Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Summary

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Abstract

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn een patiëntspecifieke, proliferatieve celbron die zich kan onderscheiden in een somatisch celtype. Bipotente endotheliale voorlopercellen (EPs), die kunnen differentiëren in de celtypen die nodig zijn voor het monteren van volwassen, functionele vasculatuur, zijn afgeleid van zowel embryonale en geïnduceerde pluripotente stammen. Echter, deze cellen zijn niet rigoureus geëvalueerd in driedimensionale omgevingen, en een kwantitatieve maatstaf van hun vasculogenic potentieel blijft ongrijpbaar. Hier worden de generatie en isolatie van iPSC-EPs via TL-geactiveerde celsortering eerst geschetst, gevolgd door een beschrijving van de inkaping en cultuur van iPSC-EPs in collageen hydrogels. Deze extracellulaire matrix (ECM)-nabootsen micro omgeving stimuleert een robuuste vasculogenic reactie; vasculaire netwerken vormen na een week van cultuur. De creatie van een computationele pijpleiding die open-source software gebruikt om deze vasculogene respons te kwantificeren wordt afgebakend. Deze pijplijn is speciaal ontworpen om de 3D-architectuur van de capillaire plexus te behouden om krachtig het aantal vertakkingen, vertakkingspunten en de totale netwerk lengte met minimale gebruikersinvoer te identificeren.

Introduction

Humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs) en andere primaire endotheliale celtypen zijn gebruikt voor het modelleren van bloedvat kiemen en ontwikkeling in vitro¹. Dergelijke vasculaire platformen beloven om te verlichten van de moleculaire en weefsel-niveau mechanismen van hart-en vaatziekten en fysiologische inzicht in de ontwikkeling van primitieve vasculaire netwerken^2,3kunnen presenteren. Hoewel het gebied van vasculaire modellering aanzienlijke vooruitgang heeft gekend, is een "gouden standaard"-assay die de fysiologische vasculaire ontwikkeling kwantitatief kan modelle....

Protocol

1. voorbereiding van cultuur media en coating oplossingen

1. Om de vitronectin-coating oplossing te bereiden, Verdun u vitronectine 1:100 in de fosfaatgebufferde Saline (DPBS) van Dulbecco.
   Let op: eenmaal verdund, wordt het niet aanbevolen om deze oplossing voor toekomstig gebruik op te slaan.
2. Na het ontvangen van fenolrood-vrij, groeifactor-verlaagd gelatine-eiwitmengsel (Zie tabel van de materialen) van de fabrikant, ontdooien op ijs bij 4 °c totdat het mengsel transparant en vloeibaar is. Houd het mengsel op ijs in een laminaire stroom afzuigkap, Pipetteer 75 μL van het mengsel in een micro centrifugebuis van 1,8 mL en Vries on....

Results

Na differentiatie (Figuur 1), FACS en inkaping van IPSC-EPS in collageen hydrogels, zullen de cellen meestal afgerond blijven voor 24 uur voordat ze beginnen te migreren en initiële lumen vormen. Na ongeveer 6 dagen van de cultuur, zal een primitieve capillaire plexus zichtbaar zijn in de hydrogel wanneer bekeken met brightfield microscopie (Figuur 2). Na de beeldvorming van de vaste, bevlekt, met cellen beladen hydrogels op een .......

Discussion

Dit protocol omvat de lange termijn cultuur van cellen in drie soorten celkweek media: E8, LaSR basal en EGM-2. Daarom moet er veel zorg worden besteed aan het adequaat steriliseren van alle materialen. Bovendien moeten labjassen en met ethanol gereinigde handschoenen altijd worden gedragen bij het werken in de laminaire stroom afzuigkap van het laboratorium. Het wordt aanbevolen om regelmatig te testen op Mycoplasma besmetting; Als een grote hoeveelheid vuil wordt waargenomen tijdens de iPSC-cultuur of een plotselinge d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile	Corning	7007	Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	The base media for iPSC-EP differentiation.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture	Fisher Scientific	A8412	To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	To wash monolayer cultures
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011	Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)	Fisher Scientific	356231	Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	VWR	87003-294	Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R&D Systems	293-VE	Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent)	Fisher Scientific	BP337	Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded