Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Summary

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Abstract

Lymfeklieren (LNs) zijn organen verspreid in het lichaam, waar de aangeboren immuunresponsen verbinding kunnen maken met de adaptieve immuniteit. In feite zijn LNs strategisch geïnterposeerd in het pad van de lymfevaten, waardoor intiem contact van weefsel antigenen met alle ingezeten immuuncellen in de LN mogelijk is. Dus, het begrijpen van de cellulaire samenstelling, distributie, locatie en interactie met behulp van ex vivo hele LN Imaging zal toevoegen aan de kennis over hoe het lichaam coördineert lokale en systemische immuunresponsen. Dit protocol toont een ex-vivo-beeldvormings strategie na een in vivo-toediening van fluorescerende-gelabelde antilichamen die een zeer reproduceerbare en eenvoudig uit te voeren methodologie mogelijk maakt door gebruik te maken van conventionele confocale microscopen en voorraad reagentia. Door subcutane injectie van antilichamen is het mogelijk om verschillende celpopulaties te labelen in drainage LNs zonder de weefselstructuren te beïnvloeden die potentieel kunnen worden aangetast door een conventionele immunofluorescentie microscopie-techniek.

Introduction

Lymfeklieren (LNs) zijn Ovoid-vormige organen wijd aanwezig in het lichaam met de cruciale functie van het overbruggen van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen. LNs filteren de lymfe om vreemde deeltjes en kankercellen te identificeren om een immuunrespons tegen hen te monteren¹. Antigeen cellen (Apc's), T-cellen en B-cellen werken samen om antigeen-specifieke antilichamen (Humorale immuniteit) en cytotoxische lymfocyten (cellulaire immuniteit) te genereren om de vreemde deeltjes en kankercellen²te elimineren. Zo zal het begrijpen van de dynamiek van de immuuncellen die aanwezig zijn in het lymfestelsel belangrijke....

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door het Permanent Comité voor dieren aan de Harvard Medical School en het Brigham and Women's Hospital, protocol 2016N000230.

1. muizen gebruikt voor het experiment

1. Gebruik 8 weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen op de B6 achtergrond voor het toedienen van de antilichaammix.
2. Gebruik CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT muizen om te bepalen of ex vivo hele LN Imaging ook kan worden toegepast op reporter muizen zonder het toedienen van antilichaammix en om de aanwezigheid van mononucleaire cellen te onderzoeken, waaronder antigeen cellen en fagocyten, en hun verdeling in de LN.<....

Results

Dit manuscript toont technieken om inguinale en popliteale lymfeklieren te verwijderen zonder hun structuur te beschadigen na de injectie van fluorescerende-gelabelde antilichamen om specifieke celpopulaties in deze organen te vlekken (Figuur 1 en Figuur 2 ).

De krachtige combinatie van immunolabeling van LN-cellen met BV421 anti-CD4 en BB515 anti-CD19 en confocale beeldvormings analyse definieerde de lokalisatie van T-cellen (CD4 +) .......

Discussion

De combinatie van beeldvorming met andere technieken, waaronder moleculaire biologie en hoog-dimensionale immunophenotypering heeft ons vermogen om immuuncellen in hun inheemse context te onderzoeken, verbeterd. In feite, terwijl andere benaderingen weefsel spijsvertering en celisolatie kunnen vereisen-wat kan leiden tot verlies van weefsel integriteit-het gebruik van in vivo of ex vivo beeldvorming geeft een groot voordeel bij het onderzoeken van verschillende subtypen van cellen in een geografische mode

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	-	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	-	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)