Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een Orthothematisch endometriumkanker model met Retroperitoneale lymfadenopathie gemaakt van in vivo gepropageerd en gekweekte VX2 cellen

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59340

⸱

12 september 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde methode om te groeien VX2 cellen in de cultuur en om een orthotopic VX2 model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen bij konijnen te creëren. Orthotopic endometriumkanker modellen zijn belangrijk voor de pre-klinische studie van nieuwe beeldvormings modaliteiten voor de diagnose van lymfeklier metastasen.

Samenvatting

Endometriumkanker is de meest voorkomende gynecologic maligniteit in Noord-Amerika en de incidentie stijgt wereldwijd. De behandeling bestaat uit chirurgie met of zonder adjuvante therapie, afhankelijk van de lymfeklier-betrokkenheid zoals bepaald door lymfadenectomie. Lymfadenectomie is een morbide procedure, waarvan niet is aangetoond dat het een therapeutisch voordeel heeft bij veel patiënten, en daarom is een nieuwe methode vereist om lymfeklier metastasen te diagnosticeren. Om nieuwe beeldvormings middelen te testen, is een betrouwbaar model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen nodig. Het VX2 endometriumkanker model is vaak beschreven in de literatuur; Er bestaat echter een aanzienlijke variatie met betrekking tot de methode van model inrichting. Bovendien, geen studies hebben gemeld over het gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken als alleen cellen die zijn gekweekt in vivo eerder zijn gebruikt. Hierin presenteren we een gestandaardiseerde chirurgische methode en post-operatieve bewakingsmethode voor de oprichting van het VX2 endometriumkanker model en rapporteren over het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken.

Inleiding

Endometriumkanker, of kanker van de bekleding van de baarmoeder, is de tweede meest voorkomende gynecologic maligniteit wereldwijd en de meest voorkomende maligniteit in ontwikkelde landen1. De incidentie van endometriumkanker is gestaag toegenomen en stijgt met 2,3% per jaar tussen 2005-2013 en een overeenkomstige toename van 2,2% in sterfte1,2,3. De diagnose van lymfeklier metastasen is van het grootste belang omdat de aanwezigheid van positieve lymfeklieren een sterke negatieve voorspeller is van overleving4,5,6,7 en kan leiden tot de toediening van adjuvante therapie8,9,10,11,12,13. Lymfeklier metastasen worden momenteel gediagnosticeerd door chirurgisch verwijderen van het lymfeweefsel boven de grote bloedvaten in het bekken en de buik. Deze procedure, bekend als een lymfadenectomie, is controversieel als gevolg van conflicterende overlevings gegevens van twee grote proeven14,15,16,17,18 en de bekende risico van intra-operatieve15,19,20 en postoperatieve morbiditeit21,22,23. Aangezien de huidige niet-invasieve beeldvormings modaliteiten niet de vereiste gevoeligheid en specificiteit hebben om lymfeklier dissectie24te vervangen, is er een duw geweest om nieuwe diagnostische beeldvormingstechnieken te ontwikkelen. Om deze nieuwe technieken te testen in een pre-klinische setting, is een betrouwbaar model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen vereist.

Het konijn VX2 tumor model is een gevestigde model dat uitgebreid is gebruikt voor het bestuderen van meerdere menselijke solide orgel tumoren25 met inbegrip van Long26, hoofd ennek 27,28, lever29, nier30, bot31,32, hersenen33, alvleesklier34 en baarmoeder35,36,37. Het VX2 model werd oorspronkelijk ontwikkeld in 1940 door Kidd en Rous38 door het succesvol verplanten van een Cottontail konijn papillomavirus virus ontdekt door shope in 193339. Sinds die tijd is het VX2-model in vivo gehandhaafd, waarbij seriële passage in de quadriceps spier van witte Nieuw-Zeelandse konijnen40nodig is. Meer recent echter, meerdere groepen hebben succesvol gegroeid VX2 cellen in vitro40,41,42 en toonde de behouden tumorigenecity van de gekweekte cellijn lijn31, 42,43. VX2 tumoren zijn histologisch gedefinieerd als anaplastisch plaveiselcel carcinomen44 en bevatten klierweefsel kenmerken die lijken op adenocarcinoom26. Tumoren worden gekenmerkt door het gemak van implantatie, snelle groei en Hyper-vasculariteit44,45 en betrouwbaar metastasize, meestal op regionale en verre lymfeklieren45. Overeenkomsten in de baarmoeder vasculaire en lymfatische anatomie46 evenals de orthotopic groeiplaats zorgen ervoor dat het metastatische patroon van konijn VX2 carcinoom dat van humaan endometriumkanker nabootst, waardoor het VX2 model een betrouwbaar model is voor het bestuderen van menselijke gemetastaseerde ziekte. Bovendien suggereren histologische kenmerken zoals abnormale microvasculaire proliferatie47 , evenals immunologische48 en genetische gelijkenissen49,50 tussen mensen en konijnen dat de tumor micro-omgeving kan weerspiegelen die van humaan endometriumkanker.

Meerdere groepen hebben gerapporteerd over het gebruik van VX2 te maken van een model van endometriumkanker met retroperitoneale metastasen met een hoge gerapporteerde succespercentage36,51,52; Er bestaat echter een aanzienlijke variatie in de huidige literatuur met respect voor de methode van model creatie. Cel schorsing doses zo laag als 4 x 105 cellen/baarmoeder hoorn51 en zo hoog als 5 x 109 cellen/baarmoeder hoorn37,53 zijn gemeld met geen standaard consensus over de vereiste VX2 cellulaire dosis. Ook is er een verscheidenheid aan inoculatie methoden gemeld, waaronder micro-chirurgische implantatie van tumor in de baarmoeder myometrium36, injectie van VX2 celsuspensie37,44,52 , 53 en in sommige gevallen, de toevoeging van baarmoeder hoorn voorafgaand aan de en52. Ten slotte hebben geen groepen het gebruik van gekweekte VX2 cellen gemeld om dit model te maken. Het doel van deze studie is dus om een succesvolle gestandaardiseerde methode van VX2 model creatie te demonstreren en het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen te rapporteren om een model van endometriumkanker met retroperitoneale metastasen in een konijn te creëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Diepe buikwand sluiting: Identificeer de Apex van de peritoneale incisie en pak het peritoneum, rectus spier en fascia met weefsel Tang. Alle dierproeven zijn uitgevoerd in een Animal Resource Center (ARC) goedgekeurde faciliteiten van het universitair gezondheidsnetwerk en in overeenstemming met de goedgekeurde protocollen voor dieren gebruik en zorg (AUP #3994/#4299). VX2 cellijn werd verkregen uit het lab van Dr. Aken in het universitair gezondheidsnetwerk.

1. creatie van in vitro VX2 cellijn

  1. Oogst de VX2 tumor van konijn quadricep spier en groei in muis flank.
    1. Ontdooien bevroren VX2 tumor blokken (1 cm x 1 cm), gehakt op een kweek plaat met behulp van een scalpel blad en stam door een 70 μm filter door kleine hoeveelheden Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) opeenvolgend toe te voegen om ervoor te zorgen dat alle cellen worden gespannen voor een laatste volume van 1 ml.
    2. Tel cellen en Verdun met 0,9% fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een concentratie van 1 x 107/ml en plaats op ijs in een steriele buis.
      Opmerking: tumor blokken werden verkregen uit een laboratorium medewerker uit eerdere vermeerdering van VX2 tumoren in de spieren van de quadriceps van het konijn.
    3. Anesthetiseer een vrouwelijk wit Nieuw-Zeelandse konijn (gewicht 2,5-3,5 kg) met 2-5% geïnhaleerde Isofluraan, verwijder de vacht boven de injectieplaats en reinig de injectieplaats met Povidon-jodiumoplossing. Injecteer 500 μL van de bereide VX2 celsuspensie (5 x 106 cellen/ml) in de spier van de quadriceps van het konijn. Monitor het konijn klinisch voor tumorgroei vanaf dag 10.
    4. Euthanaseren de konijnen na tumoren bereiken 1-1,5 cm in diameter (extern gemeten met remklauwen) met behulp van een door de dierenarts goedgekeurde methode. Bevestig euthanasie door het controleren van vitale functies inclusief hartslag en ademhalingsfrequentie. Accijns de tumor met behulp van steriele instrumenten na het schoonmaken van het gebied met Betadine oplossing.
    5. In een biologische veiligheidskast met behulp van steriele instrumenten, gehakt de tumor in kleine stukjes (0,2 cm) op een 10 cm weefselcultuur schotel met behulp van een scalpel Blade. Geef de tumor fragmenten door een celzeef van 70 μm met 1 mL HBSS zoals beschreven in stap 1.1.1. Tel cellen en Verdun met 0,9% zoutoplossing om 7,5 x 105 cellen in 200 μL te verkrijgen.
    6. Anesthetize mannelijke NOD scid gamma muizen (gewicht 25 g) met behulp van 4% Isofluraan op 1 L/min en anesthesie onderhouden met 2% Isofluraan. Injecteer, zodra de muizen verdoiliseerd zijn, 200 μL van de oplossing van stap 1.1.5 in het subcutane weefsel van de muis flank met een 27 gauge naald.
  2. Oogsten en doorgangen van VX2 cellen in vitro
    1. Controleer xenotransplantaat groei klinisch tweemaal per week totdat tumoren 1 cm in diameter bereiken met behulp van remklauwen.
    2. Euthanaseren muizen door het plaatsen in een co2 kamer of het uitvoeren van cervicale dislocatie na anesthesie met 4% Isofluraan gas. Accijnzen tumoren onder steriele omstandigheden in een biologische veiligheidskast.
    3. Mince tumoren met een scalpel in 1-2 mm stukken in een 6 cm weefselkweek schotel met 3 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/Ham's F12 + 10% foetaal runderserum (FBS) media.
    4. Laat tumor fragmenten ongestoord in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende twee dagen totdat cellen beginnen te groeien uit de tumor stukjes. Controleer vervolgens gecultiveerde platen dagelijks door lichte microscopie voor celconfluentie. Bij het bereiken van 70% confluentie, trypsinize cellen door toevoeging van 1 mL 0,05% trypsine aan de kolf en terug te brengen in de 37 ° c broedplaats voor 5 min.
    5. Neutraliseer trypsine met 6 mL DMEM/Ham's F12 + 10% FBS medium, verzamel cellen en centrifugeer bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 300 x g. Verwijder supernatant en re-Suspend pellet in 3,5 mL van nieuwe DMEM/Ham van F12 + 10% FBS media. Verse zaden 6 cm collageen I gecoate platen met 1,6 x 106 cellen per plaat om ongeveer 50% celseeding dichtheid te bereiken.
      Opmerking: 50% celdichtheid verwijst naar de cellen die 50% van het oppervlak van de plaat innemen als ze zijn bevestigd.
    6. Vroege passage: Herhaal het bovenstaande proces (trypsinizing, seeding) totdat de cellen 5 keer zijn gepasseerde en evalueer vervolgens de zuiverheid van de cellijn met PCR met behulp van een kwantitatieve PCR-test om het konijn genomisch DNA te onderscheiden van muizen genomisch DNA (zie stap 1.3.1-1.3.4).
      Opmerking: na 8 passages kunnen cellen worden vermeerderd op niet-collageen gecoate regelmatig hecht weefselkweek platen.
    7. Passage, trypsinize en Vries aliquots van cellen in DMEM/HAM F12 + 30% FBS + 10% DMSO bij een concentratie van 2 x 106 per injectieflacon. Bewaarcellen in vloeibare stikstof totdat dit nodig is voor experimenten.
  3. Bevestiging van VX2 oorsprong van overlevende cellen:
    1. Maak een standaard kuur van gezuiverde genomische muis en konijn-DNA (stap 1.3.2 en stap 1.3.3). Gebruik primers die soortspecifieke sequenties binnen het tweede open Lees frame van de lijn-1 retrotransposon element.
      Opmerking: primer sequenties voor CRPV E6 zijn: 5 '-GATCCTGGACCCAACCAGTGand 5 '-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. De lijn-1 retrotransposon elementen werden gebruikt. Primer sequenties voor Rabbit LINE-1 zijn: 5 '-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC en 5 '-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT primer sequenties voor muis lijn-1 zijn: 5 '-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG en 5 '-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
    2. Om een standaard curve voor CRPV E6 te maken, zuiveren VX2 tumorcel lysaat (stap 1.1.1) met behulp van een commerciële Kit volgens het Protocol van de fabrikant. Kwantificeer dit DNA met behulp van een commerciële assay. Voer 6 seriële verdunningen uit van 225 PG/μL tot 0,925 PG/μL in een lage EDTA-TE-buffer. Om een standaard curve voor de muis genomisch DNA te maken, Verdun 100 μg commercieel muis genomisch DNA in een lage EDTA-TE buffer in 5 verdunningen van 125 PG/μL tot 0,0125 PG/μL.
    3. Plaats 4 μL van elke verdunde oplossing uit de monsters van stap 1.3.2 in putten en voer monsters uit in een PCR-Thermocycler. Gebruik de CQ-waarden van elke run samen met de DNA-bedragen per well om een standaard curve te berekenen met behulp van de automatische drempel instellingen van de Thermocycler-software.
    4. Gebruik standaard qPCR-procedures om PCR uit te voeren met 40 cycli van 2-stappen fietsen (98 °C en 60 °C) op een Thermocycler. Stel drempelwaarden vast en zet Delta CT-waarden op > 35 om ervoor te zorgen dat er minimale muis verontreiniging is in de VX2 cellijn van Rabbit. Het totale volume van elke reactie was 10 μL, bestaande uit 5 μL van 2x Mastermix, 1 μL forward + reverse primers met de uiteindelijke primer concentratie in reactie op 250 nM en 4 μL DNA-monster.
      Opmerking: Raadpleeg de referenties54,55 voor meer informatie over het uitvoeren van PCR. Drempelwaarden worden vastgesteld en Delta CT-waarden worden ingesteld op > 35 om ervoor te zorgen dat er minimale muis besmetting is in de VX2 cellijn van Rabbit. Het aanbevolen niveau van VX2-DNA voor betrouwbare detectie door qPCR is 1-10 pg.

2. VX2 celcultuur en creatie van celsuspensie

  1. Ontdooien injectieflacons met VX2 cellen (bevroren in stap 1.2.7) in een waterbad van 37 °C gedurende 1 minuut en brengen cellen over naar een conische centrifugebuis met 10 mL kweekmedium (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS en 1% Penicileen-streptomycine). Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 107 x g, gooi het supernatant weg en onderbreek de celpellet in 9 ml media.
  2. Breng opnieuw geschorste cellen over naar een grote kweek kolf. Inincuberen cellen zonder te schudden bij 37 °C. Controleer cellen dagelijks voor samenvloeiing met behulp van lichte microscopie en verander cultuur media om de drie dagen.
  3. Creatie van gekweekte VX2 celsuspensie voor injectie
    1. Trypsinize cellen door toevoeging van 3 mL 0,25% trypsine aan de kolf zodra cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt. Plaats de kolf in een incubator (37 °C) gedurende 5 min. Transfer oplossing naar een conische centrifugebuis en Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 107 x g en verwijder vervolgens supernatant.
    2. Was de celpellets 3 keer met 9 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing, centrifugeer en verwijder supernatant zoals hierboven beschreven. Tel de cellen en Verdun met 0,9% fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een concentratie van 4 x 107 cellen/ml en plaats in een steriele conische centrifugebuis op ijs.
  4. Creatie van in vivo gepropageerde VX2 celsuspensie voor injectie
    1. Ontdooien bevroren VX2 tumor blokken (1 cm x 1 cm), gehakt op een kweek plaat met behulp van een scalpel blad en stam door een 70 μm filter zoals in stap 1.1.1. Voeg kleine hoeveelheden HBSS opeenvolgend toe om ervoor te zorgen dat alle cellen worden gespannen voor een laatste volume van 1 mL. Tel cellen en Verdun met 0,9% fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een concentratie van 1 X107/ml en plaats op ijs in een steriele buis.
      Opmerking: tumor blokken werden verkregen uit een laboratorium medewerker uit eerdere vermeerdering van VX2 tumoren in de spieren van de quadriceps van het konijn.

3. chirurgische model inrichting

  1. Oprichting van chirurgische anesthesie en pre-operatieve voorbereiding
    1. Pre-medicate vrouwelijke witte Nieuw-Zeelandse konijnen (2,5-3,5 kg) 1 uur voorafgaand aan de geplande chirurgische ingreep met behulp van injecties van Acepromazine (1 mg/kg IM) en Meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anesthetiseer een vrouwelijk wit Nieuw-Zeelandse konijn (gewicht 2,5-3,5 kg) met 2-5% geïnhaleerde Isofluraan, verwijder de vacht boven de injectieplaats en reinig de injectieplaats met Povidon-jodiumoplossing.
    2. Intuberen verdoving konijnen met behulp van een laryngeale masker luchtweg (LMA) en veilig in plaats met tape, behoud van diepe anesthesie door het titreren van de geïnhaleerde Isofluraan dosis tussen 2-5%. Monitor chirurgische anesthesie regelmatig gedurende de hele procedure door het controleren van vitale functies (ademhalingsfrequentie, capillaire navulling, zuurstofverzadiging indien beschikbaar) en monitoring voor tekenen die wijzen op pijn (beweging, terugtrekking uit stimuli, geluiden) of licht anesthesie (beweging, kauwen op LMA buis).
      Opmerking: dit moet worden gedaan door iemand met ervaring controle chirurgische anesthesie.
    3. Plaats een 22-gauge oorader katheter in de marginale dorsale ader. Toediening van cefazolin (20 mg/kg) intraveneus 10 min voorafgaand aan de chirurgische huid incisie.
    4. Knip het haar over het bekken en de buik voordat u het konijn op de operatietafel plaatst en plaats de konijnen vervolgens in een rugpositie op de werktafel. Reinig het chirurgische veld met een 3-stappen chirurgische huid voorbereiding (Betadine zeep, chloorhexidine oplossing, Betadine oplossing). Draperen het chirurgische veld met laparotomie gordijnen na het land-markering van de bovenkant van het schaambeen, waardoor een gebied van 5 cm x 5 cm van de onderbuik blootgesteld.
  2. Oprichting van de laparotomie incisie en identificatie van de baarmoeder hoorns
    1. Zet een chirurgische dop en gezichtsmasker. Schrobben van de handen met behulp van chloorhexidine of Betadine chirurgische scrub oplossing. Gebruik steriele techniek, op een steriele jurk en steriele chirurgische handschoenen.
    2. Met behulp van een # 11-Blade scalpel, maken een 2,5 cm lange incisie 1 cm craniale aan de symphyse schaambeen via huid en onderhuidse weefsel van de buik van het konijn. Incise de rectus fascia en ontleden de rectus spieren lateraal om het onderliggende peritoneum bloot. Betreed het peritoneum scherp na te zorgen dat de ondergrond helder is van darm of andere buikorganen.
    3. Zoek de baarmoeder hoorns die de urineblaas identificeren en veeg een gegloeide vinger superiorly, posteriorly en lateraal over de Apex van de blaas.
      Opmerking: indien nodig kan de volledige blaas worden geleegd met behulp van digitale druk. Eenmaal gelegen, breng de baarmoeder hoorns door de buik incisie om te rusten op de buikwand.
    4. Met behulp van een 3-0 gevlochten absorbeerbare hechtdraad, voeren een enkele hechting ligatie van elke baarmoeder hoorn ongeveer 1,5-2,0 cm distale aan de Herde cervices. Plaats de hechtmiddel gewoon mediaal aan de baarmoeder slagaders, die langs het laterale aspect van elke hoorn lopen. Bind de hechtingen strak om de distale baarmoeder hoorns te occluden (Figuur 1).
  3. Myometrial VX2 inoculatie
    1. Injecteer met een naald van 27 gauge 0,5 mL van de eerder bereide VX2 celsuspensie van ofwel stap 2.3.2 (voor gekweekte VX2 model) of 2,4 (voor in vivo VX2 model) in het myometrium van elke baarmoeder hoorn proximale naar de hecht plaats (tussen de hecht plaats en de cervix). Injecteer meer dan 1 minuut en zorg ervoor dat de cellen niet in de onderliggende baarmoederholte worden geïnjecteerd. Anesthetiseer dieren met geïnhaleerde Isofluraan (2-5%) en een verdovings machine met een Bain-circuit.
    2. Breng gedurende 30 sec. na de injectiedruk aan op de injectieplaats myometrial om de lekkage van cellen te minimaliseren. Inspecteer de injectie-en hecht plaatsen voor hemostase en plaats de baarmoeder hoorns terug in de buik.
  4. Het sluiten van de chirurgische incisie
    1. Diepe buikwand sluiting: Identificeer de Apex van de peritoneale incisie en pak het peritoneum, rectus spier en fascia met weefsel Tang.
      1. Om dit te doen, verankeren van de hechting op een toppunt van de incisie door te hechten oppervlakkig tot diep aan de ene kant van de incisie en diep tot oppervlakkig aan de andere. Binden een knoop. Met behulp van de bijgevoegde hechtdraad, maak lopende steken loodrecht op de incisie door de lagen van de buikwand werken stap-verstandig langs de incisie van de zijkant naar de zijkant. Bind de hecht en snijd.
    2. Oppervlakkige buikwand sluiting: Identificeer de Apex van de huid incisie en hecht de buikhuid met behulp van begraven lopende subcuculaire 3-0 absorbeerbare poly-filament hecht. Breng chirurgische lijm aan op de gesloten incisie om de huid randen tegen te gaan.
      1. Om dit te doen, verankeren van de hechting op een toppunt van de incisie, door diep te hechten aan de oppervlakkige aan de ene kant van de incisie en oppervlakkig tot diep op de andere. Binden een knoop. Gebruik de bijgevoegde hechtingen, maak lopende steken in de dermale laag parallel aan de incisie stap-Wise langs de incisie van de zijkant naar de zijkant. Bind de hecht en snijd.
  5. Postoperatieve zorg
    1. Ontwaken uit de anesthesie: Schakel de Isofluraan uit zodra de incisie is gesloten en laat het konijn de zuurstof door het masker ademen tijdens het monitoren op verschijnselen van ontwaken (bijv. spontane bewegingen, oogopening en kauw bewegingen op de luchtweg van het laryngeaal masker). Extubate het konijn zodra deze tekenen worden genoteerd en leveren zuurstof door masker en een warme deken totdat de konijnen alert zijn en in staat om zelfstandig te zitten.
    2. Post-operatieve monitoring: monitor konijnen twee keer per dag gedurende 4 dagen en dagelijks gedurende een extra 10 dagen post-operatief. Om te controleren, hun algemene toestand, hun voedsel-en water inname, urine en fecale output, pijn beoordeling, gewicht, vitale functies (hartslag, ademhalingsfrequentie) en hun chirurgische plaats op zoek naar zwelling, erytheem, afscheiding of dehiscentie te beoordelen.
    3. Postoperatieve pijn controle: toedienen Meloxicam dagelijks (0,2 mg/kg SQ) voor 48 h post-operatief en vervolgens indien nodig op basis van pijn beoordeling. Beheer buprenorfine onmiddellijk na de operatief en elke 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) voor 24 uur en vervolgens indien nodig op basis van de pijn beoordeling
    4. Antibiotica (enrofloxacine 5mg/kg IM) kunnen dagelijks gedurende zeven dagen na het operatief worden toegediend om een wondinfectie te voorkomen, zoals aanbevolen door uw dierenarts. Toedienen van subcutane vloeistoffen (15 mL SQ) tweemaal daags indien nodig voor uitdroging en zacht voedsel of andere voedingssupplementen worden dagelijks verstrekt als nodig is voor gewichtsverlies.

4. tumor groei monitoring

  1. Klinische monitoring: monitor konijnen elke 2 dagen voor klinische tekenen van tumorgroei beginnend op de postoperatieve dag 14. Klinische tekenen van tumorgroei kunnen omvatten verminderde orale inname, lethargie, abdominale tederheid, voelbare abdominale massa en verlies van cecotrofie.
  2. Beeldvorming en invasieve monitoring
    1. CT-beeldvorming: op postoperatieve dag 21-28, pre-medicaat, anesthetize en intuberen konijnen zoals eerder beschreven in 3.1.1-3.1.2. Plaats konijnen in een dorsale positie in een preklinisch CT-scanner en verkrijg beelden van het bekken en de buik na toediening van 10 mL intraveneus iohexol contrastmiddel.
    2. Chirurgische controle: Breng konijnen over naar de operatiekamer na beeldvorming terwijl het nog onder algemene verdoving is. Positie, prep en draperen konijnen zoals eerder beschreven in stap 3.1.4 en voer een herhaalde laparotomie incisie ongeveer 1,5 cm in lengte door de vorige incisie. Identificeer de en de baarmoeder hoorns en zorgvuldig onderzoeken voor tumor. Sluit de incisie en zorg voor postoperatieve verzorging zoals eerder beschreven in stap 3.5.2-3.5.4.
    3. Konijn model gebruik: als konijnen worden gevonden om tumoren te hebben op het moment van chirurgische controle, gebruik konijn endometriumkanker modellen voor geplande experimenten. Gebruik konijnen gemaakt van in vivo gepropageerde cellen voor aanvullende experimenten bij 4 weken na inoculatie en gebruik konijnen modellen gemaakt van gekweekte VX2 cellen bij ongeveer 5-6 weken na inoculatie om rekening te kunnen maken met langzamere tumorgroei. Euthanaseren de konijnen na tumoren bereiken 1-1,5 cm in diameter (extern gemeten met remklauwen) met behulp van een door de dierenarts goedgekeurde methode. Bevestig euthanasie door het controleren van vitale functies inclusief hartslag en ademhalingsfrequentie. Accijns de tumor met behulp van steriele instrumenten na het schoonmaken van het gebied met Betadine oplossing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Achtentwintig konijnen werden gebruikt voor de creatie van het endometriumkanker model. Konijnen hadden een gemiddeld gewicht van 2,83 kg (2.71-3.58 kg) op het moment van het experiment. Baarmoeder tumoren succesvol gegroeid in 21 konijnen voor een algemeen model succespercentage van 75%. Voordat de baarmoeder in het protocol werd opgenomen, bedroeg het slagingspercentage 57% in vergelijking met 81% na toevoeging van baarmoeder-hechten. Baarmoeder hechten werd toegevoegd aan het protocol ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hierin hebben we een gestandaardiseerde chirurgische methode voor de oprichting van een VX2 endometriumkanker model gerapporteerd en gerapporteerd over het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken. De tumor nemen tarief van 75% is lager dan de 100% percentage eerder gerapporteerd in de literatuur35,37,53,56; echter, thw 90% snelheid van pathologisch bevestigde lymfeklier me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door het Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), het Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), het Canadian Cancer Society Research Institute (704718), natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada, Stichting сanada voor innovatie en Prinses Margaret Cancer Foundation.

Ik wil Dr. Marguerite Akens bedanken voor het leveren van de initiële VX2 cellen voor de oprichting van het oorspronkelijke VX2 model en de bevroren VX2 tumor blokken. Ik wil Marco DiGrappa bedanken voor het helpen bij het uitvoeren van initiële VX2 Cell Culture experimenten en Lili ding voor het helpen met VX2 celcultuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
11-bladige scalpel, steriele, wegwerpAspen Surgical (VWR)80094-086
22-gague oorvenenkathaterCDMV14332
3-0 absorbeerbare poly-filamentnaad (Polysorb)Covidien356718
3-0 gevlochten absorbeerbare naad (Polysorb)Covidien356718
70uM celzeef, individueel verpakt, NylonFalcon352350
Acepromazine (Atravet)CDMV1047
Betadine zeep (Poviodone jodium 7,5%)CDMV4363
Betadine oplossing (Poviodone jodium 10%)UHN Stores457955
BuprenorfineMcGill University
CefazolinUHN in-patient pharmacyGeen Cat # Nodig
Chlorhexidine oplossingCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Collageen Type I, 100mm schotelsCorning354450merk niet belangrijk
Corning BioCoatCellware, Collageen Type I, 24-putjes platenCorning354408merk niet belangrijk
Corning BioCoatCellware, Collageen Type I, 6-putjes platenCorning354400merk niet belangrijk
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-vrij, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320merk niet belangrijk
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacine (Baytril injecteerbaar)CDMV11242
Falcon buisCorning Centri-Star430828
Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, Canadese oorsprong, 500mlLife Technologies12483020merk/bron niet belangrijk
IsofluraanUHN in-patient pharmacyGeen Cat # Nodig
Isohexol contrastGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0,5%)CDMV104674
Normale zoutoplossingHouse Brand (UofT Medstore)1011
PBSMulticell of Sigma331-010-CL of D8537-500mL
Penicilline/Streptomycine (100mL; 10000U Penicilline, 10000ug Streptomycine)Corning-CellgroCA45000-652
Steriele Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Fenol Rood)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Jan-11
Chirurgische lijm (weefselkleefstof)3M Vetbond14695B
Trypsine (0,25%), Proteomics GradeSigmaT-6567-5X20UG
Trypsine-EDTA, 0,05%, 100mlWisent Inc325-542-ELmerk niet belangrijk

Referenties

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109(2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49(2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859(2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

VX2 endometriumcarcinoomin vivo gepropageerde celleninjectie in de uterinehoornvestiging van chirurgisch modellymfekliermetastasebereiding van celkweekhistologische analysesteriele chirurgische techniek
Een Orthothematisch endometriumkanker model met Retroperitoneale lymfadenopathie gemaakt van in vivo gepropageerd en gekweekte VX2 cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.