan elk van de 100 mm platen.
  3. Gebruik een celscraper om de cellaag te verstoren. Kantel de plaat en plak de cellen zachtjes in een zwembad. Verzamel het cellenlysaat met een micro Pipet van 1.000 μL en meng de cellysaten van elk van de 3 100 mm platen in de prelabeled 15 mL Tube.
  4. Inbroed de cel lysaat op ijs voor 15 min, grondig elke 5 min. Centrifugeer het cellysaat bij 15.000 x g gedurende 5 min.
  5. Verzamel het eiwit supernatant zonder de pellet van de celresten te verstoren en breng het over naar een andere steriele 15 mL Tube. Verkrijg de virale eiwit lysaat-concentratie met behulp van de Bradford-methode (zie rubriek 4).
  6. Bewaar een aliquot van het ingangs monster (20 μg) voor de westerse immunoblotanalyse. Voeg 2x sample buffer (20% glycerol, 0,02% broomfenolblauw, 125 mm tris-cl [pH 6,8], 5% SDS en 10% 2-mercaptoethanol) toe aan het uiteindelijke volume. Kook het gedurende 10 minuten op 95 °C en bewaar het invoer monster bij-20 °C.

4. Bradford-test

Opmerking: bereid 10x bovien serumalbumine (BSA) van 100x BSA voorraad voor het genereren van eiwit standaard curven.

  1. Aliquot water in micro centrifugebuizen voor de volgende blanco en normen: blank = 800 μL; Standaard 1 = 2 mg/mL, 798 μL; Standaard 2 = 4 mg/mL, 796 μL; Standaard 3 = 6 mg/mL, 794 μL; Standaard 4 = 8 mg/mL, 792 μL; Standaard 5 = 10 mg/mL, 790 μL. aliquot 10x BSA in de volgende aangewezen normen: standaard 1 = 2 μL; Standaard 2 = 4 μL; Standaard 3 = 6 μL; Standaard 4 = 8 μL; Standaard 5 = 10 μL.
  2. Bereid een mengsel van eiwit monsters door het mengen van 795 μL water met 5 μL eiwit monsters. Voeg 200 μL eiwit assay kleurstof reagens (Zie de tabel met materialen) toe aan elk blanco, standaard en eiwit monster. Vortex de monsters kort voor een gelijkmatig mengsel en incuberen bij kamertemperatuur (18-20 °C) gedurende 5 minuten.
  3. Breng de blanco, normen en eiwit monsters over naar cuvettes. Meet de eiwit concentraties bij een OD van 595 nm.

5. coimmunoprecipitatie van Rev-NoLS-3'vlag

  1. Spoel 25 μL m2 affiniteits gelparels (Zie de tabel met materialen) met 500 μL lysisbuffer, behandeld met cocktail van proteaseremmers. Spoel meer affiniteits gelparels uit voor elk mutatie monster en-besturingselementen.
    Opmerking: bereid voldoende m2 Affinity gel kralen voor twee gels (50 μL)-één voor westerse immunoblot analyse en de andere voor eiwit kleuring en massaspectrometrie.
  2. Spin bij 820 x g gedurende 2 minuten bij 4 °c. Verwijder het supernatant. Spoel 2x meer.
  3. Voeg virale proteïne lysaat (1 mg/mL in 5 mL totaal volume) toe aan de prerinsed m2-affiniteits kralen. Pas het totale volume aan met de lysisbuffer.
  4. Inincuberen de reactie voor 3 uur, draaiend bij 4 °C. Centrifugeer de m2-affiniteits kralen/virale eiwit lysaat bij 820 x g gedurende 1 minuut.
  5. Verzamel het supernatant en bewaar een hoeveelheid post-IP monster (20 μg) voor westerse immunoblot analyse. Meet de eiwitconcentratie van het post-IP lysaat. Verzamel 20 μg voor westerse immunoblotting.
  6. Voeg 2x sample buffer toe aan het uiteindelijke volume. Kook het gedurende 10 minuten op 95 °C en bewaar het na-IP-monster bij-20 °C.
  7. Spoel de m2 kralen af met 750 μL lysisbuffer en was de parels op een Rotator bij 4 °C gedurende 5 min. Centrifugeer de m2 kralen op 820 x g en gooi het supernatant weg.
  8. Herhaal stap 5,7 voor nog twee wasjes op een Rotator bij 4 °C gedurende 5 minuten. Na de derde wasbeurt, Verwijder eventuele sporen van lysisbuffer van het m2 kralen/co-IP complex met behulp van een lange gel-loading tip.
    Opmerking: knijp het uiteinde van de gel-loading tip met platte pincet voordat u eventuele sporen van de lysisbuffer verwijdert. Dit voorkomt de verstoring en opname van de m2 kralen.
  9. Respendeer de m2 kralen in 55 μL van 2x laad buffer. Kook het monster gedurende 10 minuten bij 95 °C.
  10. Breng 25 μL eluaat op twee afzonderlijke SDS-PAGE gels (één gel voor westers immunoblotting en de andere voor Coomassie-kleuring).

6. bereiding van SDS-PAGE gels

  1. Gegoten 2 15% SDS-acrylamide oplossing van gels door de volgende reagentia te mengen in een buis van 50 mL (in een eindvolume van 40 mL, voldoende voor vier gels): 4,16 mL ultrapuur water, 15 mL 40% acrylamide: bisacrylamide (29:1), 10 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 400 μL 10% SDS, 400 μL van 10% ammonium persulfaat en 40 μL TEMED.
  2. Meng de oplossend gel door de 50 mL buis meerdere malen te inverteren. Pipetteer het oplossend gelmengsel in een voorgespeende westers gelapparaat (vier gels-drie voor westerse immunoblotting en één voor Coomassie/zilver kleuring).
  3. Pipetteer voorzichtig genoeg water om de bovenste laag van het gelmengsel te bedekken. Laat de oplossend gel polymeriseren.
  4. Giet de waterlaag van de oplossend gel met behulp van een delicate taak wisser (Zie de tabel met materialen) om overtollig water te absorberen.
  5. Giet twee 5% SDS-acrylamide stapel gels door de volgende reagentia te mengen in een buis van 50 mL (in een eindvolume van 20 mL, voldoende voor vier gels): 11,88 mL ultrapuur water, 2,5 mL 40% acrylamide: bisacrylamide (29:1), 5,2 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 μL 10% SDS, 200 μL van 10% ammonium persulfaat en 20 μL TEMED.
  6. Meng de stapel gel door meerdere malen de tube van 50 mL te inverteren. Pipetteer het stapelingsgel mengsel boven de oplossend gel naar de bovenkant van het apparaat.
  7. Plaats een gel cassette kam met het juiste aantal rijstroken in de stapel gel. Absorbeer elke overloop van het gelmengsel met behulp van een delicate taak wisser (Zie de tabel met materialen). Laat de stapel gel volledig polymeriseren.
  8. Overstroming van het Westers gelapparaat met 1x Western Running buffer (5x concentratie: 250 mM tris-cl [pH 8,3], 1,92 M glycine, 0,5% SDS en 10 mM EDTA).
  9. Trek de gel cassette kam voorzichtig uit de stapel gel. Laat de 1x Western Running buffer de laad putten vullen. Spoel elk goed met 1x Western Running buffer met behulp van een injectiespuit voordat u de samples laadt.
  10. Laad de westerse immunoblot monsters in elke corresponderende gel (input samples, coimmunoprecipitated samples en post-IP samples). Laad de Western gel Protein markers.
  11. Laad de coimmunoprecipitated samples voor de Coomassie/Silver kleuring in een andere gel. Laad de Western gel Protein markers.
  12. Sluit het hardloop-gel-apparaat aan op een voedingsbron en voer de gels uit op 100 V totdat de laad kleur de oplossend gel bereikt. Verhoog de spanning tot 140 V tot de laad kleurstof de bodem van de oplossend gel bereikt.

7. overdracht van Western Blot

  1. Demonteer het westerse gelapparaat. Snijd en gooi de stapel gel weg en laat de oplossend gel intact.
  2. Breng de oplossend gels voorzichtig over naar een schoon bakje gevuld met westerse overdrachts buffer (25 mM Tris, 194 mM Glycine, 0,005% SDS, 20% methanol) en laat ze gedurende 15 minuten weken.
  3. Monteer de gel Transfer apparatuur als volgt.
    1. Knip drie PVDF-overdrachts membranen en zes stukjes filtreerpapier (Zie de tabel met materialen) naar de grootte van de oplossend gel.
    2. Dompel het PVDF-membraan in methanol gedurende 5 min. Hydrateer het in water gedurende 5 min. plaats het PVDF-membraan in de westelijke overdrachts buffer totdat het klaar is voor gebruik.
    3. Plaats de gelhouder cassette in een glazen bakplaat die deels is gevuld met de Western Transfer buffer, met de zwarte kant aan de onderkant.
    4. Plaats een schuimkussen met een Western Transfer buffer tegen de zwarte kant van de gelhouder cassette.
    5. Bevochtig een stukje filtreerpapier in de Western Transfer buffer en plaats het bovenop het schuimkussen. Plaats de oplossend gel bovenop het filtreerpapier.
      Opmerking: plaats de oplossend gel in de juiste beladings richting die naar het PVDF-membraan wordt overgebracht.
    6. Plaats één PVDF-overdrachts membraan bovenop de oplossend gel. Bevochtig een stukje filtreerpapier met Western Transfer buffer en plaats het bovenop het PVDF-overdrachts membraan.
    7. Plaats een andere schuimkussen gedrenkt met westerse overdrachts buffer bovenop het filterpapier. Vouw voorzichtig de witte kant van de gel houder cassette bovenop het geweekte schuimkussen. Vergrendel de cassette strak.
    8. Plaats de gelhouder cassette in de elektrode assemblage van de overdrachts apparatuur. Herhaal stap 7.3.4-7.3.8 voor elke resterende oplossend gel.
    9. Vul de transfer apparaat tank met Western Transfer buffer. Plaats een roerstaaf in de apparaat tank.
    10. Plaats de apparaat tank bovenop een roer plaat. Stel de roer instelling in op 5-6 en zorg ervoor dat de roer stang niet vastzit of op de cassettes van de gelhouder raakt.
    11. Sluit de gel Transfer apparaat aan op een voedingsbron en breng de gel aan op 100 V gedurende 1 uur bij 4 °C.

8. immunoblotting

  1. Verwijder de cassette van de gel houder en plaats de zwarte kant tegen een schone glazen bakplaat. Open de cassette en gooi het schuimkussen en filtreerpapier voorzichtig weg. Markeer een hoek van het PVDF-membraan om de juiste laad richting te bepalen. Houd het membraan nat.
    Opmerking: het PVDF-membraan kan worden gedroogd en in een schone, verzegelde container worden opgeslagen. Hydrateer het membraan door de stappen 7.3.2 te herhalen.
  2. Plaats het membraan in 100 mL blokkerende oplossing (5% melk, 1x TBS en 0,1% Tween 20). Blokkeer het membraan door zachtjes te schommelen bij kamertemperatuur (18-20 °C) gedurende 1 uur.
  3. Snijd over het membraan boven de 25 kDa eiwit marker. Plaats het bovenste gedeelte van het membraan, met eiwit banden groter dan 25 kDa, in blokkerende oplossing met B23 muis monoklonaal IgG1 (1:500 verdunning). Blokkeer 's nachts, schommelen bij 4 °C.
  4. Plaats het onderste gedeelte van het membraan, met eiwit banden kleiner dan 25 kDa, in blokkerende oplossing met m2 muis monoklonaal IgG1 (1:1000 verdunning, zie de tabel met materialen). Blokkeer 's nachts, schommelen bij 4 °C.
  5. Was het membraan 3x voor 10 min in 25 mL Western Wash Solution (1x TBS, 0,1% Tween 20) op een schommel platform.
  6. Inincuberen van de membranen in geit-anti-muis IgG1-HRP (1:5000 verdunning) verdund in blokkerende oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was het membraan 3x voor 10 min in 25 mL Western Wash oplossing op een schommel platform.
  7. Bereid chemiluminescentie Western blotting substraat. Gebruik een P1000 micropipet om het substraat aan het membraan toe te voegen.
  8. Ontwikkelen van elk membraan in chemiluminescentie Western blotting substraat voor 5 min. Verwijder het membraan van het substraat. Absorbeer overtollig substraat met behulp van een delicate taak wisser (Zie de tabel met materialen).
  9. Plaats het membraan in een schone blad beschermer die aan de binnenzijde van een cassette is geplakt. Neem de cassette in een donkere kamer en plaats één vel folie in de cassette. Vergrendel de cassette op zijn plaats en inbroed gedurende 5 – 15 minuten. Verwijder de film uit de cassette en ontwikkel deze.

9. Coomassie-kleuring

  1. Demonteer het westerse gelapparaat. Snijd en gooi de stapel gel weg en laat de oplossend gel intact. Breng de oplossend gel voorzichtig over naar een schoon bakje gevuld met 25 mL ultrazuiver water.
  2. Inbroed de gel op een schommel platform voor 15 min. gebruik zacht schommelen om te voorkomen dat de oplossend gel breekt. Gooi het ultrapuur water weg en herhaal de wasstap 2x meer.
    Opmerking: Als SDS Bubbles na de wasstappen blijven, kan de gel 's nachts in ultrapuur water worden gewassen. Het resterende VIB kan een hoge achtergrondkleuring van de gel veroorzaken.
  3. Meng het Coomassie vlek reagens door de fles te inverteren (Zie de tabel met materialen). Plaats 100 mL Coomassie Stain reagens om de oplossend gel te bedekken en inbroed de gel op een schommel platform voor 1 uur. Gooi het Coomassie Stain-reagens weg en was de gel in gedeïoniseerd water op een schommel platform gedurende 15 minuten.
  4. Gooi het gedeïoniseerde water weg. Herhaal de wasstap 2x meer. Blijf de gel wassen totdat de gewenste resolutie van de eiwit band wordt waargenomen.

10. zilver kleuring

  1. Demonteer het westerse gelapparaat. Snijd en gooi de stapel gel weg en laat de oplossend gel intact. Breng de oplossend gel voorzichtig over naar een schoon bakje gevuld met 25 mL ultrazuiver water.
  2. Inbroed de gel op een schommel platform voor 15 min. gebruik zacht schommelen om te voorkomen dat de oplossend gel breekt. Gooi het ultrapuur water weg en herhaal de wasstap 2x meer.
    Opmerking: Als SDS Bubbles na de wasstappen blijven, kan de gel 's nachts in ultrapuur water worden gewassen. Het resterende VIB kan een hoge achtergrondkleuring van de gel veroorzaken.
  3. Bevestig de gel in 30% ethanol: 10% azijnzuur oplossing (6:3:1 water: ethanol: azijnzuur) 's nachts bij kamertemperatuur. Was de gel in een 10% ethanol oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vervang de ethanol oplossing en was nog 5 min.
  4. Bereid de werkoplossing voor sensibilisator uit de Pierce Silver Stain Kit door het mengen van een deel zilver vlek sensibilisator met 500 onderdelen ultrapuur water (50 μL van sensibilisator met 25 mL ultrapuur water). Incuberen de oplossend gel in de werkoplossing van de sensibilisator gedurende 1 minuut. was de gel in ultrapuur water gedurende 1 minuut, vervang het water en was de gel opnieuw gedurende 1 minuut.
  5. Bereid vlek werkoplossing door het mengen van één-delige Silver Stain Enhancer met 50 delen zilver vlek (500 μL Enhancer met 25 mL zilver vlek). Inbroed de gel in vlekkenwerk oplossing gedurende 30 minuten.
  6. Bereid de werkoplossing van de ontwikkelaar voor door 1 deel Silver Stain Enhancer te mengen met 50 Parts Silver Stain Developer (500 μL Enhancer met 25 mL ontwikkelaar). Bereid 5% azijnzuur oplossing als stop oplossing. Was de gel met ultrapuur water gedurende 1 minuut, vervang het water en was de gel 1 minuut extra.
  7. Vervang het water met Developer Working Solution en inincuberen totdat de gewenste proteïne band intensiteit is verdwenen (5 min). Vervang de Developer Working Solution met stop Solution en inincuberen gedurende 10 min.

11. in-gel reductie, alkylatie en vertering van Coomassie-gekleurde gelbanden

  1. Snijd de gelbanden van de gel met een schoon scheermesje. Snijd elke Gelband in ongeveer 5 mm blokjes en plaats ze in een schone micro centrifugebuis van 0,5 mL.
  2. Destain de gelstukken door ze te bedekken met 100 mM ammoniumbicarbonaat in 1:1 acetonitril: water bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap.
  3. Droog de gelstukken gedurende 5 minuten in een vacuüm centrifuge. Verminder de eiwitten door de gedroogde gelstukken met 10 mm dithiotreïtol in 100 mm Ammoniumbicarbonaat te bedekken en deze gedurende 1 uur bij 56 °c te bebroed.
  4. Pipetteer elke supernatant af. Alkylaat de eiwitten door de gelstukken met 100 mM iodoacetamide in water te bedekken en deze gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker te bebroed.
  5. Pipetteer het supernatant en verklein de gelstukken door ze met acetonitril te bedekken en ze gedurende 15 minuten zachtjes op kamertemperatuur te schudden. Pipetteer het supernatant en reswell de gelstukken door ze te bedekken met 100 mM Ammoniumbicarbonaat en schud ze zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  6. Herhaal stap 11,5. Droog de gelstukken gedurende 5 minuten in een vacuüm centrifuge.
  7. Bedek de gelstukken met 50 ng/μL sequentie graad gemodificeerde trypsine (Zie de tabel met materialen) in 100 mm Ammoniumbicarbonaat. Laat de gel 5 minuten zwellen; Pipetteer vervolgens de resterende oplossing. Bedek de gelstukken met 100 mM Ammoniumbicarbonaat en laat ze volledig reseren, waarbij extra 100 mM Ammoniumbicarbonaat wordt toegevoegd zodat de gelstukken volledig bedekt zijn.
  8. Incuberen de gelstukken 's nachts bij 37 °C. Stop de reactie door 1/10 van het volume van 10% mierenzuur in water toe te voegen. Verzamel de supernatant van elke buis.
  9. Pak de gelstukken door ze te bedekken met 1% mierenzuur in 60% acetonitril en inbroed ze gedurende 15 minuten met zacht schudden.
  10. Verminder het volume van de gecombineerde supernatanten tot minder dan 20 μL in een vacuüm centrifuge, terwijl u er voor zorgt dat de supernatanten niet volledig worden gedroogd. Voeg 1% mierenzuur toe om het totale volume terug te brengen tot 20 μL.

12. vloeistofchromatografie/massaspectrometrie

Opmerking: de monsters werden geanalyseerd met behulp van een massaspectrometer die is uitgerust met ultra HPLC, een nano spray-bron en een kolom (Zie de tabel met materialen). Oplosmiddelen A en B zijn respectievelijk 0,1% mierenzuur in water en acetonitril.

  1. Laad de verteerde eiwitten in hoge terugwinning polypropyleen autosampler flesjes. Laad de injectieflacons in de monster beheerder van een UPLC-systeem.
  2. Injecteer 6 μL van elk monster. Laad elk monster in de kolom overvulling van de nanotile voor 1,5 min bij 8 μL/min, met 99% oplosmiddel A/1% oplosmiddel B.
  3. Elute de peptiden in de massaspectrometer met een lineaire gradiënt van 3% tot 35% oplosmiddel B over 30 min, gevolgd door een gradiënt van 35% tot 50% oplosmiddel B over 4 min en 50% tot 90% oplosmiddel B over 1 min. Handhaaf 90% acetonitril gedurende 3 min; Verminder vervolgens de% B terug naar 3% over 5 min.
  4. Verwerven van positieve Ion profiel Mass spec gegevens in resolutie (20.000 resolutie) modus. Gegevens verzamelen van 100 tot 2.000 da met een snelheid van één scan elke 0,6 s. gegevens in MSE -modus verzamelen door afwisselende scans zonder botsingsenergie en scans met verhoogde aanrij energie.
  5. Voor de verhoogde botsing energie, helling de botsing energie in de Overvulcel van 15 V tot 40 V. verwerven van een lock Mass scan elke 30 s, met behulp van de + 2 Ion van [glu1]-fibrinopeptide B als de Lock Mass. Een gegevensbestand verkrijgen met behulp van een lege injectie van oplosmiddel A, met dezelfde verwervingsmethode tussen elk paar monsters om de overdracht te regelen.

13. gegevensanalyse voor massaspectrometrie

  1. Kopieer de Mass spectrometrie resultaten bestanden naar de computer met een kwantitatief en kwalitatief proteomica onderzoeksplatform (bijvoorbeeld proteinlynx Global Server). Gegevensanalyse is zeer CPU-intensief en moet worden uitgevoerd op een afzonderlijke, High-Performance Data Analysis computer.
  2. Maak een nieuw project voor de gegevens. Maak een nieuwe microtiterplaat die de autosampler plaat vertegenwoordigt. Wijs de monsters op dezelfde positie in de microtiterplaat als hun positie in de autosampler.
  3. Wijs elke voorbeeld verwerkingsparameters toe. Parameters voor gebruik zijn automatische chromatografische piekbreedte en MSTOF resolutie; lage-energie drempel, 100 telt; verhoogde-energie drempel, 5 tellingen; drempelwaarde voor intensiteit, 500 telt.
  4. Wijs elke voorbeeld workflowparameter toe. Parameters voor gebruik zijn database, samengevoegd Human SwissProt en HIV, met omgekeerde sequenties; automatische peptide en fragment tolerantie; min fragment Ion-matches per peptide, 3; min fragment Ion-matches per eiwit, 7; min peptide matches per proteïne, 1; primair samenvatting reagens, trypsine; gemiste decolleté, 1; vaste modificatie reagentia, carbamidomethyl C; variabele modificatie reagentia, oxidatie M; False Discovery rate, 100.
  5. Selecteer de voorbeelden en kies meest recente onbewerkte gegevens verwerken. Wanneer de zoekopdracht is voltooid, selecteert u de voorbeelden en kiest u gegevens exporteren naar Scaffold (versie 3). Open Scaffold, maak een nieuw bestand, en Importeer elk bestand geëxporteerd uit het proteomica platform als een nieuwe biosample met precursor Ion kwantatie.
  6. Wanneer alle bestanden zijn geïmporteerd, gaat u naar het scherm gegevens laden en analyseren . Selecteer dezelfde database die wordt gebruikt voor het zoeken en importeren van gegevens met behulp van LFDR scoring en standaard experiment-brede eiwit groepering. Stel weergaveopties in op de waarschijnlijkheid van eiwit identificatie, de eiwit drempel tot 20%, het minimum aantal peptiden tot 1 en de peptide drempel tot 0% tijdens de analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Rev-NoLS single-en multiple-Point arginine mutaties, overeenkomend met een verscheidenheid van subcellulaire lokalisatie patronen, werden onderzocht in hun vermogen om te communiceren met cellulaire host factoren in vergelijking met WT Rev. WT Rev-3'vlag en pcDNA-Flag vector werden uitgedrukt in de HLfB-cultuur. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit het totale cellysaat en gekleurd met Zilvervlek reagens. Rev-NoLS-3'flag is detecteerbaar (ongeveer 18 kDa) in drie verschillende lysisbuffer condities met verschillend...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Massaspectrometrische analyses met vergelijking van Rev-NoLS-mutaties en WT Rev in de aanwezigheid van HIV-1 werden beoordeeld om te begrijpen welke nucleollaire factoren betrokken waren bij de virale replicatiecyclus. Dit zou nucleollaire componenten identificeren die nodig zijn voor virale infectiviteit. Nucleollaire B23 heeft een hoge affiniteit met Rev-NoLS en functies in de nucleollaire lokalisatie van Rev3 en nucleocytoplasmorische transport van Rev-gebonden HIV mRNAs22

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen Dr. Barbara K. Felber en Dr. George N. PAVLAKIS voor de HLfB-aanhankelijke cultuur van de National Institutes of Health (NIH) AIDS onderzoek en referentie-reagens programma, afdeling AIDS, Nationaal Instituut voor allergie en infectieuze Ziekten (NIAID), NIH. De auteurs erkennen ook financiële bronnen verstrekt door de NIH, Grants AI042552 en AI029329.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurFisher ChemicalA38S-212
AcetonitrilFisher ChemicalA955-500
Acrylamid:BisacrylamidBioRad1610158
AmmoniumbicarbonaatFisher ChemicalA643-500
AmmoniumpersulfaatSigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag M2 affiniteit gelSigma-AldrichA2220
anti-Flag M2 muis monoklonaal IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mLBio-Rad5000006
B23 muis monoklonaal IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
BroomfenolblauwSigma-AldrichB0126
Carnation vetvrij poedermelkNestleN/A
Cell scraperThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile kolomWaters186003763
Corning 100-mm TC-behandelde kweekschalenFisher Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Estern blotting substraatPierce32106
Ethanol, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
MierenzuurFisher ChemicalA117-50
GelCode blauwe vlek reagensThermoFisher24590
GlycerolFisher Chemical56-81-5
geit-anti-muis IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacetamideACROS Organics122270050
KimWipe delicate taakvegerKimberly Clark Professional34120
L-glutamineGibco25030081
MethanolFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL Polypropyleen conische buisFalcon352097
Voorgekleurde eiwitladder, 10 tot 180 kDaThermo Scientific26616
Protease inhibitor cocktailRoche4693132001
Gezuiverde BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Western blotting membraanRoche3010040001
Natrium PyruvaatGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 detergent oplossingBioRad1610407
Trizaic bronWatersN/A
trypsin-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt G2 massaspectrometerWatersN/A
Whatman filterpapierTisch Scientific10427813

Referenties

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HIV 1 RevRev NoLS mutatiesnucleocytoplasmatisch transportB23 nucleofosminenucleoline C23snoRNA C D box 58Coomassie kleuring

Gerelateerde artikelen