Dit protocol presenteert hoe te leven van beeld en analyseren van de shoot apicale meristems van verschillende plantensoorten met behulp van laser scanning confocal microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Confocale Live beeldvorming van Shoot apicale Meristems van verschillende plantensoorten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De shoot apicale meristeem (SAM) fungeert als een reservoir van geconserveerde cel van de stam en het genereert bijna alle bovengrondse weefsels tijdens de postembryonic ontwikkeling. De activiteit en de morfologie van SAMs bepalen belangrijk agronomische kenmerken, zoals schieten architectuur, grootte en aantal reproductieve organen, en het belangrijkst, graan opbrengst. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het analyseren van zowel de bovengrondse morfologie en de interne cellulaire structuur van de levende SAMs van verschillende soorten via laser confocal microscoop scannen. De hele werkwijze vanaf de bereiding van de monsters voor de verwerving van driedimensionale (3D) beelden met hoge resolutie kan worden bereikt binnen 20 minuten zo kort. Wij laten zien dat dit protocol zeer efficiënt voor het bestuderen van niet alleen de bloeiwijze SAMs van de model-soorten, maar ook de vegetatieve meristems uit verschillende gewassen, die een eenvoudige maar krachtige tool om te bestuderen van de organisatie en ontwikkeling van bieden: meristems over verschillende plantensoorten.
Inleiding
Het meristeem plant bevat een pool van ongedifferentieerde stamcellen en voortdurend voedt de plantengroei orgel en ontwikkeling1. Tijdens de postembryonic ontwikkeling, zijn bijna alle bovengrondse weefsels van een plant afgeleid van de shoot apicale meristeem (SAM). In gewassen zijn de activiteit en de grootte van de SAM en zijn afgeleide floral meristems strak gekoppeld aan vele agronomische eigenschappen zoals schieten architectuur, fruitteelt en zaad opbrengst. Bijvoorbeeld, in tomatensaus veroorzaakt een uitgebreide SAM een toename van de shoot en vertakking van de bloeiwijze, en dus resultaten bij het genereren van extra bloem en vrucht organen2. In maïs leidt een toename van de grootte van de SAM tot een hogere basiswaarde en totale opbrengst3,4. In soja, het meristeem onbepaaldheid is ook nauw verbonden met de architectuur van de shoot en opleveren van5.
De morfologie en de anatomie van SAMs kunnen worden gekarakteriseerd door verschillende methoden, met inbegrip van histologische afdelen/kleuring en scanning elektronen microscopie (SEM)6, die beide hebben sterk het meristeem onderzoek door het verstrekken van geavanceerde het aanzicht of een driedimensionale (3D) oppervlakte weergave van SAMs. Echter beide methoden zijn tijd in beslag, waarbij verschillende experimentele stappen van de bereiding van de monsters voor de data-acquisitie, en deze methoden voornamelijk afhangen van vaste monsters. Recente vooruitgang in laser scannen confocale microscopie techniek hebben deze beperkingen te overwinnen en ons te voorzien van een krachtig hulpmiddel om de cellulaire structuur en ontwikkelingsstoornissen proces van plantaardige weefsels en organen7,8te onderzoeken. Door middel van optische in plaats van fysieke weefsel vectorafbeeldingsbestanden, confocal microscopie staat de inzameling van een reeks van beelden van de z-stack en de daaropvolgende 3D reconstructie van het monster door de software van de analyse van de afbeelding.
Hier beschrijven we een efficiënte procedure voor het onderzoek naar zowel binnen en structuren van de oppervlakte van de levende SAMs van verschillende plantensoorten met behulp van laser scanning confocal microscopie, waarmee potentieel onderzoekers te bereiken de experimentele proces binnen 20 minuten zo kort. Anders dan andere gepubliceerde methoden voor live confocal beeldvorming van Arabidopsis bloeiwijze SAMs9,10,11,12,13,14, 15 en Arabidopsis bloemen12,13, hier wij laten zien dat dit protocol zeer efficiënt voor het bestuderen van niet alleen de meristems van de bloeiwijze van de model-soorten, maar ook de vegetatieve shoot apicale meristems uit verschillende gewassen, zoals tomaten en soja. Deze methode niet afhankelijk is van transgene fluorescente markeringen, en potentieel kan worden toegepast om te bestuderen van de shoot meristems van vele verschillende soorten en cultivars. Daarnaast voeren wij ook de eenvoudige stappen voor het weergeven en analyseren van verschillende SAMs in een 3D-weergave van de beeldverwerking. Samen genomen, zal deze eenvoudige methode onderzoekers beter inzicht in zowel de structuur en de ontwikkelings proces van de meristems van zowel gewassen als modelorganismen vergemakkelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Media en beeldvorming gerechten voorbereiding
- MS platen: Voeg 0,5 x Murashige & Skoog MS middellange, 1% agar in gedeïoniseerd water en pas vervolgens de pH ten slotte op 5.8 met behulp van kaliumhydroxide-oplossing (optioneel: toevoegen van 1% sacharose voor de lange termijn plant groeit). Autoclaaf en giet platen.
- Imaging gerechten: vullen plastic petrischaaltjes (6 cm breed, 1.5 cm diepte) naar 0.5-0.8 cm met 1,5% gesmolten agarose.
2. de plantengroei
-
Arabidopsis groei
- Gesteriliseerde zaaien op MS platen en plaats van platen onder 4 ° C voor twee dagen. Vervolgens verplaatst u MS platen naar een korte dag (8 h licht / donker 16u), bij 22 ° C gedurende twee weken.
- Verplant de zaailingen voor de bodem en ze groeien in een korte dag (8 h licht / donker 16u) bij 22 ° C gedurende vier weken.
- Planten naar continu licht, bij 22 ° C voor het opwekken van de overgang van de vegetatieve naar de reproductieve fase en voor de beeldvorming van de bloeiwijze SAMs overbrengen.
- Groei van de tomaat en soja
- Incubeer de zaden bedekt met natte filtreerpapier tot 28 ° C tot ze ontkiemen.
- Verplant de zaailingen voor de bodem en ze groeien in een lange dag (16 h licht / donker 8u) bij 25 ° C voor een week of langer voor imaging-de vegetatieve SAMs.
3. dissectie van de apex schieten
- Dissectie van de bloeiwijze schieten apex
- Snijd de bloeiwijze schieten apex samen met 1-2 cm hoofdstam van de geschroefde Arabidopsis planten met een scheermesje. Houd het basale deel van de hoofdstam en zo veel oudere bloem organen mogelijk uit de hoofdstam verwijderen door de ontrafeling van de steeltjes met sieraden pincet.
Let op: Vermijd snijden vingers bij het gebruik van een scheermesje. Gooi de gebruikte Scheermesjes aan een juiste sharps' container. - Houd de bijgevoegde stam van de apex schieten met sieraden pincet of vingers op het gebied van de stereomicroscoop, blijven de rest van de bloemen verwijderen tot bijna de hele SAM kan worden bekeken vanuit de oculairs. Verwijder de steeltjes duidelijk op de kruising van de hoofdstam.
- Snijd de bloeiwijze schieten apex samen met 1-2 cm hoofdstam van de geschroefde Arabidopsis planten met een scheermesje. Houd het basale deel van de hoofdstam en zo veel oudere bloem organen mogelijk uit de hoofdstam verwijderen door de ontrafeling van de steeltjes met sieraden pincet.
- Dissectie van de vegetatieve schieten apex
- Als u wilt weergeven van de vegetatieve SAMs van tomaat of soja, ontleden uit de zaadlobben, bladeren en wortels van de planten.
- Houd de hypocotyls van de planten onder de stereomicroscoop en verder ontleden uit het blad primordia die betrekking hebben op de vegetatieve SAMs sieraden pincet gebruiken.
4. vlekken
- Als u wilt direct visualiseren cellen in SAMs, gebruik van vers bereide propidium jodide (PI) oplossing om vlek van celwanden. Los PI poeder in steriele, gedeïoniseerd water, maak van 1mL PI kleurstofoplossing in de concentratie van 1 mg/mL en sla de PI-oplossing in microcentrifuge buis bedekt met aluminiumfolie.
- Pipeteer 50 µL PI oplossing in een schone en lege petrischaal en dip de hele ontleed schieten apex in kleurstof voor 2 min. spoelen de apex gebeitst schieten tweemaal in steriele, gedeïoniseerd water. Dompel de hele bloeiwijze SAM of vegetatieve SAM in de PI-oplossing om de uniforme kleuring tijdens de kleuring.
5. foto collectie
Opmerking: voor deze methode, alle de SAM's zijn beeld met behulp van een rechtop confocal microscoop en met een 20 x water dompelen lens. Zoals beschreven in andere protocollen9,12,13,15, is het ook haalbaar is om de afbeelding met behulp van een omgekeerde Microscoop SAMs. Bovendien, kan de levende beeldvorming worden bereikt met behulp van verschillende merken van de confocal microscopen, met dezelfde steekproef voorbereiding stappen. In dit onderzoek zijn de imaging stappen uitvoeriger beschreven als voorbeeld.
- Doorboren van een gat in het midden van een imaging schotel met pincet en plak de apex gebeitst schieten rechtop in het medium.
- Vul de imaging schotel met steriele, gedeïoniseerd water volledig onderdompelen het monster. Vanuit de stereo microscoop bekijken, pipet op en neer voor het verwijderen van luchtbellen gevangen rond het meristeem. Vervolgens aangepast, de hoek van de stam in de agar om ervoor te zorgen dat de SAM volledig zichtbaar vanaf direct boven is.
- Plaats de imaging schotel op het podium van de steekproef van de confocal microscoop. Lagere lens water dompelen en het werkgebied monster Microscoop om te laten de tip van lens duik in het water te verhogen.
- Open van de confocal microscoop software en zoek de SAM in de helderveld in de oculairs. Verplaatsen van SAM monster rechtsonder de lens van de doelstelling via het aanpassen van de XY-controller en vervolgens richten op de SAM van oculairs door voorzichtig aan te passen de Z-controller.
- De overname-functie in de software van de confocal microscoop werken (Zie Tabel of Materials), start de Live-ISO modus bekijken van het monster van het computerscherm, en alle parameters voor de laser scannen experiment instellen.
- Bij het aanpassen van de parameters, de functie Bereik Indicator om te bepalen of het signaal is verzadigd of niet.
- Eventueel de functie opnieuw herladen alle de parameterinstellingen vanuit het geselecteerde confocal bestand van toepassing.
Opmerking: Voorgesteld imaging parameters: Laser lijn (excitatie): 515 nm of 561 nm; Emissie 570-650 nm; Pinhole: 1 luchtige eenheid (AU); Winst: 600-750, scanmodus: Frame; Framegrootte: 512 X 512 of 1024 X 1024; Scansnelheid: van 7 tot Max; Scannen van richting: bi-richting; Gemiddeld aantal: 2-4; Gemiddeld methode: betekenen; Bitdiepte: 16 Bit; Scannen Interval: 0,5-1 µM. Verder, al deze parameters gebaseerd op de aard van de monsters van de verschillende planten en de specifieke imaging behoeften in te optimaliseren.
6. de beeldverwerking
- Voor het visualiseren van optische orthogonale- en dwarswapening sectie weergaven, door de dezelfde commerciële software te gebruiken voor de beeldvorming verwerving. Open het oorspronkelijke confocal bestand, klik op ortho menu, selecteer ortho. Selecteer vervolgens beide x-positie, z en y standpunt positie van het beeld, en de afbeeldingen opslaan als TIFF-bestanden.
- Selecteer desgewenst 3D afstandsfunctie te definiëren van de fysieke afstand tussen twee punten die zijn geselecteerd uit de stapel van de confocal beelden.
- Als alternatief, Fiji/Image J, het open bron afbeelding verwerking pakket te visualiseren de orthogonale- en dwarswapening sectie Weergaven gebruiken
- Open het oorspronkelijke confocal bestand met Fiji, klikt u op Afbeeldingsmenu, selecteer stapels en selecteer vervolgens orthogonale weergaven.
- Selecteer XY, YZen XZ vlakken in de middelste positie en opslaan als afbeeldingen in Tiff-indeling.
- Voor het visualiseren van een 3D transparante projectie, gebruiken dezelfde software.
- Open het oorspronkelijke confocal bestand, klikt u op 3D-menuen selecteer transparant om de weergave van een 3D projectie te genereren.
- Klik desgewenst op 3D menu, selecteer weergaveen selecteer vervolgens transparantie aan te passen van drie parameters van de drempel, oprit en maximale waaronder voor de transparantie van de 3D-projectie afbeelding.
- Klik op 3D-menu, selecteer weergave, en licht de helderheid van de 3D-afbeelding selecteren.
- Exporteren van de geprojecteerde beelden en ze opslaan als TIFF-bestanden.
- Voor het visualiseren van de projectie van een 3D maximale intensiteit, de confocal bestanden openen met dezelfde software en klik op het 3D-menu.
- Selecteer 3D menu en selecteer maximale.
- Anderzijds gebruiken Fiji/Image J te visualiseren een 3D maximale intensiteit projectie.
- Open het oorspronkelijke confocal bestand met Fiji, klikt u op Afbeeldingsmenu en selecteer stapels.
- Selecteer 3D project en opslaan als afbeeldingen in Tiff-indeling.
- Voor het visualiseren van de diepte codering weergave van de 3D beelden, gebruiken dezelfde software.
- Klik op 3D-menu en selecteer weergave.
- Selecteer speciaal en selecteer Diepte codering.
- Anderzijds gebruiken Fiji/Image J te visualiseren de diepte codering weergave.
- De confocal bestanden openen, klikt u op Afbeeldingsmenu, selecteert u Hyperstack.
- Selecteer temporale - kleurcode en opslaan als afbeeldingen in Tiff-indeling.
Opmerking: De diepte codering z-stack ook kan worden bereikt via de plugin Z Code Stack voor Fiji.
- Voor het visualiseren van de 3D-rotatie bekijken als getoond (film 1 en film 2), gebruiken dezelfde software (Zie de Tabel van de materialen).
- De confocal bestanden openen, klikt u op 3D-menuen selecteer serie.
- Selecteer serie renderen, en selecteer een van de vier opties met inbegrip van omdraaien van x, y omdraaien, begin- en einddatumen lijst positie.
- De render-serie als de AVI-bestanden opslaan.
- Ook het gebruiken van Fiji/Image J te visualiseren van de weergave van 3D-rotatie.
- Open het oorspronkelijke confocal bestand met Fiji, klikt u op Afbeeldingsmenuen selecteer stapels.
- Selecteer 3D project en opslaan als AVI-formaat video's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Evaluatie van de doeltreffendheid van onze protocol en verken de morfologie van de meristems van verschillende soorten, hebben we de confocal levende imaging experimenten uitgevoerd op het meristeem bloeiwijze van Arabidopsis en de vegetatieve meristems van zowel tomaat en soja. In deze studie, Arabidopsis ecotype Landsberg erectatomaat cultivar Micro-Tom en soja cultivar zijn Williams 82 gebruikt als voorbeelden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een eenvoudige beeldvorming methode die kan worden toegepast op de studie van schieten apicale meristems uit verschillende planten met kleine wijziging, openen van een nieuwe laan te studeren het meristeem regelgeving op zowel vegetatieve en reproductieve fasen in model planten en Hiermee wordt uitgesneden. In tegenstelling tot de SEM en histologische kleuring methoden, kan dit protocol helpen onthullen van zowel oppervlakte weergave als interne cellulaire structuren van de SAM's, zonder de noodzaak v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen Purdue Bindley Bioscience Center Imaging faciliteit voor toegang tot de laser confocal microscoop scannen en voor de technische ondersteuning, en de auteurs waarderen de hulp van Andy Schaber in de Purdue Bindley Imaging faciliteit. Deze activiteit werd gefinancierd door Purdue University als onderdeel van AgSEED kruispunt financiering ter ondersteuning van de landbouw en de plattelandsontwikkeling Indiana's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size.025 X.005mm, voor het dissekeren van scheutoppen. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Kunststof petrischalen 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Gebruik als MS-platen |
| Kunststof petrischalen 60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Gebruik als beeldvormingsschalen |
| Propagatiemix | Sungro Horticulture | ||
| Propidiumjodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL oplossing in water, om de celwanden te kleuren |
| Scheermesje | PERSONNA | 62-0179 | Voor het snijden van scheutoppen van planten |
| Stereomicroscoop | Nikon | SMZ1000 | |
| Weefsel | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Software voor beeldacquisitie |
Referenties
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751(1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043(2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
