Methodenartikel

Methode om het patroon van de ademhaling in senescente muizen te verkrijgen door ongebreidelde barometrische plethysmografie

DOI:

10.3791/59393

⸱

28 april 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Le Moyne College, 2Department of Mathematics, Statistics and Computer Science, Le Moyne College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ongebreidelde luchtdruk wordt gebruikt om het patroon van het inademen van wakkere muizen te kwantificeren. We laten zien dat 15 s segmenten onder een gestandaardiseerd protocol vergelijkbare waarden weergeven als een langere duur van stille ademhaling. Deze methodologie maakt het ook mogelijk voor de kwantificering van apneu en verhoogde ademhalingen tijdens het eerste uur in de kamer.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ongebreidelde barometerplethysmografie (UBP) is een methode voor het kwantificeren van het patroon van de ademhaling in muizen, waar ademhalingsfrequentie, getijdenvolume en minieme ventilatie routinematig worden gerapporteerd. Bovendien kan informatie worden verzameld over de neurale output van de ademhaling, met inbegrip van het bestaan van centrale apneu en verhoogde ademhalingen. Een belangrijke overweging voor UBP is het verkrijgen van een ademhalingssegment met een minimale impact van angstig of actief gedrag, om de reactie op ademhalingsuitdagingen op te helderen. Hier presenteren we een protocol dat het mogelijk maakt voor korte, rustige basislijnen worden verkregen in oude muizen, vergelijkbaar met wachten op langere periodes van stille ademhaling. Het gebruik van kortere tijdsegmenten is waardevol, omdat sommige muizenstammen in toenemende mate prikkelbaar of angstig kunnen zijn, en langere perioden van stille ademhaling mogelijk niet binnen een redelijke termijn worden bereikt. We plaatsten 22 maanden oude muizen in een UBP-kamer en vergeleken vier 15 s stille ademhaling segmenten tussen minuten 60-120 tot een langere 10 minuten rustige ademperiode die 2-3 uur duurde om te verwerven. We verkregen ook tellingen van centrale apneu en verhoogde ademhalingen voorafgaand aan de stille ademhaling segmenten, na een 30 minuten vertrouwdheid periode. We laten zien dat 10 min stille ademhaling vergelijkbaar is met het gebruik van een veel kortere duur van 15 s. Bovendien kan de tijd die leidt tot deze 15 s stille ademhaling segmenten worden gebruikt om gegevens te verzamelen over apneu van centrale oorsprong. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om patroon-van-ademende gegevens te verzamelen in een bepaalde hoeveelheid tijd en maakt stille basislijnmaatregelen haalbaar voor muizen die verhoogde hoeveelheden prikkelbaar gedrag kunnen vertonen. De UBP-methodologie zelf biedt een nuttige en niet-invasieve manier om patroon-van-ademhaling gegevens te verzamelen en maakt het mogelijk voor muizen worden getest over verschillende tijdspunten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UBP is een veel voorkomende techniek voor de beoordeling van ademhalingspatronen1,2,3,4. Bij deze methode worden muizen in een gesloten kamer geplaatst waar drukverschillen tussen de hoofdkamer (waar het dier is gehuisvest) en een referentiekamer door een pneumotachograaf worden gefilterd om waarden te verkrijgen. De resulterende UBP setup is niet-invasief en ongebreideld en maakt het mogelijk voor ademhalingsmaatregelen worden beoordeeld zonder de eis van anesthesie of chirurgie. Bovendien is deze techniek geschikt voor studies die meerdere metingen in dezelfde muis in de loop van de tijd vereisen. Variabelen zoals ademhalingsfrequentie, getijdenvolume en minutenventilatie kunnen met deze methode worden gekwantificeerd, tijdens een enkele proef of over meerdere proeven. Whole-body UBP biedt ook maatregelen van piekstromen en ademhalingscyclus duur. Samen kwantificeren deze parameters het ademhalingspatroon. De opgenomen ademhalingssporen maken het ook mogelijk om de gegevens te bekijken en het aantal centrale apneu dat binnen een bepaalde periode wordt weergegeven, te tellen. Deze telling kan worden gebruikt naast een analyse van het getijdenvolume en inspiratoire tijden om andere veranderingen in het ademhalingspatroon te meten.

Terwijl verschillende niet-invasieve plethysmografie technieken bestaan voor de directe beoordeling van longfysiologische parameters, hele lichaam UBP zorgt voor een manier om te screenen op de functie van de luchtwegen met minimale onnodige stress aan de muis. Head-out plethysmografie, die gebruik maakt van getijdenmidexpiratoire stroommaatregelen en is ook niet-invasief, is gebaseerd op terughoudendheid, net als vele andere vormen van plethysmografie (bijvoorbeeld, dubbele kamer plethysmografie). Hoewel deze methoden zijn gebruikt in knaagdiermodellen om de responsiviteit van de luchtwegen te meten5,kan het gebruik van halsbanden of kleine bevestigingsbuizen muizen (versus andere soorten) langer duren om te acclimatiseren aan en hun ademhaling terug te brengen naar rustniveaus.

Het verkrijgen van een optimaal luchtademend segment is een belangrijke overweging voor vergelijkingen bij de basislijn. Het toegenomen gebruik van commercieel beschikbare plethysmografiesystemen maakt het verzamelen van gegevens over ademhalingspatronen in veel laboratoria mogelijk. Belangrijk is dat het ademhalingspatroon variabel is gedurende de gehele inzamelingsperiode, met name voor muizen. Met dat gezegd, is het noodzakelijk om basisanalyse te standaardiseren als een middel om ervoor te zorgen dat het opleidingsniveau van onderzoekers de resultaten niet vervormt. Er zijn tal van manieren om een luchtademend segment te verzamelen, dat dient als een gebied van variatie tussen experimentele ontwerpen. Een voorbeeld omvat het gemiddelde van de laatste 10-30 min van gegevens na een eerder gedefinieerde set van tijd in de kamer1, terwijl een andere methode gaat wachten tot de muis zichtbaar kalm is voor 5-10 min6. De laatste kan 2-3 uur duren om te bereiken en in sommige gevallen kan het nodig zijn om een proef te verlaten als de muis niet lang genoeg rustig is. Deze zorg is een bijzonder belangrijke overweging voor stammen van muizen waar waargenomen gedrag angstiger en prikkelbaaris 7. Deze muizen kunnen langer duren om zich aan te passen aan de kamer omgeving en alleen kalm blijven voor korte uitbarstingen van tijd. Het beperken van de tijd die wordt besteed aan basislijnverzameling standaardiseert de kamertijd voor elke muis.

Het is van cruciaal belang dat onderzoekers een geschikte basislijn verkrijgen die waarden van rustgedrag in de muis omvat, maar ook tijdig voorkomt. Daarom is het doel van dit rapport om een beschrijving te geven van methoden die worden gebruikt om korte stille basislijnwaarden voor ademhalingsparameters bij muizen te verkrijgen. Bovendien melden we dat apneu en verhoogde ademhalingen kunnen worden gekwantificeerd tijdens het eerste uur in de kamer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden goedgekeurd door het Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee. Alle dierenwerden gebruikt in overeenstemming met het beleid dat is beschreven in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren8.

OPMERKING: (Kritiek) Voordat u gaat experimenteren, u alle benodigde goedkeuringen en training verkrijgen die nodig zijn voor diergebruik. Het is belangrijk dat de onderzoekers vertrouwd zijn met het gedrag van de muis en activiteitsniveaus, waaronder tekenen van slaap, nood en/of bewegingsartefact versus normale snuiven en ademhaling.

1. Kamer voor het hele lichaam van de barometerplethysmografie

  1. Lees de juiste gebruikershandleidingen voor de barometerkamer, inclusief connectoren, O-ringen, enz., en maak een standaard protocolbestand om analysers (bijvoorbeeld metabolisch) en parameters die specifiek zijn voor de software te definiëren.
  2. Zorg ervoor dat alle slangen en buizen zijn aangesloten op de kamer. Sluit een gasstroombuis (flow-in) en een vacuümbuis (flow-out) rechtstreeks aan op de luchtzijde van de pneumagrafiekamer.
    LET OP: De instroom moet worden bevestigd aan de opening gemarkeerdbias stroom.
  3. Bevestig CO2,O2en N2 gastanks aan de gasmixer. Zorg ervoor dat alle gastanks zich in de open positie bevinden voordat ze experimenteren.

2. Kalibratie van de Barometrische Plethysmograafkamer

  1. Kalibreer een hoge en een lage gasstroom door de 7700-versterkersetup te selecteren onder het tabblad Hardware van de barometerhoogleraarsmografiesoftware.
  2. Stel een vacuüm (stroom uit de kamer) geschikt voor de experimentele ontwerp en gas analyzers (~ 0,1 L/ min).
    LET OP: De uitstroomsnelheid moet tijdens de kalibraties gelijk blijven en experimenteren voor nauwkeurige metabolische opnamen.
  3. Stel een lage luchtstroom in door de stroombuis uit de kamer te verwijderen en het vacuüm uit te schakelen.
  4. Noteer de nulstroom door een 0 in te voeren in de cel met lage eenheid voor de bijbehorende kamer. Dubbelklik op de cel Met lage cal, wijzig de tijd in 3 s en druk op Meten.
  5. Bevestig de stroombuis opnieuw en laat gas (20,93% O2, gebalanceerde N2)vanuit de gasmixer door de luchtzijde stromen.
  6. Zet de instroom van liters/minuten om in milliliters/seconde. Klik op de cel van de hoge eenheid voor de overeenkomstige kamer en voer de waarde in milliliters/seconde in. Dubbelklik op Hoog cal,wijzig de tijd in 3 s en klik op Meten.
  7. Laat het tabblad Setup van de 7700-versterker open om de metabole analysators te kalibreren op de barometertoetsografiesoftware.

3. Metabole Analyzer Kalibratie

  1. Stel in het gasmixerprogramma de gasmixer in om een gasstroom vrij te geven die 20,93% O2 en 79,07% N2 bevat.
  2. Stel op de metabole analysators het O2-kalibratieniveau in op 20,93% en de CO2 om 0% te lezen. Draai de wijzerplaat terug naar Voorbeeld zodra de juiste waarden zijn ingevoerd.
  3. Stel het hoge O2-percentage in. Klik op het tabblad ABCD-4 van de barometertoetssoftware en voer vervolgens 20,93 in onder High Unit van de C2-lijn. Onder High Cal,verander de tijd naar 3 s en druk op Maatregel.
  4. Stel het lage CO2-percentage in. Voer 0 in onder Laagcal van de C3-lijn en wijzig de tijd in 3 s en klik op Meten onder Laagcal.
  5. Verander in het gasmixerprogramma de O2-waarde in 10% en de CO2-waarde naar 5%. Wacht enkele minuten tot de gasstroom zich aan deze waarden aanpast. Draai op de metabole analysators de afstelknoppen om CO2 te kalibreren gelijk aan 5%. Zorg ervoor dat u de wijzerplaat terugdraait op Voorbeeld zodra de waarden zijn gekalibreerd.
  6. Stel het hoge CO2-percentage in. Zorg ervoor dat de analysatormetingen stabiel zijn voordat de juiste waarden in de O2 en CO2 worden ingevoegd op de barometervulgrafiesoftware. Klik op Hoge eenheid onder C3 en voer 5in . Verander High Cal in 3 s en druk op Measure.
  7. Stel het lage O2-percentage in. Klik op Laag eenheid onder de optie C2 en voer 10in . Klik op Laag Cal,invoer 3 s en klik op Meten.
  8. Wijzig de gaswaarden op de gasmixer terug naar 20,93% O2 en 79,07% N2. Wacht enkele minuten tot de kamer zich aan deze waarden aanpast. Herhaal de stappen 3.1\u20123.7 als de metabole analysators niet automatisch 20,93% O2 en 0% CO2lezen, om een goede kalibratie te garanderen. Bevestig routinematig de juiste kalibratie met gecertificeerde gastanks.
  9. Controleer de stroommeters die verbonden zijn met de luchtlithtoragrafiekamer opnieuw. Pas de luchtstroom in en uit de kamer aan op de tarieven die geschikt zijn voor het experiment (meestal 0,1-0,3 L/min).
  10. Zodra alle instellingen zijn toegepast op de barometerplethysmografiesoftware, klikt u op OK om te beginnen met opnemen.

4. Ongebreidelde barometrische plethysmografie

  1. Neem het gewicht en de initiële lichaamstemperatuur van de muis vast. Wacht 10 minuten voordat u de muis in de kamer plaatst om O2- en CO2-gegevens uit een lege kamer te verzamelen. Werk in een rustige omgeving die bekend is bij de muizen, zodat lawaai en geuren de gegevensverzameling niet verstoren. Voorkom eventuele verstoringen, waaronder het openen en sluiten van deuren of personeel dat de informatieverzamelingsruimte in/uitbeweegt.
    LET OP: Dit specifieke protocol gebruikte 22 maanden oude mannelijke C57BL/6J muis.
  2. Documenteer tijdens het eerste uur het gedrag van de muis en maak gedetailleerde notities, inclusief specifieke waarden van de stroom in/uit de kamer.
  3. Na 60 min van kamer gewenning, kijk voor segmenten van stille ademhaling voor de volgende 60 min. Lijst van segmenten die ten minste 15 s in lengte zonder snuiven en verzorgen. Neem lichaamstemperatuur maatregelen om de 10 min bij het gebruik van een implanteerbaar apparaat.
  4. Verwijder aan het einde van het experiment de muis uit de kamer en plaats deze terug in zijn kooi. Alle apparatuur moet grondig worden gereinigd en afgeveegd. Als er druppels water achterblijven, gebruik dan onder druk staande lucht om ze te verwijderen.

5. Analyse van het patroon van ademhaling en metabolisme

  1. Open het barometerbestand van de plethysmografie en raadpleeg de opgenomen notities voor het dier van belang.
  2. Open het metabole paneel in de software en neem het gemiddelde van de eerste 10 min van O2 en CO2, wanneer de kamer leeg was. Noteer deze waarden als de FiO2 en FiCO2.
  3. Bekijk het deelvenster Flow van de barometerhoogleraarsografiesoftware. Klik met de rechtermuisknop op Kenmerken analyseren en stel de juiste parameters in. Voer onder het tabblad Meta 1 de FiO2 en FiCO2 in vanaf stap 5.2, evenals de stroom in de kamer onder Meta 2, om VO2 en VCO2te berekenen .
  4. Voor patroon van ademhalingsanalyse, bevestig de tijden voor de 15 seconden van stille ademhaling gebruikend nota's over dierlijk gedrag evenals het traceren van het stroompaneel. Voer de tijden in voor de intervallen van 15 s van stille ademhaling onder Open Data Parser Dialogue van het tabblad Gegevensparser. Klik op Parser View Mode om alleen de specifieke 15-segmenten van belang weer te geven.
  5. Klik op Afgeleide gegevens opslaan. Open het gegevensbestand in een spreadsheet om de opgeslagen gegevens te verkrijgen.

6. Analyse van Apneu en augmented breaths

  1. Sluit in het open controlebestand de modus Parser View af. Ga naar de optie Grafiekinstelling onder Setup > P3-instelling en selecteer Paginaweergave onder Type. Selecteer 5 voor het aantal deelvensters. Voer -2 in de doos met het label Laag en 2 in de doos met het label Hoog voor stroommetingen in milliliters per seconde. Pas de wijzigingen toe.
  2. Schuif naar de markering van 30 min op het deelvenster doorstoring.
  3. Tel apneu en verhoogde ademhalingen voor de 30-60 min nadat de muis werd geplaatst in de kamer. Kwantificeren perioden van zwevende ademhaling die langer duren dan of gelijk zijn aan 0,5 s, indicatief voor een apneu. Verhoogde ademhalingen worden aangegeven door een sterke stijging van het ademhalingsspoor boven 1,25 mL/s, gevolgd door een scherpe daling onder -0,75 mL/s.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten van UBP als een evaluatie van het patroon van de ademhaling in 16 oude (22 maanden oude) muizen uitgevoerd onder normaal luchtgas (20,93% O2 met evenwichtige N2) worden gemeld. De analyse omvatte eerst een vergelijking van een langer 10 min quiet breathing segment (dat meer dan 2 uur duurde om te verkrijgen) met het gemiddelde van vier korte 15-segmenten (gekwantificeerd binnen minuten 60–120). Een representatieve flow tracing van stille ademhaling, waarbij de ademhaling consistent is ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol biedt informatie over een stille ademhaling baseline bij muizen, evenals het verzamelen van gegevens over centrale apneu en verhoogde ademhalingen. De representatieve resultaten tonen aan dat een 10 min stille baseline een vergelijkbaar patroon van ademhaling heeft in vergelijking met een gemiddelde van vier 15 s aanvallen voor een cohort van oude muizen. Belangrijk is dat de 15 s aanvallen zijn niet statistisch verschillend, noch hebben deze groepen verschillen in variatie van elkaar met behulp van Levene's...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Angela Le, Sarah Ruby en Marisa Mickey bedanken voor hun werk voor het behoud van de dierenkolonies. Dit werk werd gefinancierd door 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. ter ondersteuning van CNR) en de McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Carbon Dioxide AnalyzerAEI TechnologiesCD-3A 
Carbon Dioxide SensorAEI Technologies P-61B
Computermoet voldoen aan de vereisten van Ponemah
Drierite beadsPermaPure LLCDM-AR
Flow ControlAEI TechnologiesR-1vacuüm
FlowmeterTSI4100één per kamer nodig en één voor vacuüm
Gas MixerMCQ InstrumentsGB-103
Gas TanksHaun100% zuurstof, 100% koolstofdioxide, 100% stikstof - voedingskwaliteit, of voorgemengde tanks voor normale kamerlucht en gastoetstellingen
Oxygen AnalyzerAEI TechnologiesS-3A
Oxygen SensorAEI Technologies N-22M
Polyurethane TubingSMCTUS 0604 Y-20
Ponemah SoftwareDSI
Small Rodent ChamberBuxco/DSI
Thermometer (LifeChip System)Destron-Fearingelk type thermometer om nauwkeurige lichaamstemperaturen te meten is geschikt, maar het gebruik van implanteerbare chips zorgt voor minimale verstoring van het dier voor het nemen van verschillende lichaamstemperatuurmetingen terwijl het dier zich nog in de UBP-kamer bevindt 
TransducersValidyneDP45één per kamer nodig 
Whole Body Plethysmography System Data Science International (DSI)Bevat ACQ-7700, druk-/temperatuursondes, etc. 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
  2. Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
  3. Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
  4. van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
  5. Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
  6. Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
  7. Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
  8. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  9. Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
  10. Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
  11. Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
  12. Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
  13. Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
  14. Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
  15. Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
  16. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
  17. Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
  18. Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Unrestrained Barometric PlethysmographyPattern Of BreathingSenescent MiceBreathing FrequencyTidal VolumeMinute VentilationCentral ApneasAugmented BreathsGas ChallengesNoninvasive Technique

Gerelateerde artikelen