Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Summary

3D single-molecuul lokalisatie microscopie wordt gebruikt om de ruimtelijke posities en bewegings trajecten van fluorescently gelabelde eiwitten in levende bacteriële cellen te sonde. Het experimentele en data-analyse protocol dat hierin wordt beschreven, bepaalt het heersende diffusieve gedrag van cytosolische eiwitten op basis van gegroepeerde enkelvoudige molecuul trajecten.

Abstract

Enkele molecuul lokalisatie microscopie meet de positie en de bewegingen van individuele moleculen in levende cellen met tientallen nanometer ruimtelijke en temporele resolutie van de milliseconde. Deze mogelijkheden maken single-molecuul lokalisatie microscopie bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de biologische functies van moleculaire niveaus in fysiologisch relevante omgevingen. Hier demonstreren we een geïntegreerd protocol voor zowel acquisitie en verwerking/analyse van single-molecule trackinggegevens om de verschillende diffusieve toestanden te extraheren die een eiwit van belang kan vertonen. Deze informatie kan worden gebruikt om moleculaire complexe vorming in levende cellen te kwantificeren. We bieden een gedetailleerde beschrijving van een op camera's gebaseerd 3D-single-molecuul lokalisatie-experiment, evenals de daaropvolgende gegevensverwerkings stappen die de trajecten van individuele moleculen opleveren. Deze trajecten worden vervolgens geanalyseerd met behulp van een numeriek analysekader om de heersende diffusieve toestanden van de fluorescently gelabelde moleculen en de relatieve overvloed van deze toestanden te extraheren. Het analysekader is gebaseerd op stochastische simulaties van intracellulaire Brownian-diffusie trajecten die ruimtelijk worden beperkt door een willekeurige celgeometrie. Op basis van de gesimuleerde trajecten worden RAW-beelden van één molecuul gegenereerd en op dezelfde manier geanalyseerd als experimentele afbeeldingen. Op deze manier worden experimentele precisie-en nauwkeurigheids beperkingen, die experimenteel moeilijk te kalibreren zijn, expliciet opgenomen in de analyse-workflow. De diffusiecoëfficiënt en de relatieve bevolkings fracties van de heersende diffusieve toestanden worden bepaald door de verdelingen van experimentele waarden te monteren met behulp van lineaire combinaties van gesimuleerde verdelingen. We demonstreren het nut van ons protocol door het oplossen van de diffusieve toestanden van een eiwit dat verschillende diffusieve toestanden vertoont bij de vorming van homo-en hetero-oligomere complexen in de cytosol van een bacteriële pathogeen.

Introduction

Het onderzoeken van het diffusieve gedrag van biomoleules geeft inzicht in hun biologische functies. Fluorescentiemicroscopie gebaseerde technieken zijn waardevolle hulpmiddelen geworden voor het observeren van biomoleules in hun inheemse celomgeving. Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) en fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS)¹ bieden ensemble-gemiddeld diffusief gedrag. Omgekeerd, single-molecuul lokalisatie microscopie maakt observatie van individuele fluorescently gelabelde moleculen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie^2,3,4....

Protocol

1. Double-Helix Point-spread-functie kalibratie

Opmerking: afbeeldingen die in deze en de volgende secties worden beschreven, worden verkregen met behulp van een op maat gemaakte omgekeerde fluorescentiemicroscoop, zoals beschreven in Rocha et al.²³. Dezelfde procedure is van toepassing op verschillende Microscoop implementaties die zijn ontworpen voor lokalisatie van single-molecule en tracking microscopie^2,3,4. Alle software voorbeeld verwerving en gegevensverwerking die in dit artikel worden beschreven, is beschikbaar (http....

Results

Onder de hier beschreven experimentele omstandigheden (20.000 frames, trajectlengte minimaal 4 lokalisaties) en afhankelijk van de expressieniveaus van de fluorescently gelabelde fusie eiwitten, ongeveer 200-3000 lokalisaties opleveren 10-150 trajecten kunnen per cel worden gegenereerd (Figuur 2a, b). Een groot aantal trajecten is nodig om een goed gesamplede verdeling van schijnbare diffusie coëfficiënten te produceren. De grootte van FOV ve.......

Discussion

Een cruciale factor voor de succesvolle toepassing van het gepresenteerde protocol is om ervoor te zorgen dat signalen van één molecuul goed van elkaar gescheiden zijn (d.w.z. dat ze schaars moeten zijn in de ruimte en in de tijd (aanvullende MOV. 1)). Als er meer dan één fluorescerende molecuul in een cel tegelijkertijd is, dan kan de lokalisatie onjuist worden toegewezen aan een ander traject van de moleculen. Dit wordt het koppelingsprobleem³⁰genoemd. Experimentele omstandighed.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,6-diaminopimelic acid	Chem Impex International	5411	Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm laser	Coherent	Genesis MX514 MTM	Use for fluorescence excitation
agarose	Inivtrogen	16520100	Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingredient.
bandpass filter	Chroma	ET510/bp	Excitation pathway.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride	Sigma Aldrich	223506	M2G ingredient.
camera	Imaging Source	DMK 23UP031	Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask	Double Helix, LLC	N/A	Produces DHPSF signal.
disodium phosphate	Sigma Aldrich	795410	M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror	Newport	8892-K	Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres	Invitrogen	F8792	Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucose	Chem Impex International	811	M2G ingredient.
immersion oil	Olympus	Z-81025	Placed on objective lens.
iron(II) sulfate	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingredient.
long pass filter	Semrock	LP02-514RU-25	Emission pathway.
magnesium sulfate	Fisher Scientific	S25414A	M2G ingredient.
microscope platform	Mad City Labs	custom	Platform for inverted microscope.
nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Ozone cleaner	Novascan	PSD-UV4	Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate	Sigma Aldrich	795488	M2G ingredient.
Red LED	Thorlabs	M625L3	Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Camera for fluorescence imaging.
short pass filter	Chroma	ET700SP-2P8	Emission pathway.
Tube lens	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate	Thorlabs	WPQ05M-514	Excitation pathway.