Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Samenvatting

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Samenvatting

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn een patiëntspecifieke, proliferatieve celbron die zich kan onderscheiden in een somatisch celtype. Bipotente endotheliale voorlopercellen (EPs), die kunnen differentiëren in de celtypen die nodig zijn voor het monteren van volwassen, functionele vasculatuur, zijn afgeleid van zowel embryonale en geïnduceerde pluripotente stammen. Echter, deze cellen zijn niet rigoureus geëvalueerd in driedimensionale omgevingen, en een kwantitatieve maatstaf van hun vasculogenic potentieel blijft ongrijpbaar. Hier worden de generatie en isolatie van iPSC-EPs via TL-geactiveerde celsortering eerst geschetst, gevolgd door een beschrijving van de inkaping en cultuur van iPSC-EPs in collageen hydrogels. Deze extracellulaire matrix (ECM)-nabootsen micro omgeving stimuleert een robuuste vasculogenic reactie; vasculaire netwerken vormen na een week van cultuur. De creatie van een computationele pijpleiding die open-source software gebruikt om deze vasculogene respons te kwantificeren wordt afgebakend. Deze pijplijn is speciaal ontworpen om de 3D-architectuur van de capillaire plexus te behouden om krachtig het aantal vertakkingen, vertakkingspunten en de totale netwerk lengte met minimale gebruikersinvoer te identificeren.

Inleiding

Humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs) en andere primaire endotheliale celtypen zijn gebruikt voor het modelleren van bloedvat kiemen en ontwikkeling in vitro¹. Dergelijke vasculaire platformen beloven om te verlichten van de moleculaire en weefsel-niveau mechanismen van hart-en vaatziekten en fysiologische inzicht in de ontwikkeling van primitieve vasculaire netwerken^2,3kunnen presenteren. Hoewel het gebied van vasculaire modellering aanzienlijke vooruitgang heeft gekend, is een "gouden standaard"-assay die de fysiologische vasculaire ontwikkeling kwantitatief kan modelleren en beoordelen nog ongrijpbaar. De meeste gepubliceerde protocollen kunnen de vasculaire niche niet adequaat recapituleren om de vorming van volwassen, functionele bloedvaten aan te moedigen of hebben geen methode om het vasculogene potentieel van de beoordeelde celtypen in drie dimensies te vergelijken ( 3D).

Veel huidige vasculaire modellen zijn beperkt in hun vermogen om na te bootsen de fysiologische vasculaire niche. Een van de meest gebruikte in vitro platforms is de geleiachtige eiwitmengsel-gebaseerde buis vorming assay. In het kort worden HUVECs als enkelvoudige cellen op een dun laagje gel, dat bestaat uit eiwitten die zijn geoogst uit de muriene Sarcoom extracellulaire matrix (ECM); binnen een tot twee dagen, de HUVECs zelf-assembleren in primitieve buizen⁴. Dit proces vindt echter plaats in twee dimensies (2D) en de endotheliale cellen (ECs) die in deze test worden gebruikt, vormen geen ingesloten, holle lumen, waardoor de fysiologische betekenis van deze onderzoeken wordt beperkt. Meer recentelijk zijn ECs en ondersteunende cellen (bijv. mesenchymale stamcellen (MSCs) en pericytes) gecocultureerd in 3D-Micro omgevingen die de vezelachtige architectuur van de inheemse ECM simuleren, zoals collageen of fibrine hydrogels⁵. Voor het model van vasculaire ontwikkeling in deze micro-omgeving, polymere kralen bekleed met ECs worden meestal gebruikt⁶. De toevoeging van exogene groeifactoren en/of groeifactoren afgescheiden door andere cellen interstitially ingebed in de hydrogel kan de ECs induceren, coating van de polymere kralen, ontkiemen en vormen van enkelvoudig lumen; het aantal en de diameter van kiemgroenten en vaten kunnen vervolgens worden berekend. Echter, deze spruiten zijn enkelvoud en vormen geen gesloten, verbonden netwerk zoals wordt gezien in fysiologische omstandigheden en dus meer doet denken aan een tumor therapieën model. Microfluïdische apparaten zijn ook gebruikt om de vasculaire niche na te bootsen en om de vorming van vasculatuur in EC-beladen hydrogels^7,8te bevorderen. Typisch wordt een angiogene groeifactor-gradiënt toegepast op het circulerende celkweekmedium om de migratie van de EG en het kiemen te induceren. ECs die het lumen van de ontwikkelde schepen vormen zijn gevoelig voor de shear stress geïnduceerd door de toepassing van vloeistof stroom door het microfluïdische apparaat; Dus, deze microfluïdische apparaten vastleggen belangrijke fysiologische parameters die niet toegankelijk zijn in de statische modellen. Echter, deze apparaten vereisen dure microfabricage capaciteiten.

Belangrijker nog, alle drie vasculaire modellen (2D, 3D, microfluidic) overweldigend gebruik van primaire ECs en primaire ondersteunende celtypen. Primaire cellen kunnen niet worden ontwikkeld tot een effectieve cardiovasculaire therapie omdat de cellen een immuunrespons bij implantatie zouden hebben; Bovendien zijn HUVECs en soortgelijke primaire celtypen niet patiëntspecifiek en vangen ze geen vasculaire afwijkingen op die optreden bij patiënten met een genetische dispositie of reeds bestaande veterinairrechtelijke voorschriften, bijvoorbeeld diabetes mellitus. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn in het afgelopen decennium ontstaan als een patiëntspecifieke, proliferatieve celbron die kan worden gedifferentieerd in alle somatische cellen in het menselijk lichaam⁹. In het bijzonder zijn er protocollen gepubliceerd die de opwekking en isolatie van door iPSC afgeleide endotheelprogenitoren (iPSC-EPs)^10,11beschrijven; iPSC-EPs zijn bipotent en kunnen daarom verder worden gedifferentieerd in endotheliale cellen en gladde spiercellen/pericytes, de bouwstenen van volwassen, functionele vasculatuur. Slechts één studie heeft overtuigend gedetailleerd de ontwikkeling van een primaire capillaire plexus van iPSC-EPs in een 3D-Micro-omgeving¹²; Hoewel deze studie van cruciaal belang is voor een goed begrip van iPSC-EP-assemblage en differentiatie in natuurlijke en synthetische hydrogels, vergelijkt het de netwerktopologieën van de resulterende vasculatuur niet kwantitatief. Een andere recente studie heeft het polymere kraal model gebruikt om het ontkiemen van HUVECs en iPSC-afgeleide ECs⁵te vergelijken. Daarom is er een duidelijke noodzaak om de fysische en chemische signalerings mechanismen die iPSC-EP-vasculogenese in 3D-Micro-omgevingen reguleren, verder te verhelderden en om te bepalen of deze cellen geschikt zijn voor ischemische therapie en cardiovasculaire aandoeningen Modeling.

In het afgelopen decennium, verschillende open-source computationele pijpleidingen en skeletonisatie algoritmen zijn ontwikkeld om te kwantificeren en vergelijk vasculaire netwerk lengte en connectiviteit. Bijvoorbeeld, charwat et al. ontwikkelde een op Photoshop gebaseerde pijplijn om een gefilterd, gebinariseerd beeld van vasculaire netwerken te extraheren, afgeleid van een co-cultuur van door de vetweefsel afgeleide stamcellen en uitgroei ECs in een fibrinematrix^13,14. Misschien wel de meest gebruikte topologie vergelijking tool is angio tool, een programma online gepubliceerd door de National Cancer Institute¹⁵; Ondanks de wijdverbreide adoptie en goed gedocumenteerde getrouwheid van het programma, is het programma beperkt tot het analyseren van bloedvat achtige structuren in twee dimensies en andere Programma's, waaronder AngioSys en Wimasis, met dezelfde dimensionaliteits beperking¹⁶. Krachtige software suites zoals Imaris, Lucis en Metamorph zijn ontwikkeld om de netwerktopologie van engineered microvasculature te analyseren; Deze suites zijn echter kostenbelemmerend voor de meeste academische laboratoria en beperken de toegang tot de broncode, wat het vermogen van de eindgebruiker om het algoritme aan te passen aan hun specifieke toepassing kan belemmeren. 3D slicer, een open-source magnetische resonantie imaging/computertomografie pakket, bevat een vasculaire Modeling Toolkit die effectief kan analyseren van de topologie van 3D vasculaire netwerken¹⁷; de analyse is echter afhankelijk van de gebruiker die de eindpunten van het netwerk handmatig plaatst, wat vervelend kan worden bij het analyseren van een grote gegevensset en kan worden beïnvloed door onbewuste biases van de gebruiker. In dit manuscript wordt een computationele pijplijn die 3D-vasculaire netwerken kan kwantificeren in detail beschreven. Om de bovengenoemde beperkingen te overwinnen, gebruikt deze open source computationele pijplijn ImageJ voor het vooraf verwerken van confocale afbeeldingen om het 3D-volume in een skelet analysator te laden. De Skeleton Analyzer gebruikt een parallel mediale Axis dunner wordend-algoritme en werd oorspronkelijk ontwikkeld door kerschnitzki et al. om de lengte en connectiviteit van osteocyte netwerken te analyseren¹⁸; Dit algoritme kan effectief worden toegepast om de lengte en connectiviteit van engineered microvasculature te karakteriseren.

In totaal schetst dit protocol de creatie van microvasculaire netwerken in 3D-Micro-omgevingen en biedt het een open-source en User-bias gratis computationele pijplijn om het vasculogenic potentieel van iPSC-EPs gemakkelijk te vergelijken.

Protocol

1. voorbereiding van cultuur media en coating oplossingen

1. Om de vitronectin-coating oplossing te bereiden, Verdun u vitronectine 1:100 in de fosfaatgebufferde Saline (DPBS) van Dulbecco.
   Let op: eenmaal verdund, wordt het niet aanbevolen om deze oplossing voor toekomstig gebruik op te slaan.
2. Na het ontvangen van fenolrood-vrij, groeifactor-verlaagd gelatine-eiwitmengsel (Zie tabel van de materialen) van de fabrikant, ontdooien op ijs bij 4 °c totdat het mengsel transparant en vloeibaar is. Houd het mengsel op ijs in een laminaire stroom afzuigkap, Pipetteer 75 μL van het mengsel in een micro centrifugebuis van 1,8 mL en Vries onmiddellijk bij-20 °C. Deze aliquots kunnen maximaal één jaar bewaard worden.
   Let op: dit gelatineuze eiwitmengsel wordt zeer visceus wanneer het op kamertemperatuur wordt gehouden en zal stollen bij hogere temperaturen. Houd deze oplossing ijskoud.
3. Om dit mengsel voor te bereiden op coating, ontdooit u een 75 μL aliquot op ijs en verdunnen met 6 mL ijskoude Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium: nutriënten mengsel F-12 (DMEM/F12). Dit voorbereide volume is genoeg om een 12 goed plaat te kapen.
4. Bereid een 100 mg/mL stamoplossing van ascorbinezuur magnesium-2-fosfaat (een wit gelyofiliseerd poeder) in ultrapuur water door 500 mg poeder toe te voegen aan 5 mL water in een 10 mL glazen Scintillatie flacon. Agitate met een roerstaaf totdat de oplossing volledig transparant is (dit kan een uur duren). Deze oplossing kan maximaal één jaar bij-20 °C worden bewaard.
5. Maak een 10 mM kolf van CHIR99021 (CHIR) door 10 mg gelyofiliseerd poeder op te lossen in 1,9928 mL dimethylsulfoxide (DMSO) in een conische centrifugebuis van 15 mL en warm in een 37 °C kraal (of water) bad totdat de oplossing transparant is. In 1,8 mL micro centrifugebuizen en bewaar bij-20 °C gedurende maximaal één jaar.
6. Maak een 10 mM voorraad Y-27632, een ROTSREMMER (ROCKi), door 10 mg gelyofiliseerd poeder op te lossen in 3,1225 mL dimethylsulfoxide (DMSO) in een conische centrifugebuis van 15 mL en warm in een 37 °C kraal (of water) bad totdat de oplossing transparant is. In 1,8 mL micro centrifugebuizen en bewaar bij-20 °C gedurende maximaal één jaar.
7. Om essentiële 8 (E8) medium te bereiden, ontdooit diepvries supplementen, voeg toe aan de 500 mL fles van het basale medium en filter steriliseren. Deze oplossing kan gedurende maximaal twee weken bij 4 °C worden bewaard.
   Let op: het is erg belangrijk om dit medium niet te verwarmen bij 37 °C, omdat de eiwitten in de medium formule bij langdurig gebruik kunnen afnemen. Bewaar dit medium in plaats daarvan 15 tot 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur.
8. Om de sorteer buffer voor te bereiden, voegt u 1,33 mL 7,5% bovien serumalbumine (BSA) toe in DPBS en 200 μL 0,5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) tot 48,5 mL DPBS om een uiteindelijke oplossing van 0,5% BSA en 2 mM EDTA te creëren.
9. Om LaSR basal voor te bereiden, voeg 300 μL 100 mg/mL ascorbinezuur magnesium-2-fosfaat en 5 mL GlutaMAX toe aan 500 mL Advanced DMEM/F12. Deze oplossing kan maximaal één maand bij 4 °C worden bewaard.
10. Voor het bereiden van endotheliale celgroei medium-2 (EGM-2), ontdooien supplementen en toevoegen aan 500 ml fles van basale medium. Deze oplossing kan maximaal één maand bij 4 °C worden bewaard.
11. Om de blokkerende buffer voor te bereiden, voeg 500 mg gelyofiliseerd boviene serumalbumine (BSA) en 50 μL van een emulgerende reagens (Zie tabel met materialen) toe aan 48 ml dpbs. Incuberen bij 37 °C gedurende ten minste 15 minuten om ervoor te zorgen dat de BSA niet klontert en vervolgens van de oplossing gescheiden wordt.

2. ontdooien, onderhoud en doorgang van iPSCs

1. Voor het ontdooien van een cryopreserved iPSC injectieflacon, een enkele put van een 6-put plaat met 1 mL vitronectin oplossing (bereid zoals beschreven in stap 1,1). Incuberen voor één h bij kamertemperatuur. Laat deze coating lucht niet drogen voordat u het E8 medium aan de plaat toevoegt.
2. Om iPSCs te ontdooien, haalt u een cryopreserved injectieflacon iPSCs op uit de vloeibare stikstof opslagcontainer en ontdooit bij 37 °C tot een klein kristal ijs overblijft. Voorzichtig (dropwise) Breng de inhoud van de ontdooide injectieflacon over in een conische centrifugebuis van 15 mL die 8 mL ijskoude DMEM/F12 bevat. Was de ontdooide injectieflacon met een toevoeging van 1 mL ijskoude DMEM/F12 om celverlies te minimaliseren. Centrifugeer 5 min bij 300 x g.
3. Tijdens het wachten op de centrifuge, aspireren de vitronectine oplossing en voeg 1 mL E8 medium (bereid zoals beschreven in stap 1,6) aan de put. Vervolgens verwijdert u de DMEM/F12 supernatant uit de gecentrifugeerde conische buis en resuspendeer de pellet in 1 mL E8 medium. Breng de cellen over naar de nieuw gecoate plaat en zorg ervoor dat de suspensie wordt geagituficeerd om te voorkomen dat de kolonies klonteren bij het zaaien.
4. Er is meestal een aanzienlijke celdood na ontdooien. De volgende ochtend, verwijder het medium en vervang het door Fresh E8 medium.
   Opmerking: zelfs onder optimale omstandigheden hebben iPSCs de neiging om slecht te herstellen van cryopreservation. Het wordt aanbevolen om te invriezen een near-Confluent 6-well voor toekomstige zaaien in een enkele 6-put. Aanwezigheid van celpuin is normaal voor de eerste 2-3 dagen tijdens het herstel van cellen.
5. Vervang E8 medium dagelijks tot de cellen klaar zijn voor de passage (70% – 80% confluentie).
6. Om door te gaan, moet u eerst vitronectine-gecoate putjes bereiden (zoals beschreven in stap 2,1).
   1. Zodra vitronectin-gecoate putten klaar zijn (ongeveer 1 uur), aspiraat E8 medium van goed om te worden door de gang en was tweemaal met 1 ml dpbs. Inincuberen met 1 mL 0,5 mM EDTA gedurende 5 – 7 minuten bij 37 °C. Verwijder de vitronectin-oplossing uit de nieuw gecoate put en vervang deze door 1 – 2 mL E8 medium.
   2. Verwijder de EDTA-oplossing uit de putjes om door te gaan en ontkoppel de kolonies door een of twee keer zachtjes te wassen met 1 mL E8. Breng 75-200 μL celsuspensie over in de vers gecoate E8-bevattende putjes, roer de plaat om gelijkmatige dekking te garanderen en plaats onmiddellijk in de incubator.
      Let op: de incubatietijd voor het detachement van iPSC is afhankelijk van de cellijn; het wordt aanbevolen dat de gebruiker van dit protocol een aantal keren test wanneer een ontvangen/gegenereerde iPSC-lijn voldoende wordt uitgebreid. 75 μL celsuspensie resulteert in het algemeen in 4 dagen tussen de passages; 150 μL of meer leidt tot 2 – 3 dagen tussen de passages.

3. generatie van door iPSC afkomstige endotheliale voor ouders (Figuur 1).

1. Zorg er bij het behoud van iPSCs voor dat de kolonies goed zijn gecomprimeerd en dat er een laag aantal gedifferentieerde cellen in de cultuur is. Als de kolonies elkaar beginnen te contacteren, zijn de cellen hoogstwaarschijnlijk te Confluent Health en moeten ze onmiddellijk worden gepaserd.
2. Wanneer iPSCs 70% – 80% Confluent zijn, Coat een 24-put plaat met het gelatineuze eiwitmengsel (bereid zoals beschreven in 1.2/1.3). Pipetteer 250 μL van dit mengsel in elke put en houd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. Verwijder tijdens de 1-h-incubatie het E8-medium en de Y-27632 uit de koelkast en de vriezer, respectievelijk. Zodra E8 medium en Y-27632 op kamertemperatuur komen, bereidt u E8 + ROCKi voor door 13 μL 10 μM Y-27632 toe te voegen aan 13 mL E8 in een conische centrifugebuis van 15 mL.
4. Verwijder het E8-medium uit de iPSC-putjes, spoel tweemaal met 1 mL DPBS en bebroed vervolgens met 0,5 mM EDTA voor 5-7 min bij 37 °C. Verwijder na de incubatieperiode de EDTA en schuif de cellen snel in een eencellige suspensie met een P1000 pipetpunt met 1 mL E8 + ROCKi-medium.
5. Tel de cellen met een hemocytometer. Voor een suspensie die miljoenen iPSCs kan bevatten, voegt u 20 μL celsuspensie toe aan 180 μL trypaan blauw. Bepaal het aantal totale cellen in de eencellige suspensie.
6. Breng 0,432 x 10⁶ tot 1,296 x 10⁶ cellen (10⁴ tot 3 x 10⁴ cellen/cm²) over op de resterende E8 + rocki medium. Verwijder de gelatineuze mengsel coating van de nieuw gecoate 12-well plaat en voeg 500 μL celsuspensie toe aan elk goed, zodat de cellen goed verdeeld zijn en geen kleine klonters vormen.
   Opmerking: dit bereik van dichtheden is optimaal voor differentiatie van CD34 positieve cellen; deze zaaien dichtheden zijn echter afhankelijk van de cel en moeten mogelijk worden geoptimaliseerd door de gebruiker van dit protocol.
7. Na 24 uur cultuur, vervang medium door 500 μL vers E8 medium. Incuberen voor een extra 24 uur onder dezelfde omstandigheden.
8. Verwijder de E8 medium en vervang met LaSR basal aangevuld met 6-12 μM van CHIR99021. Dit tijdpunt wordt gedefinieerd als D0 van differentiatie. Na 24 h van cultuur, vervangen door hetzelfde celkweekmedium.
   Opmerking: zoals eerder beschreven, is de hoeveelheid CHIR99021 toegevoegd aan dit medium afhankelijk van de iPSC-lijn die wordt gebruikt. Test een reeks CHIR99021 concentraties om optimale resultaten te garanderen.
9. Na 48 h incubatie met CHIR99021, vervangen door 1 mL LaSR basal.
10. Vervang het medium dagelijks met 2 mL LaSR basal voor 2-3 extra dagen. Op dit moment (D5 van differentiatie), een aanzienlijk deel van deze cellen zal CD34 uitdrukken en kan worden gekarakteriseerd als endotheliale voor ouders. Een schematische voorstelling van dit protocol wordt geschetst met representatieve resultaten in Figuur 1 en volledig beschreven door de onderzoekers die deze methode voor het eerst hebben gepubliceerd ^11,19.
    Opmerking: deze endotheliale voor ouders kunnen verder worden gedifferentieerd langs een endotheliale afstamming (35% – 99%) of een gladde spier afstamming (1% – 65%). De efficiëntie van de differentiatie varieert afhankelijk van het type ECM-coating en het celkweekmedium dat wordt gebruikt bij differentiatie ²⁰.

4. FACS van endotheelprogenitors

1. Voordat u de D5/D6 gedifferentieerde cellen dissocieert, bereidt u de sorteer buffer voor zoals beschreven in stap 1,8 en blijft u op ijs.
2. Inbroed de gedifferentieerde cellen met 250 μL celloslating oplossing per put (Zie tabel van de materialen) gedurende 10 min bij 37 °c.
3. Dissociëren van de cellen met een P1000 pipetpunt in een enkele cel suspensie in cel loslating oplossing. Consolideer het mengsel van celcelcellen in een conische centrifugebuis van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
4. Verwijder de supernatant en respendeer in 200 μL ijskoude Sorteer buffer (bereid zoals beschreven in stap 1,7. Voeg 5 μL van het geconcentreerde CD34-PE-antilichaam toe aan de cel-Sorteer buffer suspensie en inincuberen gedurende 10 minuten bij 4 °C.
5. Resuspendeer in 5 mL ijskoude Sorteer buffer. Filtreer deze suspensie door een celzeef met een dop van 40 μm voordat u deze op de sorteerder plaatst.
6. Sorteer op het geschikte fluorescerende kanaal 10.000 cellen die niet zijn gelabeld met een fluorescerende antilichaam. Poort een regio met een hoge fluorescentie intensiteit die geen van deze 10.000 cellen bevat (figuur 1d). Dit zal dienen als een negatieve controle.
7. Voer het monster met iPSC-EPs met een fluorescerende oplossing en begin het soort. CD34 wordt sterk uitgedrukt in deze endotheliale voor ouders en is gemakkelijk gescheiden van de belangrijkste populatie. Breng na het sorteren de oplossing over in een conische centrifugebuis van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g. Verwijder het supernatant.
   Opmerking: als de oplossing in een buis groter is dan een microcentrifuge buis (bijv. een 5 mL polystyreen buis die gewoonlijk in veel FACs protocollen wordt gebruikt), moet u de gesorteerde celpellet opnieuw opschorten in 1 mL van de sorteer buffer en deze oplossing overbrengen naar een micro centrifugebuis. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
   1. Optioneel: als verdere karakterisering van de iPSC-EP gewenst is, voeg dan andere primaire antilichamen (bijv. CD31-APC) gelijktijdig toe met CD34-PE. Zorg ervoor dat Overspraak tussen verschillende fluorescerende kanalen wordt geminimaliseerd.

5. inkaping en lange termijn cultuur van iPSC-EP-beladen collageen hydrogels

1. Bereid het zaai medium voor door 40 μL van 10x medium 199 toe te voegen aan 400 μL endotheliale groeimedium (EGM-2) aangevuld met 10 μM Y-27632 in een 1,8 mL micro centrifuge en plaats de buis op het ijs.
   Opmerking: Hoewel het gebruik van antibiotica wordt afgeraden voor stamcel kweek en het onderhoud van gedifferentieerde cellen, wordt het doseren met pen/STREP aanbevolen na het sorteren, omdat het moeilijk is om de steriliteit in de sorteer omgeving te garanderen (dit is meer noodzakelijk als de sorteerder wordt gedeeld onder vele laboratoria).
2. Verwijder alle supernatant uit de celsuspensie en voeg 200 μL EGM-2 toe, aangevuld met 10 μM Y-27632. Breng de celsuspensie over naar het zaai medium en meng krachtig.
3. Voeg 350 μL collageen toe aan de oplossing die in stap 5,2 is bereid en meng goed. De oplossing zal licht geel worden.
   Opmerking: de uiteindelijke concentratie van collageen kan een aanzienlijke invloed hebben op de vorming van de capillaire plexus. Dit protocol gaat ervan uit dat het collageen is geleverd met 10 mg/mL en dat de hydrogels een eindconcentratie hebben van 3,5 mg/mL. Pas deze volumes aan om hun uiteindelijke collageen concentratie te bereiken; het wordt aanbevolen om de uiteindelijke collageen concentratie te beperken van 2 mg/mL tot 4 mg/mL.
4. Voeg 5 μL 1M NaOH toe aan de oplossing die in 5,3 is bereid en meng goed, Vermijd de introductie van luchtbellen. De oplossing zal helder roze worden.
5. Pipetteer 56 μL van geneutraliseerde collageen-celoplossing, bereid in 5,4 in individuele putjes van een 96-goed Ultra-Low bijlage U-bottom celkweek plaat. Incuberen bij 37 °C gedurende 30 minuten. Controleer voordat u media toevoegt of de cellen gelijkmatig zijn verdeeld door de monsters met een brightfield-Microscoop te onderzoeken.
6. Bereid 1 mL kweekmedium dat bestaat uit EGM-2 aangevuld met 10 μM Y-27632 en 50 ng/mL vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) door 1 μL van elke stamoplossing toe te voegen aan een micro centrifugebuis. Pipetteer na goed mengen 100 μL van dit celkweekmedium op de met cellen beladen hydrogels. Breng de plaat over naar 37 °C voor de lange termijn cultuur.
7. Vervang het kweekmedium dagelijks door extra angiogene groeifactoren of kleine molecuul remmers toe te voegen, zoals bepaald door het doel van het onderzoek. Om de media optimaal te verwijderen, kantel je de plaat en gebruik je een P100 tip om medium zachtjes te zuigen zonder de hydrogel te storen.

6. vaststelling, immunokleuring en visualisatie van op EP gebaseerde vasculaire netwerken

1. Voeg na één week cultuur 250 μL 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing toe aan een 48-well plaat. Vul zoveel putten als er hydrogels zijn. Verwijder het medium uit de hydrogels (PFA) en gebruik fijngetipte pincet om de hydrogels over te brengen naar PFA met putjes. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de PFA door snel te wassen met PBS.
2. Permeabilize door toevoeging van 250 μL van 0,5% van een nonionische oppervlakteactieve stof (Zie tabel met materialen) gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Was tweemaal met 250 μL PBS aangevuld met 300 mM Glycine. Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten voor elke wasstap om de verwijdering van overtollig reinigingsmiddel te garanderen. Blokkeren door de hydrogels in te dompelen in 250 μL blokkerende buffer gedurende 30 min.
3. Inincuberen met de gewenste primaire antilichamen die in de blokkerende buffer 's nachts bij 4 °C zijn verdund. Bijvoorbeeld, als immunokleuring met phalloidin en VE-cadherin, respectievelijk verdunnen 1:40 en 1:200, in blokkerende buffer.
4. De volgende dag, verwijder de primaire antilichaam oplossing en was tweemaal met 0,5% emulgerende reagens in DPBS. Bedek met aluminiumfolie en inincuberen met een soortspecifiek secundair antilichaam (bijv. 1:200 Alexa Fluor 488 in PBS) voor 2 uur bij kamertemperatuur.
5. Verwijder de secundaire antilichaam oplossing en was tweemaal met 0,5% emulgerende reagens in DPBS. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten voor elke wasstap om de verwijdering van vrije fluor te garanderen.
6. Om celkernen te visualiseren, Verdun 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:10000 in PBS en voeg toe aan het monster (s).
   1. Inbroed gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en was tweemaal met PBS. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten voor elke wasstap om de verwijdering van vrije fluor te garanderen.
7. Breng de monsters over naar een angiogenese μ-Slide of een glazen bodem petrischaaltje met een pincet met fijne tipped. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevangen onder de hydrogel.
8. Beeld op een confocale Microscoop door het verwerven van z-stacks die zich uitstrekken van de onderkant tot de bovenkant van het monster. Zorg ervoor dat de detector niet verzadigd is en dat de laagst beschikbare vergroting in gebruik is (een groot gezichtsveld is wenselijk).
   Opmerking: zorg er voor toekomstige verwerking voor dat de z-stacks met minimale compressie (bijv. czi) worden opgeslagen.

7. de computationele pijplijn gebruiken om vasculaire netwerktopologieën te analyseren en te vergelijken

1. Inspecteer elke z-stack om ervoor te zorgen dat segmenten alleen vaten bevatten. Open de z-stack in ImageJ en verbeter het contrast door op afbeelding te klikken ≫ > helderheid/contrast aan te passen . De grenzen van het vaartuig zijn nu duidelijk afgebakend en het achtergrondniveau wordt geminimaliseerd. Vaak komt de z-afmeting niet overeen met de x/y-afmetingen. Als u dit wilt verhelpen, klikt u op afbeelding ≫ ≫ grootte aanpassen en het aantal z-segmenten wijzigen zodat de afstand tussen elk segment gelijk is aan één pixel in x/y. imagej zal automatisch interpoleren. Als deze stap niet naar behoren wordt uitgevoerd, worden de uiteindelijke 3D-volumes gecomprimeerd weergegeven.
   Let op: ECs zal migreren naar de randen van de gel en zal kleine kasseien kolonies vormen. Hoewel deze nuttig zijn om de grenzen van de hydrogel te schatten, zullen ze de uiteindelijke beeldanalyse verstoren en moeten ze worden verwijderd.
   Opmerking: ImageJ is een op Java gebaseerde open-source beeldanalyse software ontwikkeld in overleg door de National Institutes of Health en het laboratorium voor optische en computationele instrumentatie. Het wordt aanbevolen om Fiji te downloaden, dat is gewoon ImageJ gebundeld met nuttige plugins (https://fiji.sc/).
2. Vervaag in ImageJ de afbeelding in 3-dimensies Klik op proces > filters ≫ Gaussiaanse vervaging 3D en vervolgens de Sigma-waarden in alle 3-dimensies in te stellen op 2,0 (deze waarde moet mogelijk worden aangepast door de eindgebruiker).
3. Klik in ImageJ op proces > binaire > binaire bestanden maken en selecteer vervolgens een geschikte drempel voor het algoritme. De cross-entropie drempelmethode algoritme ontwikkeld door Li et al. is effectief in het scheiden van schepen van de achtergrond²¹. Bereken de drempel voor elke afbeelding en stel de achtergrond in op "default".
4. In ImageJ verwijdert u valse ruis en vult u "gaten" in lumen in door te klikken op proces > ruis > Verwijder uitschieters.
   Opmerking: het verwijderen van "heldere" uitschieters zal kleine gaten in aangesloten vaten vullen; Als u "donkere" uitschieters verwijdert, worden dode cellen verwijderd. De grootte van de verwijderings RADIUS varieert afhankelijk van de vergroting en grootte van de schepen. Voor afbeeldingen die zijn verkregen met een breed-veld doelstelling van 512 x 512 pixels, zal de radii meestal variëren van 4-6 pixels.
5. Verwerk alle RAW-bestanden (bijvoorbeeld czi-extensie) en converteer ze naar. TIF-bestanden voordat u doorgaat naar stap 7,6. Om in deze verwerking te helpen, is een ImageJ-script, "Binarize en filter. IJM" aan dit manuscript gehecht.
6. Sla de verwerkte. TIF-bestanden op in dezelfde map als het bestand ' BatchProcessSkeleton. m ', dat u in het manuscript wilt downloaden. Dit script, ontwikkeld door de auteurs, noemt de functies gepubliceerd door Phillip Kollmannsberger²² en voert een aantal extra bestands manipulatie uit.
7. Download en unzip alle bestanden in verband met de twee belangrijkste functies "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) en "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Alle functies opslaan in dezelfde map als de geopende verwerkte z-stack.
8. Open een multi-paradigma numerieke computeromgeving (Zie tabel met materialen) en navigeer naar de map waar alle hierboven beschreven bestanden zijn opgeslagen.
9. Voer "BatchProcessSkeleton. m" ofwel door te typen batchprocessskeleton in het opdrachtvenster of door het openen van het script en het raken van de lopen knop (rechts gerichte groene pijl) in de editor.
   Opmerking: als u een grote gegevensset wilt analyseren met één opdracht, moet u ervoor zorgen dat de tekenreeks binnen de functie dir in regel 6 een sterretje (bijvoorbeeld ' *. TIF ') bevat. Anders vervangt u het sterretje door de bestandsnaam als de analyse van een enkel bestand gewenst is.
10. De tijd die dit script zal nemen om uit te voeren zal aanzienlijk variëren op basis van de beschikbare rekenkracht. Het wordt aanbevolen om deze analyse uit te voeren op een computer met ten minste 8 GB RAM, zodat de gebruiker toegang kan krijgen tot andere Programma's terwijl het script wordt uitgevoerd.
    Let op: Hoewel niet strikt noodzakelijk, kan het grafieken van de oorspronkelijke confocale acquisitie (in grijs) en het overleggen met deze afbeeldings matrix met de skelet matrix (in rood) helpen bij het evalueren van de prestaties van het skeletonisatie-algoritme. Daarnaast kan de lezer een Nodale Graph maken, zoals geïmplementeerd door Kollmannsberger et al., om de nauwkeurigheid van de netwerk analyse te evalueren. Het maken van beide grafieken, terwijl nuttig, zal drastisch verhogen de runtime van het script en vereisen extra geheugen; Als de gebruiker gewoon een uiteindelijke topologie analyse vereist en niet wilt visualiseren van de gegevensset, gewoon commentaar uit regels 44 naar 61 (Skeleton Graph) en lijnen 104 naar 143 (topologie Graph).
11. Na voltooiing bevat de gegevens matrix, die zichtbaar is in de werkruimte, nu de verwerkte gegevens. Dubbelklik op gegevens en open deze cel in de variabele editor.
    1. Merk op dat deze matrix, van links naar rechts: 1) de bestandsnaam, 2) het aantal knooppunten (vertakkingspunten + eindpunten), 3) vertakkingspunten, 4) koppelingen (d.w.z. vaten), 5) netwerk lengte (inclusief Isoleer vaten), en 6) het aantal segmenten in de z-stack bevat. Sla deze gegevens op als een. CSV-bestand en exporteer voor verdere analyse naar elke software naar keuze.

Resultaten

Na differentiatie (Figuur 1), FACS en inkaping van IPSC-EPS in collageen hydrogels, zullen de cellen meestal afgerond blijven voor 24 uur voordat ze beginnen te migreren en initiële lumen vormen. Na ongeveer 6 dagen van de cultuur, zal een primitieve capillaire plexus zichtbaar zijn in de hydrogel wanneer bekeken met brightfield microscopie (Figuur 2). Na de beeldvorming van de vaste, bevlekt, met cellen beladen hydrogels op een ...

Discussie

Dit protocol omvat de lange termijn cultuur van cellen in drie soorten celkweek media: E8, LaSR basal en EGM-2. Daarom moet er veel zorg worden besteed aan het adequaat steriliseren van alle materialen. Bovendien moeten labjassen en met ethanol gereinigde handschoenen altijd worden gedragen bij het werken in de laminaire stroom afzuigkap van het laboratorium. Het wordt aanbevolen om regelmatig te testen op Mycoplasma besmetting; Als een grote hoeveelheid vuil wordt waargenomen tijdens de iPSC-cultuur of een plotselinge d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	Een platte, glazen bodemweefselkweekplaat met zijwanden maakt confocale beeldvorming eenvoudig
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, steriele	Corning	7007	Voorkomt de binding van door cellen geladen collageenhydrogels aan de celkweekschaal
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Zachte oplossing voor celdetachering; degradeert geen extracellulaire epitopen die vitaal zijn voor FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	Het basismedium voor iPSC-EP differentiatie.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Waterzuiveringssysteem; anderen kunnen gemakkelijk worden vervangen
Bovine Serum Albumine oplossing, 7,5% in DPBS, sterieel gefilterd, BioXtra, geschikt voor celkweek	Fisher Scientific	A8412	Om de celviabiliteit bij FACs-sortering te behouden
CD34-PE, humaan (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antilichaam gebruikt voor FACs isolatie van iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induceert de vorming van mesoderm uit pluripotente stamcellen
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Hoofdcomponent van de 3D-micro-omgeving
Conische centrifugeerbuizen (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Wordt gebruikt om relatief grote volumes reagentia en celkweekmedium op te slaan en te mengen
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Om celkernen tegenkleuren en te visualiseren
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Voor het verdunnen van Matrigel en het ontdooien van pluripotente stamcellen
Dulbecco's fosfaatgebufferd zout (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Om monolaagculturen te wassen
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Voor het passeren van pluripotente stamcelkolonies en om celaggregatie bij FACs-sortering te voorkomen
Endotheelcel Groei Medium 2	PromoCell	C-22011	Bevat endotheelcel viabiliteit en proliferatie
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Voor het onderhouden van pluripotente stamcellen
Glycine,BioUltra, voor moleculaire biologie, >=99,0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutraliseert resterend detergent
L-Ascorbinezuur 2-fosfaat sesquimagnesiumzouthydraat, >=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Component van iPSC-EP differentiatiemedium
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multi-paradigm numeriek berekenomgeving (gratis beschikbaar op de meeste academische instellingen)
Matrigel Matrix GFR FenolRF Muis 10 mL (gelatineuze eiwitmixtuur)	Fisher Scientific	356231	Verdund in DMEM/F12 om platen te coaten voor iPSC-EP differentiatie
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Wordt gebruikt om de uiteindelijke hydrogel osmolariteit en pH in balans te brengen
Microcentrifugebuisjes (1,7 mL)	VWR	87003-294	Bewaart kleine volumes reagentia
Fosfaatgebufferd zout (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	Het hoofdingrediënt van de immunokleuringsoplossingen
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibioticum dat wordt gebruikt na het sorteren om mogelijke besmetting uit het FACS-instrument te verwijderen
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R&D Systems	293-VE	Mitogeen dat de proliferatie en tubulogenese van endotheelcellen stimuleert
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	Om de afzetting van F-actine te identificeren en daarom de randen van de vasculaire netwerken te omlijnen
Triton X-100 (nonionisch oppervlakte-actieve stof)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent gebruikt om cellen voorzichtig te permeabiliseren
Tween-20 (emulgerend reagens)	Fisher Scientific	BP337	Verhoogt de bindingsspecificiteit van de toegevoegde antilichamen
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Om het 3D-endotheel lumen in collageenhydrogels te identificeren
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	Voor het onderhouden van pluripotente stamcellen
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Behoudt de viabiliteit van pluripotente stamcellen en iPSC-EP wanneer ze worden gedissocieerd en opnieuw gezaaid