Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

Summary

Hier presenteren we een protocol bij de menselijke cultuur-enteroid of colonoid monolayers moeten intact barrièrefunctie gastheer epitheliale-microbiota interacties op het cellulaire en biochemisch niveau studeren.

Abstract

Menselijke 3-dimensionale (3D) enteroid of colonoid culturen afgeleid van stamcellen uit de crypt-basis zijn momenteel de meest geavanceerde ex vivo model van het intestinaal epitheel. Als gevolg van hun gesloten structuren en belangrijke ondersteunende extracellulaire matrix zijn 3D culturen niet ideaal voor host-pathogen studies. Enteroids of colonoids kunnen worden gekweekt als epitheliale monolayers op permeabele weefselkweek membranen dat manipulatie van beide luminal en basolaterale cel oppervlakken en begeleidende vloeistoffen. Deze verbeterde luminal oppervlakte toegankelijkheid vergemakkelijkt modellering van bacteriële-gastheer epitheliale interacties zoals de slijm-vernederende mogelijkheid van enterohemorrhagic E. coli (EHEC) op Colon epitheel. Een methode voor 3D cultuur fragmentatie enkelgelaagde zaaien en transepithelial elektrische weerstand (TER) metingen om de voortgang naar confluentie en differentiatie worden beschreven. Colonoid enkelgelaagde differentiatie levert secreted slijm dat kan worden bestudeerd door de immunofluorescentie of immunoblotting technieken. Meer in het algemeen, enteroid of colonoid monolayers inschakelen een fysiologisch-relevante platform voor de evaluatie van specifieke cel populaties die kunnen het doelwit van pathogene of commensale microbiota.

Introduction

Intestinale organoids, enteroids en colonoids hebben geleid tot veel vooruitgang in het begrip van de cel van de stam gedrag, intestinale ontwikkeling, barrière/vervoer functie en celdifferentiatie. ¹ echter 3D cultuur beperkt de studie van host epitheliale-pathogen interactions omdat de lumen niet direct toegankelijk voor bacteriën is of virulentie factoren tenzij de gesloten structuren zijn onderworpen aan microinjection. ^{2 , 3} Daarnaast, uitgescheiden materialen zoals kleine molecules, eiwitten, of slijm kan niet gemakkelijk worden bemonsterd uit 3D cultuur voor de downstream-analyse. De impact van ziekteverwekkers op epitheliale barrière functie⁴ en ion vervoer⁵ is geëvalueerd in 3D cultuur met behulp van fluorescente kleurstoffen en time-lapse microscopie, maar geteeld op permeabele weefselkweek ondersteunt monolayers zijn vatbaar voor additionele technieken zoals TER meting en Ussing kamer/voltage clamp opname. ^{6 , 7}

Talrijke publicaties beschreven protocollen voor 2D- of enkelgelaagde cultuur van enteroids/colonoids. Materialen gevonden ter bevordering van de epitheliale cellen bijlage omvatten collageen hydrogels,^8,9 0,1% gelatine,¹⁰ dunne-laag lymfkliertest Sarcoom afkomstige kelder membraan matrix (BMM),^11,,^{12, 13} en menselijke collageen IV. ^{6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17} Seeding benaderingen omvatten mechanische fragmentatie door pipetteren^6,14,15 en/of dissociatie van cel adhesie factoren met behulp van trypsine,^10,11 dispase,¹³ of EDTA. ⁹ een paar protocollen gebruiken niet-poreuze weefselkweek plasticware voor het zaaien, maar dit beperkt de basolaterale toegang, zodat de meeste toepassingen afhankelijk van permeabele weefselkweek inzetstukken. Documentatie van stabiele confluente enkelgelaagde vorming en onderhoud varieert sterk onder de publicaties. Bovendien, groei en differentiatie media composities voor menselijke culturen verschillen tussen verschillende groepen en blijven evolueren zoals meer onderzoekers nemen en de methodologie te passen hun toepassing en de beschikbare middelen aan te passen.

Om de beperkingen van 3D intestinale epitheliale cultuur in gastheer-Ziekteverwekker Interactie studies, presenteren we een gewijzigde protocol voor het converteren van 3D menselijke enteroids of colonoids naar een enkelgelaagde. Na het bereiken van confluentie in een onrijpe staat crypt-achtige, leidt terugtrekking van de groeifactoren WNT3A, RSPO1 en de remmers A-83-01 en SB 202190 tot differentiatie vertegenwoordiger van kleine intestinale villosités of oppervlakte Colon epitheel. We beschrijven de ideale matrix, menselijke collageen type IV, jas de inserts te verkrijgen van uniforme fragmenten van enteroid of colonoid voor de plating. We laten zien dat dit protocol produceert een confluente enkelgelaagde met een hoge monolayers TER. Colonoid een laag dik apicale slijm afscheiden waardoor ex vivo studies van de pathogeen-slijm interactie via immunoblotting of immunokleuring. Een gemodificeerde fixatie procedure voor het behoud van de Colon slijm-laag voor immunokleuring wordt ook beschreven. Deze methode streeft naar een hanteerbare model voor het bestuderen van de vroegste intestinale gastheer-pathogeen interacties na infectie.

Protocol

Dit protocol is gebaseerd op onderzoeken die door de auteurs eerder zijn gepubliceerd. ^{6 , 7 , 14 , 15 , 16} de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheid kast met behulp van adequate aseptische technieken. Alle methoden waarbij menselijke specimens zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board van Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329).

1. vacht cel cultuur inzetstukken met extracellulaire matrix

1. Bereiden van voorraad collageen IV (1 mg/mL) in 100 mM azijnzuur 5 mL. Laat staan bij 4 ° C gedurende ongeveer 4 uur om volledig hydraat/los.
2. Aliquot de collageen IV stockoplossing en bewaren bij 4 ° C (≤ 1 maand) of -20 ° C (> 1 maand).
3. Verdun de collageen IV-stockoplossing in steriele weefselkweek rang water met een eindconcentratie van 34 μg/mL onmiddellijk voorafgaand aan de coating. Voor 24-well plaat cultuur van de cel wordt ingevoegd, vacht elk invoegen met behulp van 100 μl van de oplossing, hetgeen overeenkomt met 10 μg/cm².
4. Incubeer de plaat in een standaard CO₂ weefselkweek incubator bij 37 ° C voor ≥ 2 h, of voor gemak, verzegel de plaatranden met paraffine film en Incubeer bij 4 ° C's nachts of maximaal 1 week.

2. enteroids/colonoids uit 3D cultuur isoleren

Opmerking: Enteroids of colonoids worden van donor biopsieën vastgesteld en gehandhaafd in 3D cultuur volgens standaardprotocollen die hierboven worden beschreven. ^{14 , 18} kort, crypten zijn geoogst van intestinale biopsieën of resections via chelatie en mechanische agitatie. De crypten zijn gewassen geoogst en verguld in BMM. Uitbreiding media (beschreven in stap 4.2) is toegevoegd aan de cultuur en om de 2 dagen vervangen. 3D cultuur formatie is zichtbaar binnen uur na beplating.

1. Het kweekmedium van de 24-well plaat gecombineerd en vervangen met 1 mL ijskoud oogsten (Zie Tabel van materialen) per putje.
2. Gebruik een mini cel schraper te verjagen en uiteenvallen de kelder membraan matrix pellet, met bijzondere aandacht voor materiaal in de buurt van de randen goed.
3. Agitate de plaat op een roteerschudapparaat bij ongeveer 200 omwentelingen per minuut, 4 ° C gedurende 30-45 min.

3. distantiëren 3D enteroids/colonoids

1. Een P200 enkellijns pipet of een meerkanaals-pipet uitgerust met steriele filter tips gebruiken om te triturate van de celsuspensie.
2. Zwembad de suspension(s) van de cel in een conische flesje van 15 mL. Gebruik meerdere flesjes als volledige schorsing volume > 6 mL.
3. Voeg een gelijk volume van geavanceerde DMEM/F12 medium met 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamine dipeptide (1 x) en penicilline-streptomycine (1 x) (wassen medium). Omkeren van de buis-3 - 4 keer te mengen. Centrifugeer bij 300 x g, 10 min, 4 ° C.
   1. Desgewenst gecombineerd het medium wassen en vervangen met 0,5 mL per putje trypsine (Zie Tabel van materialen). Colonoids met een pipet P200 resuspendeer, cap de buis en plaatst in een waterbad 37 ° C, voor ongeveer 2 min. onmiddellijk verwijderen van de buis, wassen middellange tot een eindvolume van 10 mL toevoegen en herhaal het centrifugeren zoals in stap 3.3.
      Opmerking: Deze stap wellicht beter als verpulvering niet leidt een uniform formaat fragmenten tot.

4. plating de schorsing van de enteroid/colonoid

1. Als gecoate inzetstukken werden bewaard bij 4 ° C, equilibreer in een 37 °C/5% CO₂ weefselkweek incubator voor ten minste 30 minuten vóór de cel beplating.
2. Voor elke toevoeging te worden bekleed, bereiden 1 mL warm (tussen de 25 en 37 ° C) uitbreiding medium (EM) en voeg toe 10 μM Y-27632 en 10 μM CHIR 99021.
   Opmerking: EM is samengesteld van geavanceerde DMEM/F12 met B27 (1 x), 50% WNT3A geconditioneerd medium, 15% RSPO1 geconditioneerd medium, 10% Noggin geconditioneerd medium, 50 ng/mL menselijke EGF, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antibioticum/antimycotic cocktail (1 x), 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamine dipeptide (1 x), en penicilline-streptomycine (1 x) (Zie Tabel van materialen).
3. Het wassen medium uit de buis met de cel pellet gecombineerd en resuspendeer in een volume van EM voldoende om het rendement van ten minste 100 μl/invoegen.
4. Gecombineerd de collageen IV oplossing van elke toevoeging en spoel tweemaal met 150 μl van het medium wassen per invoegen.
5. Pipetteer 600 μL van EM in de ruimte onder elke toevoeging.
6. Pipetteer 100 μl van de celsuspensie in elke toevoeging.
7. De plaat terug naar de weefselkweek incubator en ongestoord gedurende ten minste 12 uur verlaten.
   Opmerking: Vermijd schudden of scherp kantelen van de plaat om te voorkomen dat de ongelijke verdeling van colonoid fragmenten op het membraan invoegen.
8. Controleren van de bijlage van de cel en verspreiding vormen een confluente enkelgelaagde door het plaatsen van de plaat op een Microscoop fase contrast licht onder een 2.5 x-10 x objectief.
9. Na 1-2 dagen, moeten de meeste fragmenten voldoen aan de collageen-matrix. Vernieuw het kweekmedium en staken van behandeling met Y-27632 en CHIR 99021. Blijven vernieuwen het medium elke 2-3 dagen tot de heuvels. Confluentie is over het algemeen bereikt in 7-10 dagen.

5. maatregel transepithelial elektrische weerstand

1. Bevestig de elektrode leads en macht op de epitheliale voltohmmeter (EVOM). Controleer of de meetfunctie Ohm is ingesteld.
2. Dompel de elektrode tips kort in 70% ethanol en veeg droog met een laboratorium weefsel. Equilibreer de elektrode in 5 mL wassen medium voor ongeveer 5 min.
3. Dompel onder tip voor het kortere elektrode in het medium invoegen en oriënteren van de langere elektrode-tip in de lagere goed plaat. Handhaven van de elektrode in een volledige verticale richting totdat de lezing EVOM relatief stabiel is, of niet langer dan 60 s.
   Opmerking: Als de vergadering van de elektrode wordt gekanteld verre van verticale of de tip hoogte onjuist is aangepast, de kortere tip kan in contact komen met en verstoren de cel enkelgelaagde.
4. Vergelijk EVOM metingen om de waarde uit een cel-vrije invoegen ondergedompeld in een kweekvloeistof vooruitgang richting confluentie of differentiatie te beoordelen.

6. differentiatie van confluente enteroid/colonoid vettapijten

1. Uitwisselen van EM voor differentiatie medium (DM) en blijven vernieuwen van media om de twee dagen tot dag 5. DM is EM die mist van WNT3A, RSPO1, A-83-01 en SB 202190.
2. Blijven volgen TER om te verifiëren dat differentiatie verloopt zoals verwacht. TER zal blijven toenemen tijdens dagen 1-5 van differentiatie. Monolayers kunnen blijven verhogen TER en behouden van levensvatbaarheid buiten dag 5-6 maar vertonen van de maximale en meest reproduceerbare resultaten wanneer gebruikt op dag 5-6.

7. bacteriële infectie met commensale of pathogene E. coli

1. Een dag voorafgaand aan de uitvoering van de infectie, wassen en diervoeders monolayers met antibioticum-vrije EM of DM.
2. Gebruik een steriele microbiologie lus voorzichtig schrapen van het oppervlak van een bevroren bacteriële glycerol voorraad en enten van 2 mL van de pond-Bouillon. De buis overbrengen in een standaard incubator schudden bij 37 ° C gedurende 12-16 h.
3. Verdun 50 μl van de starter cultuur in 5 mL vers pond-Bouillon (1:100) en blijven incubatie met schudden voor 90 min. Dit resulteert in een logboek fase cultuur met een dichtheid van 10⁵-10⁶ kolonie-vormende eenheden (kve) / mL.
   1. Eventueel bevestigen de bacteriële concentratie door meting van de extinctie op 600 nm (OD600) in een spectrofotometer.
4. Spin down de bacteriecultuur bij 12.000 x g gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer bacteriën in antibioticum-vrije EM of DM om een eindconcentratie van 10⁷ cfu/mL.
5. Voeg 10 μL van bacteriële suspensie aan de insert (eindconcentratie 10⁶ cfu/mL). Pipetteer langzaam te mengen en dat niet wordt verstoord de extracellulaire slijm laag.
6. De plaat terugkomen met een weefselkweek incubator voor de gewenste infectie periode.

8. fixatie te behouden en immunokleuring slijm

1. Lift de cultuur van de cel wordt ingevoegd uit de 24-well plaat, zorgvuldig omkeren op een papieren zakdoekje laboratorium te verwijderen het apicale medium, en veeg weg externe vloeistof klampt zich vast aan de invoegen.
2. Onderdompelen in een nieuwe 24-well plaat, de invoegen in een oplossing van 1:3 ijsazijn in absolute ethanol (Clarke's oplossing) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
3. Omkeren van de invoegen om te verwijderen het fixeer en hydrateren van de cellen in 1 x PBS voor 10 min. doorgaan met standaard immunokleuring protocollen.
4. Gebruik een scheermesje te snijden rond de omtrek van het membraan invoegen. Het membraan overbrengen in een glasplaatje Microscoop met pincet en brengt een dekglaasje met montage medium.

9. voorbereiding van cel lysates immunoblotting

Opmerking: Voer de volgende stappen op het ijs of in een koude kamer.

1. Gecombineerd middellange en wassen invoegen een keer met PBS.
2. Voeg 150 μl lysis buffer met proteaseinhibitors (zie tabel van materialen) het invoegen en laat 5-10 min. staan Lysis buffer bevat 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS, 1:100 proteaseinhibitor cocktail.
3. Een mini cel schraper om de cellen van de insert te gebruiken, gebruik dan een P200 pipet om kort triturate de schorsing en de overdracht aan een microcentrifuge buis.
4. Bewerk de vering met 5 x 1 ultrasone trillingen ten s pulsen bij 20% amplitude met behulp van een microtip-sonde (Zie Tabel van materialen).
5. Toevoegen van SDS-pagina laden buffer als elektroforese of aliquot onmiddellijk wilt uitvoeren en opslaan van lysates bij-20 ° C.

Results

Menselijke enteroid en colonoid culturen zijn gegroeid als 3D structuren, dan losgekoppeld en gefragmenteerd voor plating op menselijke collageen IV beklede cel cultuur inzetstukken. De voortgang van enkelgelaagde vorming is gemakkelijk gecontroleerd op een dagelijkse basis via heldere veld microscopie, immunofluorescentie (Figuur 1), kleuring en een gestage toename in transepithelial elektrische weerstand (TER) (Figuur 2), waarin de permeabiliteit van strakke kruispunten ionen en correlaten met enkelgelaagde confluentie. De TEW van een lege 24-well invoegen is ongeveer 50-100 Ω·cm², en bij het bereiken van confluentie stijgt naar ongeveer 400-500 Ω·cm². Alle epitheliale cellen in confluente monolayers zijn verbonden door regulates complexen gedetecteerd door de F-actine-ring in het perimeternetwerk van de cel (figuur 1). Monolayers in volledige groeifactor media vertegenwoordigen de proliferatieve crypt-achtige epitheel voornamelijk samengesteld uit actief delen cellen die de nucleoside nemen analoge EdU (Figuur 2). Intrekking van de factoren die de groei WNT3A en RSPO1 bevordert differentiatie, wat leidt tot villosités-achtige culturen dat het gebrek aan delende cellen. Gedifferentieerde monolayers enterocyten (enteroids) of colonocytes (colonoids) bevatten en ontwikkelen van gespecialiseerde intestinale epitheliale cellen zoals is aangetoond in 3D culturen,¹⁸ , met inbegrip van goblet en enteroendocrine cellen. ¹⁵ gesplitste monolayers tonen ook een aanzienlijke stijging van de TER (> 1000 Ω·cm²) (Figuur 2), met vermelding van volwassen strakke kruispunten.

In de normale menselijke fysiologie scheidt de intestinale epitheliale laag voedingsstoffen en de microbe-verrijkt luminal ruimte van de steriele serosal omgeving. Het epithelium regelt strak de cross-talk tussen deze twee compartimenten. Enteroid en colonoid monolayers behouden deze belangrijke brandcompartimentering eigenschap, zoals blijkt uit de Proteoom-analyse in tabel 1. Er zijn aanzienlijke verschillen tussen de samenstelling van de eiwitten in de apicale en basolaterale geconditioneerd media verzameld van gedifferentieerde enteroid monolayers. Toegang tot het apicale en basolaterale weerszijden voorziet collectie van beide supernatant in een tijd-afhankelijke manier voor het meten van differentiële secretie van andere moleculen zoals cytokines en chemokines. ^{15 , 17}

Monolayers zijn handig en zeer reproduceerbaar modellen tot opsporing van de wijzigingen in eiwit expressie gebruikt in combinatie met immunoblotting immunokleuring. Zo verandert in mucin 2 (MUC2) expressie door shRNA knockdown (KD) kan worden opgespoord met behulp van beide technieken (Figuur 3). De shRNA signaaltransductie werd uitgevoerd op 3D colonoids en onderhouden in antibiotica selectie media. Na verificatie van de KD, colonoids kunt worden voortdurend onderhouden als 3D culturen en/of vergulde als monolayers voor experimentele doeleinden. MUC2 KD heeft bovendien geen invloed op de efficiëntie van enkelgelaagde formatie ten opzichte van de lijn van de ouderlijke colonoid wild type. Collectie van monolayers voor immunoblotting is eenvoudig en vergelijkbaar met de protocollen die zijn beschreven voor menselijke epitheliale adenocarcinoom-afgeleide cellijnen. Meestal ongeveer 50 µg of meer van de totale eiwitten kunnen worden geëxtraheerd uit een enkele 0.33 cm² invoegen-gegroeid enkelgelaagde. Zoals blijkt uit Figuur 3, MUC2 is nauwelijks waarneembaar in ongedifferentieerde (UD) WT colonoid monolayers maar zeer wordt uitgedrukt in gedifferentieerde (DF) WT monolayers. MUC2 lager is dan het niveau van detectie in zowel de UD als de DF colonoid monolayers getransduceerde met MUC2 shRNA.

Bovenal zijn monolayers een geschikt model te bestuderen van host-microbiële interacties aan het apicale oppervlak van het epitheel. Colonoid monolayers vormen een bijgevoegde MUC2-positieve slijm Dickschicht op differentiatie die niet gemakkelijk is doortrokken van Commensalisme E. coli HS bacteriën (Figuur 4), vergelijkbaar met wat in het normale menselijke Colón heeft gesuggereerd. ¹⁹ echter enterohemorrhagic E. coli (EHEC), een menselijk colon ziekteverwekker, is gebleken dat de capaciteit om te vernietigen de bijgevoegde slijm MUC2 verrijkte laag te bereiken het apicale oppervlak van het epitheel (Figuur 4). ^{14 , 20} resterende MUC2 is alleen aanwezig in de goblet cellen.

Figuur 1: Deinvoeringvan menselijke enteroid/colonoid monolayers. (A) voorbeeld van colonoid fragmenten na het uiteenvallen van de BMM en verpulvering. (B) voorbeeld van onmiddellijk na plating colonoid fragmenten invoegen. Schaal bar (A-B) = 200 μm. Vertegenwoordiger (C) maximale intensiteit projectie en (D) confocal optische Z-sectie met de overeenkomstige orthogonale projecties blijkt dat colonoid fragmenten uitgezaaid naar menselijke collageen IV beklede filters formulier meerdere enkelgelaagde eilanden 2-4 dagen na het zaaien. Cel-vrije gebieden (sterretje) zijn herkenbaar door het ontbreken van zowel nucleaire (Hoechst 33342, blauw) en apicaal F-actine (phalloidin, groene) vlekken in zowel C en D. vertegenwoordiger (E) maximale intensiteit projectie en F confocal optische sectie met de overeenkomstige orthogonale projecties Toon een enkelgelaagde confluente colonoid met continu apicale oppervlak gedetecteerd door F-actine immunokleuring ongeveer 1 week na zaaien. (G) hoge vergroting van een representatieve maximale intensiteit projectie en (H) confocal optische sectie met de overeenkomstige orthogonale projecties Toon dat cellen in confluente colonoid monolayers vormen de F-actine-perijunctional ringen (witte pijlpunt) en de grens van een onvolwassen apicale borstel (gele pijl hoofden). Schaal bar (C-H) = 20 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: evaluatie van enteroid/colonoid enkelgelaagde differentiatie. (A) EdU (rood) opname toont een progressief verlies van proliferatie tijdens jejunal enkelgelaagde differentiatie. (B) gemiddelde TER maten in confluente jejunal monolayers in expansie of differentiatie medium. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. UD, gedifferentieerdeproductie; DF, gedifferentieerd. Getallen komen overeen met dagen onder de opgegeven voorwaarde; UD1 was de eerste dag van confluentie, ongeveer 1 week na het zaaien. (C) UD jejunal monolayers hebben brede, kortere cellen en een minder-oudere apicale actine gebaseerde borstel rand dan DF dag 5 jejunal monolayers. Schaal bar (A, C) = 50 μm. Alle monolayers werden afgebeeld ten minste 1 week na zaaien en waren confluente voorafgaand aan het begin van differentiatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Wild type colonoids en shRNA transduced knockdown (KD) colonoids elke vorm confluente monolayers. (A) representatieve beelden van wild type (WT) menselijke confluente colonoid enkelgelaagde gedifferentieerd voor 5 dagen en (B) ook gegroeid monolayers afgeleid van MUC2 KD colonoid culturen. Schaal bar (A-B) = 50 μm (C) vertegenwoordiger immunoblot van colonoid culturen getransduceerde met roerei shRNA of MUC2 shRNA toont aan dat de veranderingen in eiwit expressie als gevolg van KD kunnen worden quantitated door immunoblot. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Enteroid/colonoid monolayers zijn geschikte modellen te bestuderen luminal microbe-gastheer interacties. (A) representatieve maximale intensiteit projectie en orthogonale optische sectie van een colonoid enkelgelaagde toont de apicale MUC2-positieve slijm Dickschicht die niet luchtdoorlatend E. coli HS (zwarte pijlpunten) achter het apicale slijm oppervlak. De enkelgelaagde watertje septisch gedurende 6 uur met 10⁶ cfu/mL HS. (B) vertegenwoordiger maximale intensiteit projectie van menselijke colonoid enkelgelaagde apically besmet met EHEC (10⁶ cfu/mL, 6 uur). Schaal bar (A-B) = 50 μm. (C) MUC2 immunofluorescentie intensiteit metingen tonen een significante afname van de MUC2 in monolayers van de EHEC-besmette colonoid in vergelijking met de virusvrije controles. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Eiwit	Toetreding nummer	Peptide overvloed
Basolaterale Media
vetzuur-bindend-proteïne, lever [Homo sapiens]	NP_001434.1	1299
profilin-1 [Homo sapiens]	NP_005013.1	797
de voorloper van de Apolipoproteïne A-IV [Homo sapiens]	NP_000473.2	744
de voorloper van de ecto-ADP-ribosyltransferase 4 [Homo sapiens]	NP_066549.2	633
Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase isovorm 1 [Homo sapiens]	NP_002037.2 (+ 1)	616
de voorloper van de serotransferrin [Homo sapiens]	NP_001054.1 (+ 1)	572
vitamine D-bindende eiwit isovorm 3 voorloper [Homo sapiens]	NP_001191236.1 (+ 2)	567
katalase [Homo sapiens]	NP_001743.1	427
voorloper van de isovorm 1 agrin [Homo sapiens]	NP_940978.2 (+ 1)	377
lactotransferrin isovorm 1 precursor [Homo sapiens]	NP_002334.2 (+ 1)	262
Apicale Media
klaverblad factor 3 voorloper [Homo sapiens]	NP_003217.3	326
klaverblad factor 1 precursor [Homo sapiens]	NP_003216.1	304
kelder membraan-specifieke heparan sulfaat Proteoglycaan kern eiwit isovorm een voorloper [Homo sapiens]	NP_001278789.1 (+ 3)	303
filamin-B isovorm 1 [Homo sapiens]	NP_001157789.1 (+ 2)	240
klaverblad factor 2 precursor [Homo sapiens]	NP_005414.1	182
verwijderd in de hersenen van de kwaadaardige tumoren 1 eiwit isovorm b voorloper [Homo sapiens]	NP_015568.2 (+ 3)	169
keratine, type II cytoskeletal 1 [Homo sapiens]	NP_006112.3	157
myosin-9 [Homo sapiens]	NP_002464.1	150
aminopeptidase N voorloper [Homo sapiens]	NP_001141.2 (+ 1)	145
agrin voorloper [Homo sapiens]	NP_940978.2 (+ 1)	112

Tabel 1. Een gedeeltelijke lijst van peptides geïdentificeerd door vloeibare chromatografie/tandem massaspectrometrie in apicale en basolaterale vloeistoffen bemonsterd van gedifferentieerde jejunal monolayers.

Discussion

Kritieke parameters voor succesvolle vorming van enteroid/colonoid monolayers omvatten 1) gezond, prolifererende 3D culturen als grondstof; 2) coating het celoppervlak voor het invoegen van cultuur met menselijke collageen IV voorafgaand aan enkelgelaagde zaaien; 3) versnippering van 3D culturen mechanisch of enzymatisch, maar niet op het niveau van één cel.

Tijdens de isolatie van 3D enteroids/colonoids, kan de optimale schudden snelheid variëren afhankelijk van de roterende diameter van een model bepaald shaker. De bedoeling is om niet alleen de plaat voor een efficiënt mengen, maar om ook de celsuspensie op de cover van de plaat of spatten in aangrenzende putten doorroeren. Incubatie perioden van < 30 min kunnen opleveren residuele BMM klampt zich vast aan de cellen, die een belemmering vormen kunnen gehechtheid en vorming van uniforme cel monolayers bij het uitplaten op inzetstukken. Uitgebreide incubatie (≥ 1 h) levert aanzienlijk verminderde levensvatbaarheid.

De omvang van de verpulvering moeten distantiëren van de 3D-enteroids/colonoids kan variëren met zuiger rigiditeit en gebruiker beweeglijkheid. Periodieke onderzoek van de goed inhoud ervan op een fase contrast lichte Microscoop wordt aanbevolen om het fragment uniformiteit bepalen tijdens verpulvering, met een doelstelling van ongeveer 30 cellen per fragment. In prioriteit van of in aanvulling verpulvering, kan de schorsing kort met trypsine verkrijgen van kleinere uniforme fragmenten worden verteerd. Trypsine digest kan wenselijk als monolayers een groot aantal 3D-achtige structuren onder een anders één epitheliale laag bevatten zijn. Dissociatie aan afzonderlijke cellen is echter niet wenselijk omdat dit aanzienlijk levensvatbaarheid van de cellen vermindert. Een putje van enteroids/colonoids in een druppel van de BMM 35 μL gekweekt zal in het algemeen volstaan om te vullen van 2-3 ingevoegd, maar deze factor kan variëren afhankelijk van het aantal en de gemiddelde grootte van de enteroids/colonoids.

Colonoid monolayers kunnen absorberen een aanzienlijke hoeveelheid de apicale medium zoals ze onderscheiden. Dit kan worden omzeild door het toepassen van extra DM op de bovenste invoegen kamer (150-200 μl), hoewel gedeeltelijke drogen van het Hogerhuis niet lijkt te enkelgelaagde levensvatbaarheid of functie in downstream assays nadelig beïnvloeden. Na ongeveer 4-5 dagen van differentiatie ontwikkelen colonoid monolayers extracellulaire slijm die na zorgvuldige aspiratie van DM zichtbaar als dikke/gelatine-achtige materiaal op het celoppervlak.

Voor EHEC interactie met de slijm van de buitenste laag gebruiken we regelmatig de bacteriële, in het protocol genoemde titer en incubatie periode. Unieke bacteriestammen moeten echter in eerste instantie worden bepaald op meerdere concentraties en incubatie periode om te bepalen van de juiste parameters voor het gewenste effect.

Tijdens slijm fixatie, zal aspirating het apicale medium waarschijnlijk verwijderen allermeest naar de extracellulaire niet-vastgemaakte slijm laag. Daarom is het belangrijk zorgvuldig uit te storten het medium. Als het medium wordt bewaard in de invoegen door oppervlaktespanning, gebruik de hoek van een gevouwen laboratorium weefsel te breken de oppervlaktespanning en pit weg van de meeste van het medium. Na fixatie en kleuring, kan de laag slijm onbedoeld worden verdreven of afgevlakt terwijl een dekglaasje montage over het filter invoegen. Voor het behoud van slijm hoogte, plaats de filter op een daling van de montage van de media en zorgvuldig plaats de dekglaasje op het filter. Tik of druk naar beneden op het dekglaasje zoals dit kan aanzienlijk het afvlakken van de laag slijm niet.

Om een gepolariseerde enkelgelaagde uit cellen in 3D cultuur, is het noodzakelijk om te reproduceren van de interactie tussen de basolaterale membraan verschijnsel van intestinale epitheliale cellen en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten. Laminin, IV van collageen, fibronectine en een array van proteoglycans vormen de intestinale epitheliale ECM. ^{21 , 22} vergeleken wij menselijke cel afkomstige laminin, Fibronectine collageen IV en RattenUitrustingen afkomstige BMM als invoegen coatings. Alleen collageen IV ondersteund de vorming van een stabiele, lange termijn (tot 4 weken) confluente enteroid/colonoid monolayers (cijfers 1-2). Kleine flarden van enkelgelaagde-achtige groei op elk van de andere geteste matrices zijn verkregen, maar deze regio's niet naar confluentie. Gebruik van menselijke collageen IV zoals de ECM surrogaat een aantal voordelen heeft. BMM afgeleid uit Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) lymfkliertest Sarcoom cellen niet van menselijke oorsprong zijn, overwegende dat menselijke collageen IV commercieel beschikbaar en over het algemeen goedkoper is. Bovendien, de BMM is een complex mengsel van proteïnen met inherente variabiliteit, en kan bevatten uitgescheiden door het Sarcoom groeifactoren die invloed hebben op de genexpressie. ²³

Interacties tussen intestinale epitheliaale cellen en de onderliggende ECM in intestinale epitheliale teruggave is nog onvolledig begrepen. Het belang van collageen IV, maar niet laminin, als een hechting ligand voor menselijke colonocytes²⁴ en versterker van intestinale crypt epitheliale cel teruggave²⁵ is gesuggereerd met antilichamen tegen collageen IV waardoor bijlage . Epitheliale-uitgedrukt β1-integrine lijkt te zijn belangrijk voor ECM interactie, een antilichaam specifiek voor β1-integrine aanzienlijk geblokkeerd hechting van colonocytes IV collageen typt. ²⁴ terwijl collageen IV een betrouwbare ECM biedt voor enteroid/colonoid enkelgelaagde vorming op bijsluiters epitheliale verbouwing van de ECM na verloop van tijd heeft nog niet is beoordeeld in dit model, noch heeft de invloed van meer complexe en gedefinieerde ECM mengsels van collageen IV, laminin en fibronectine.

Menselijke enteroids/colonoids in enkelgelaagde formaat (cijfers 1-4) inschakelen manipulaties en bemonstering dat zou lastig of onmogelijk te bereiken met behulp van 3D matrix-embedded culturen. 3D enteroids/colonoids variëren in grootte, structurele complexiteit en luminal volume, en daarmee microinjection microben of kleine moleculen zijn moeilijk nauwkeurig te kwantificeren. Bovendien, in tegenstelling tot de monolayers (tabel 1), 3D culturen te voorkomen dat directe toegang tot zowel de luminal en basolaterale oppervlakken te meten ionen, voedingsstoffen, cytokines of secreted factoren die samenhangen met de fysiologische of pathofysiologische processen . Confluentie (cijfers 1-2) is een van de belangrijkste eigenschappen van de enteroid/colonoid enkelgelaagde nodig zijn voor de vaststelling van niet alleen de fysiologische gradiënten van voedingsstoffen, ionen, en andere macromoleculen,¹⁶ maar ook het creëren van de juiste barrière tussen luminal microbiota en steriele mesenchymale/immuun cel-bevolkt serosal omgevingen. Deze aspecten zijn belangrijk om te overwegen voor toekomstige studies die gebruikmaken van enteroid/colonoid monolayers met mesenchymale, immuun of neuronale celtypes te bouwen van meer complexe fysiologische modellen.

Bekende beperkingen van de cel cultuur invoegen model hier beschreven zijn gebrek aan fysieke krachten zoals vloeibare schuifspanning en mechanische stretch/compressie (peristaltiek) en het ontbreken van een anaëroob apicale milieu normaal ervaren door intestinale epitheel in vivo. Deze elementen hebben het potentieel om te worden aangepakt met meer geavanceerde microphysiological platforms,²⁶ , maar zij vereisen ook extra kosten, apparatuur en deskundigheid uit te voeren. 3D zowel enkelgelaagde culturen zijn ook zonder interactie met of bijdragen van de intestinale microbiome, stromale cel populaties en het immuunsysteem, tenzij deze onderdelen zijn doelbewust toegevoegd.

Toekomstige toepassingen van de enteroid/colonoid enkelgelaagde op collageen IV beklede cel cultuur inzetstukken eventueel andere studies van pathogene of commensale microbiële interactie met opname van het geneesmiddel of nutriënt, toxiciteit, metabolisme, barrièrefunctie, en functionele toebehoren gekatalyseerd door co cultuur met extra-intestinale celtypen. Evaluaties kunnen worden gemaakt niet alleen binnen epitheel van gezonde donoren, maar ook van personen met genetische mutaties of intestinale aandoeningen, mits de in vivo fenotypen zijn gevestigd ex vivo enteroid/colonoid cultuur worden bewaard.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Sigma	T4661	Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01	Tocris	2939	ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010	Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin	Life Technologies	A12379	Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail	Invivogen	ant-pm-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Life Technologies	17504-044	Component of growth medium
Cell culture inserts	Corning	3470	Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021	Tocris	4423	GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life Technologies	C10639
Collagen IV, from human placenta	Sigma	C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution	Trevigen	3700-100-01	Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)	Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments	EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode	World Precision Instruments	STX3
Escherichia coli strain HS	Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute	Pharmco	111000200
FluorSave mounting medium	Millipore	345789	For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061	L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line	van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research		For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line	Trevigen	3710-001-K	For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M	Life Technologies	15630-080	Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004250
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-01M	Component of growth medium
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896	Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope	Olympus	CKX51
LB broth	EMD Millipore	1.10285.0500
L-WNT3A cell line	ATCC	CRL-2647	For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356231	Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper	United BioSystems	MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal	Abcam	ab11197	Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker	Grant Instruments	PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x	Life Technologies	15140-122	Component of growth medium
Phosphate buffered saline	Corning	21-031
Probe sonicator with microtip	Branson Ultrasonics	450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells	Sigma	P8340	Component of lysis buffer
SB 202190	Tocris	1264	p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride	Sigma	S3014	Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate	Sigma	D6750	Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L3771	Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x	Life Technologies	12605-010	Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab129002	Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	RhoA/ROCK inhibitor