Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Summary

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Abstract

Lymfeklieren (LNs) zijn organen verspreid in het lichaam, waar de aangeboren immuunresponsen verbinding kunnen maken met de adaptieve immuniteit. In feite zijn LNs strategisch geïnterposeerd in het pad van de lymfevaten, waardoor intiem contact van weefsel antigenen met alle ingezeten immuuncellen in de LN mogelijk is. Dus, het begrijpen van de cellulaire samenstelling, distributie, locatie en interactie met behulp van ex vivo hele LN Imaging zal toevoegen aan de kennis over hoe het lichaam coördineert lokale en systemische immuunresponsen. Dit protocol toont een ex-vivo-beeldvormings strategie na een in vivo-toediening van fluorescerende-gelabelde antilichamen die een zeer reproduceerbare en eenvoudig uit te voeren methodologie mogelijk maakt door gebruik te maken van conventionele confocale microscopen en voorraad reagentia. Door subcutane injectie van antilichamen is het mogelijk om verschillende celpopulaties te labelen in drainage LNs zonder de weefselstructuren te beïnvloeden die potentieel kunnen worden aangetast door een conventionele immunofluorescentie microscopie-techniek.

Introduction

Lymfeklieren (LNs) zijn Ovoid-vormige organen wijd aanwezig in het lichaam met de cruciale functie van het overbruggen van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen. LNs filteren de lymfe om vreemde deeltjes en kankercellen te identificeren om een immuunrespons tegen hen te monteren¹. Antigeen cellen (Apc's), T-cellen en B-cellen werken samen om antigeen-specifieke antilichamen (Humorale immuniteit) en cytotoxische lymfocyten (cellulaire immuniteit) te genereren om de vreemde deeltjes en kankercellen²te elimineren. Zo zal het begrijpen van de dynamiek van de immuuncellen die aanwezig zijn in het lymfestelsel belangrijke gevolgen hebben voor de vaccin ontwikkeling en kanker immunotherapie.

De opkomst van krachtige microscopen-inclusief nieuwe confocale en superresolutie microscopen-heeft een buitengewone vooruitgang toegestaan in het begrijpen van hoe verschillende immuuncelpopulaties zich gedragen in hun eigen omgeving³. Het is nu mogelijk om verschillende gelijktijdige celsubtypen te maken met behulp van een combinatie van sondes met genetisch gemodificeerde muizen die fluorescerende eiwitten onder controle van specifieke doelstellingen^4,5uitdrukken. In feite zijn hoge dimensionale technieken, waaronder massa cytometrie en multi-parametrische stromings analyse, van cruciaal belang geweest om onze kennis uit te breiden over verschillende compartimentalisatie en functionaliteit van de immuuncel in de gezondheid en ziekte^{6, 7}. om monsters voor deze technieken voor te bereiden, hebben weefsels echter spijsvertering nodig en worden cellen gescheiden van hun natuurlijke milieu om te worden geanalyseerd in celsuspensies. Om deze beperkingen te overtreffen en een betere vertaling in de biologie mogelijk te maken, is het doel van het hier voorgestelde protocol om een eenvoudige methodologie toe te passen op beeld ex vivo hele lymfeklieren met behulp van voorraden confocale microscopen met het voordeel van verbeterde snelheid, weefsel behoud van de structuur en de levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met de conventionele immunofluorescentie kleuring. Door deze aanpak te gebruiken, konden we aantonen dat muizen deficiënte voor γδ T-cellen, een subtype van T-lymfocyten dat betrokken is bij vroege verdediging van de gastheer tegen pathogenen⁴, follikels en T-celzones hebben aangetast in vergelijking met wild type muizen. Deze bevindingen lieten ons toe om een studie uit te voeren waarin we hebben aangetoond dat de γδ T-cellen een cruciale rol spelen in de homeostase van lymfoïde organen en humorale immuunrespons⁴. Bovendien biedt dit protocol een fysiologisch traject voor sondes en antilichamen om de lymfeklier te bereiken, omdat ze subcutaan worden toegediend en afgevoerd door de weefsel lymfatische circulatie, voortbouwend op eerdere rapporten die in situ labeling werden gebruikt met antilichamen om lymfatische structuren te visualiseren^8,9, Germinal Center^{Dynamics 10,11,12}, en doelen gemakkelijk toegankelijk voor de bloedstroom^{13 ,14,15}.

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door het Permanent Comité voor dieren aan de Harvard Medical School en het Brigham and Women's Hospital, protocol 2016N000230.

1. muizen gebruikt voor het experiment

1. Gebruik 8 weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen op de B6 achtergrond voor het toedienen van de antilichaammix.
2. Gebruik CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT muizen om te bepalen of ex vivo hele LN Imaging ook kan worden toegepast op reporter muizen zonder het toedienen van antilichaammix en om de aanwezigheid van mononucleaire cellen te onderzoeken, waaronder antigeen cellen en fagocyten, en hun verdeling in de LN.
   Opmerking: CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT reporter muizen hebben respectievelijk groene FLUORESCERENDE eiwitten (GFP) en rood FLUORESCERENDE proteïne (RFP) onder de controle van CX3CR1 en CCR2 promotors. Reporter muizen kunnen worden gebruikt met of zonder de injectie van de antilichaammix. Raadpleeg referentie⁴ voor antilichaammix injectie in een reporter muis. Ga verder naar een operatie als er geen antilichaam geïnjecteerd wordt.

2. preparaat en injectie met antilichaammix

Opmerking: Voer deze stappen uit op muizen die worden beschreven in stap 1,1.

1. Verdun 1:10 van Brilliant Violet (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 van briljant blauw (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) en 1:20 van phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) in PBS met het juiste eindvolume om in de binnenste dij te injecteren (om afbeelding inguinale) of in het Paw pad (naar afbeelding popliteal) lymfe.
   Opmerking: gebruik als isotypes: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype-regeling (R35-38; 0,2 mg/mL); PE rat IgG2a, κ Isotype controle (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 rat IgG2a, κ Isotype controle (R35-95; 0,2 mg/mL). Als u het kleurstof antilichaam wijzigt, gebruik dan de juiste Isotype.
2. Voorbeeld inguinale LN, Injecteer 100 μL van de antilichaammix subcutaan in de binnenste dij (Figuur 1a). U ook 50 μL subcutaan van antilichaam mengsel injecteren in het Paw pad naar afbeelding popliteale ln (Figuur 2a). Gebruik delicate 1 mL insuline spuiten, (insuline U-100) met de naald van maat 0,30 mm × 13 mm (30 gauge × 1/2 inch).
   Opmerking: Zorg ervoor dat de injectie voor inguinale LN-kleuring subcutaan is en niet intramusculair (i.m.), aangezien antilichaam mengsel niet goed wordt afgevoerd als i.m. toediening wordt uitgevoerd.
3. Niet verdoken dieren voor antilichaam mengen injectie.
4. Wacht minimaal 3 uur (inguinale dLN) en 12 h (popliteal dLN) na injectie om de organen te verwijderen.
5. Als LN cellabeling niet volledig wordt waargenomen met behulp van grote polymeer fluorescerende kleurstoffen zoals Brilliant Violet of Brilliant Blue, gebruik dan kleinere fluor Foren, waaronder fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), PE en allophycocyanin (APC) als alternatief.

3. chirurgie procedure om de inguinale drainage lymfeklier verwijderen

1. Euthanize muizen met co₂ verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Immobiliseer muizen op het acryl podium met plakband en breng minerale olie met een wattenstaafje aan op de buikhuid om pels depositie rond de incisie te voorkomen (Figuur 1b). Het verwijderen van bont is niet nodig.
3. Voer een middenlijn incisie met behulp van microchirurgie gebogen schaar (11,5 cm) en microchirurgie gebogen Tang (12,5 cm) in de buik van de schaambeen naar de xifoïde proces (figuur 1c).
4. Dissocieren de buikspieren van de huid (figuur 1d).
5. Maak horizontale huid incisies aan de boven-en onderkant van de verticale incisie lijn om huid kleppen te maken aan de kant van de belangstelling (afhankelijk van de zijkant van de antilichaammix injectie) en flap de huid om de lymfeklier te visualiseren (Figuur 1e).
6. Plak de skin-flap op de acrylplaat (Figuur 1f).
7. Verwijder de inguinale drainage lymfeklier met behulp van microchirurgie gebogen Tang (Figuur 1f). Lymfeklier zal verschijnen als een translucid, meestal bilobular, bol onder de huid.

4. chirurgie procedure om de popliteale drainage lymfeklier te verwijderen

1. Euthanize muizen met co₂ verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Immobiliseer muizen op een gevoelige positie op acryl podium met plakband en breng minerale olie met een wattenstaafje in de kuit en knie (Figuur 2a-D).
3. Voer een middenlijn incisie in het kalf van de hiel naar de knie (Figuur 2E, F).
4. Dissociëren de Kalver spier massa van de huid (figuur 2F, G).
5. De popliteale Fossa (figuur 2g) blootstellen. Popliteale lymfeklier zal verschijnen als een translucid Sphere in de popliteale Fossa.
6. Verwijder de lymfeklier van de popliteale met behulp van een microchirurgie gebogen Tang (figuur 2g).
7. Als alternatief, draai de muis over op rugligging positie, en benaderen van de popliteale Fossa tussen biceps musculus femoris en semitendinosus voor de verwijdering van de popliteale LN door het uitvoeren van een middellijn incisie in het kalf van de hiel naar de knie gevolgd door dissociatie van de kalf Musculatuur van de huid.
   Opmerking: Popliteal Fossa is een ondiepe depressie gelegen aan de achterkant van het kniegewricht. Open zorgvuldig om de lymfeklier van de popliteale te zien.

5. voorbereiding van lymfeklieren

1. Plaats het hele orgel in een kweek schaal met glazen bodem (35 mm x 10 mm) en verwijder het vet dat het orgel omringt met behulp van microchirurgie gebogen Tang (Figuur 1G-I en figuur 2H).
2. Centraliseer het orgel in het midden van het gerecht (figuur 1J en afbeelding 2H).
3. Bedek het orgel met een fragment van delicate taak wissers en houd het doorweekt met kamertemperatuur zoutoplossing 0,9% of fosfaat buffer (Figuur 1K-M en figuur 2H).
   Opmerking: het is niet nodig om lymfeklieren te wassen na verwijdering of om de lymfeklier extractie in de afzuigkap uit te voeren.

6. ex-vivo confocale microscopie (beeldvorming)

1. Plaats de Petri schaal in de omgekeerde confocale Microscoop sleuf (figuur 1N en Figuur 2uur).
2. Beeld LNs onder een confocale Microscoop (figuur 1O en afbeelding 2H).
3. Haal eerst de juiste focus door het conventionele licht van de confocale Microscoop te gebruiken met 4x of 10x objectief. Verander dan van de licht functie naar de laser modus.
   Opmerking: als de confocale Microscoop geen 4x-doelstelling bevat, kan de scherpstelling perfect worden verkregen met behulp van de 10x-doelstelling.
4. Pas de laser kracht, offset en Gain aan met behulp van een Isotype-gekleurd, niet-gekleurd of niet-fluorescerende monster (tabel 1) om autofluorescentie en onspecifieke kleuring te verwijderen van fluorescerende-gelabelde antilichamen zoals die gebruikt in de beelden die in dit manuscript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 en PE anti-F4/80).
5. Pas Z -en XY -posities aan met behulp van de Micrometrische en Chariot, respectievelijk, op het gebied van belang in de lymfeklier.
6. Verkrijg afbeeldingen onder 4x, 10x en 20x doelstellingen gericht op de LN structuur en cellulaire distributie. Gebruik 1024 x 1024-pixel definitie.
   Opmerking: Verkrijg minimaal vijf afbeeldingen in verschillende velden per doelstelling per dier.
7. Analyseer afbeeldingen met behulp van een afbeeldings software om kanalen te scheiden, schaal en kleuren van interesse toe te voegen en de 3D-weergave te reconstrueren.

Results

Dit manuscript toont technieken om inguinale en popliteale lymfeklieren te verwijderen zonder hun structuur te beschadigen na de injectie van fluorescerende-gelabelde antilichamen om specifieke celpopulaties in deze organen te vlekken (Figuur 1 en Figuur 2 ).

De krachtige combinatie van immunolabeling van LN-cellen met BV421 anti-CD4 en BB515 anti-CD19 en confocale beeldvormings analyse definieerde de lokalisatie van T-cellen (CD4 +) ...

Discussion

De combinatie van beeldvorming met andere technieken, waaronder moleculaire biologie en hoog-dimensionale immunophenotypering heeft ons vermogen om immuuncellen in hun inheemse context te onderzoeken, verbeterd. In feite, terwijl andere benaderingen weefsel spijsvertering en celisolatie kunnen vereisen-wat kan leiden tot verlies van weefsel integriteit-het gebruik van in vivo of ex vivo beeldvorming geeft een groot voordeel bij het onderzoeken van verschillende subtypen van cellen in een geografische mode

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview kweekschaal	Greiner-Bio	627861	35x10 mm met glazen bodem
Insuline spuit	BD Plastipak	-	Insuline U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	maat 21 x 20 cm / 100 vellen per doos
Gebogen microchirurgie pincet	WEP Surgical Instruments	op bestelling gemaakt	12.5 cm
Gebogen microchirurgie schaar	WEP Surgical Instruments	op bestelling gemaakt	11.5 cm
Naald	BD PrecisionGlide	-	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocale kop	Nikon	-	geladen met de belangrijkste 4 laser lijnen (405, 488, 543 en 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocale microscoop	Zeiss	-	geladen met de belangrijkste 4 laser lijnen (405, 488, 543 en 647 nm)