Individuele autoreactieve Germinal Centers door Photoactivation in een gemengd chimeer Model van Autoimmunity ondervragen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de generatie van gemengde lymfkliertest beenmerg chimaeren met spontane auto-immune germinal centra, in welke autoreactieve lymfocyten een photoactivatable groen fluorescent proteïne (PA-GFP) verslaggever dragen. Dit biedt de mogelijkheid om de cellulaire verbindingsplaats in weefsels met stroomafwaartse moleculaire en functionele analyses.

Samenvatting

Auto-immune ziekten presenteren een aanzienlijk gezondheidsrisico Last. Fundamentele vraagstukken met betrekking tot de ontwikkeling en de progressie van auto-immune ziekte onbeantwoord. Een voorwaarde voor vooruitgang in ons begrip van de onderliggende ziekte mechanismen en de dynamiek van de cellulaire is de precieze koppeling van de microanatomical locatie van cel subsets met stroomafwaartse moleculaire of functionele analyses; een doel dat is van oudsher moeilijk te bereiken. De ontwikkeling van stabiele photoactivatable biologische fluorophores en hun integratie in de verslaggever spanningen heeft onlangs precieze microanatomical labeling en bijhouden van cellulaire deelverzamelingen in lymfkliertest modellen. Hier beschrijven we hoe de mogelijkheid om het analyseren van autoreactieve lymfocyten van één germinal centra kan helpen te bieden van nieuwe inzichten in autoimmuniteit, waarbij de combinatie van een roman chimeer model van autoimmuniteit met een verslaggever van de photoactivatable als voorbeeld . We tonen dat een procedure voor het genereren van gemengd chimaeren met spontane autoreactieve germinal centra bevolkt door lymfocyten uitvoering van een verslaggever van de groen fluorescente proteïne photoactivatable. Met behulp van in vivo labeling strategieën, kunnen interne germinal centra worden gevisualiseerd in transplanteren lymfoïde weefsels en hun cellulaire bestanddelen photoactivated door twee-foton microscopie. Photoactivated lymfocyten van één germinal centra kunnen vervolgens worden geanalyseerd of stroom cytometrically, gesorteerd als afzonderlijke cellen of in bulk, en kunnen worden onderworpen aan extra downstream moleculaire en functionele analyses. Deze aanpak kan direct worden toegepast om vernieuwde inzichten op het gebied van auto-immuniteit, maar de procedure voor het genereren van beenmerg Chimaera en de procedure photoactivation daarnaast brede toepassing vindt in onderzoek naar infectieziekten en tumor uitzaaiingen.

Inleiding

De incidentie van auto-immune ziekte is snel gestegen in de afgelopen decennia, met name in westerse samenlevingen. Vandaag, auto-immune ziekte rangen derde op de lijst van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in de westerse wereld¹. Fundamentele vraagstukken met betrekking tot de ontwikkeling en de progressie van auto-immune ziekte onbeantwoord. Een voorwaarde voor vooruitgang in ons begrip van de onderliggende ziekte mechanismen en de dynamiek van de cellulaire is de precieze koppeling van de microanatomical locatie van cel subsets met stroomafwaartse moleculaire of functionele analyses. In het afgelopen decennium heeft de ontwikkeling van een aantal stabiele photoconvertible, photoactivatable of photoswitchable biologische fluorophores en hun integratie in de verslaggever stammen de precieze microanatomical labeling en volgen van mobiele deelverzamelingen in lymfkliertest modellen.

Kaede, een photoconvertible fluorescerende eiwitten die afkomstig zijn uit een stony koraal, ondergaat onomkeerbare photoconversion van groene fluorescentie te rode fluorescentie bij blootstelling aan UV- of ultraviolet licht². Aanvankelijk werkzaam te volgen van het dynamisch gedrag van afzonderlijke cellen in het ontwikkelen van organotypic hersenen segmenten³, werd generatie een Kaede knock-in muis vervolgens toegestaan toezicht cellulaire beweging in vivo, en het systeem toegepast op analyses van immuun cel migratie naar en uit lymfklieren⁴. Deze aanpak werd later verfijnd met een tweede generatie verslaggever⁵. Een soortgelijke verslaggever is Dendra⁶, die onlangs werd gebruikt voor het bijhouden van de lymfeknoop metastasen in vivo⁷.

De eerste photoactivatable eiwit ontwikkeld was een groen fluorescente proteïne (GFP) gebouwd met een enkel punt Mutatie (T203H), wat leidt tot een zeer lage absorptie in de regio van de golflengte van 450 tot 550 nm⁸. Na photoactivation door violet licht, dit photoactivatable groen fluorescent proteïne (PA-GFP) schakelt de absorptie maximale uit ~ 400 tot ~ 500 nm, opbrengst een benaderende 100-fold intensiteit toenemen wanneer opgewekt met een golflengte van 488 nm. De generatie van transgene muizen waarin alle hematopoietische cellen PA-GFP uitspreken toegestaan, voor de eerste keer, diepgaande analyses van B-celselectie in anatomisch gedefinieerde lichte en donkere zones van de germinal center⁹.

Overwegende dat de photoactivation is een onomkeerbare omzetting van een niet-fluorescerende staat in een fluorescerende staat, en photoconversion is een eenzijdige overgang van één golflengte naar de andere, kunnen photoswitchable eiwitten shuttle tussen beide voorwaarden¹⁰ . Deze laatste functie was onlangs ingezet om ingenieur optische controle van eiwit activiteit¹¹.

Gebruik makend van de PA-GFP-verslaggever, kenmerkte we onlangs de repertoires van de B-cel van één germinal centra in een nieuw model van spontane lupus-achtige autoimmuniteit¹². Dit model is gebaseerd op gemengde chimaeren met 1 deel beenmerg herbergen een autoreactieve B-cel receptor knock-in met specificiteit voor ribonuclear-eiwitcomplexen (564Igi^13,14) gecombineerd met 2 delen het beenmerg van een gewenste donor. Op ongeveer 6 weken post reconstitutie, worden homeostatische voorwaarden bereikt die spontane autoreactieve germinal centra in de milt en de lymfeklieren cutane aanwezig zijn. Met name het germinal center B-celpopulatie is vrijwel uitsluitend (~ 95%) samengesteld uit cellen die zijn afgeleid van het compartiment niet-564Igi, en deze B wild-type-afgeleide cellen geworden autoreactieve. Daarom is het model laat toe een 'plug-and-play' benadering van analyses van autoreactieve germinal center B cellen met behulp van verschillende transgenen en uitsparingen verslaggevers. Hier beschrijven we de procedure voor het genereren van gemengde chimaeren met spontane autoreactieve germinal centra bevolkt door lymfocyten uitvoering van de PA-GFP-verslaggever. Met behulp van in vivo labeling strategieën, kunnen interne germinal centra worden gevisualiseerd in transplanteren lymfoïde weefsels en hun cellulaire bestanddelen photoactivated met behulp van een twee-foton microscoop. Photoactivated lymfocyten van één germinal centra kunnen vervolgens worden geanalyseerd door stroom cytometry of gesorteerd fluorescerende-activated cell sorting (FACS) en onderworpen aan extra downstream moleculaire en functionele analyses. De mogelijkheid om het analyseren van autoreactieve lymfocyten van één germinal centra kan rechtstreeks worden toegepast op vernieuwde inzichten op het gebied van auto-immuniteit, maar de technieken en benaderingen beschreven kunnen bovendien relevante toepassingen vinden in studies van infectieziekten en tumor uitzaaiingen.

Protocol

Alle dierlijke gebruik gelijkvormig aan de richtlijnen van de Europese Gemeenschap en is goedgekeurd door de Deense dier onderzoek inspectie (2017-15-0201-01348).

1. algemene muis veehouderij en de bereiding van buffers en tools

1. Huismuis lijnen onder specifieke pathogenen vrije (SPF) omstandigheden, met periodieke monitoring gezondheidsstatus hadden volgens standaard richtlijnen.
2. Optioneel: Controleer of het ontbreken van spontane germinal centra in naïef muizen als gevolg van onvoorziene infecties niet-gecontroleerd. Dit kan worden gedaan door immunofluorescentie microscopie (aanwezigheid van germinal center structuren) of stroom cytometry (frequentie van germinal center B-cellen) als eerder beschreven¹².
   Opmerking: Beide vrouwtjes en mannetjes kunnen worden gebruikt. In het algemeen, het is ideaal om seks wedstrijd donoren en ontvangers, als een mismatch van geslacht theoretisch tot alloreactivity naar het mannelijke Y-antigeen door vrouwelijke ontvangers/donoren^{15 leiden kan}.
3. Gebruik CD45.1 ontvangers (B6. SJL -Ptprc^een Pepc^b/BoyJ) op ongeveer 6-10 weken oud. Gebruik 564Igi (B6. Cg-Igh^{tm1 (Igh564) Tik}Igk^{tm1 Tik (Igk564)}/j) en PA-GFP (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) donors op de leeftijd van 6-12 weken.
4. De chirurgische instrumenten (direct fijn schaar en pincet Dumont #5 en #7) steriliseren in autoclaaf hen volgens de richtlijnen van de routine sterilisatie.
5. Het bereiden van 500 mL beenmerg (BM) buffer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2% foetale boviene Serum (FBS), 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) met een pH van 7,4. Ter voorbereiding van BM buffer, voeg 10 mL van de warmte-geïnactiveerd (1 uur in een waterbad van 56 ° C aan de inactivering van het complement) FBS en 1,25 mL van een 400 mM EDTA-oplossing (aangepast op een pH van 7,4) tot 500 mL PBS, pH 7.4, en meng goed. Het filteren van de buffer met behulp van een filtreerkolf 0,2 µm.
6. 10 mL lysis-buffermengsel van de rode bloedcellen (RBC) (155 mM NH-₄Cl, 12 mM NaHCO₃, 0.1 mM EDTA) voor te bereiden door verder verdunnen 1 mL van een 10 x 10 mL totale volume met reagens rang water voorraad. 50 mL PBS met 5 mM EDTA, pH 7.4 voor te bereiden.

2. de oprichting van gemengde beenmerg Chimaera

1. Bestraling van ontvangers (dag 0)
   1. Plaats de CD45.1 beenmerg ontvangers in een passende bestraling container en bestralen met 1.100 Rad in een gamma irradiator.
      Opmerking: Alternatieve bestraling bronnen kunnen worden gebruikt. Ongeacht de bron moet de dosis/timing worden geoptimaliseerd om maximale myeloablative effect met minimale collaterale weefselschade zwichten voor de dieren.
   2. Plaats op antibiotica water ad libitum (1 mg sulfadiazin en 0,2 mg trimethoprim/mL drinkwater).
2. Extractie van botten (dag 1)
   1. Anesthetize de 564Igi het beenmerg donoren door continue stroom van 4% Isofluraan in lucht en euthanaseren door cervicale dislocatie. Spray beneden de donoren met ethanol en plaats ze op steriele chirurgische pads in de kap van de stroom. Ga verder met het werken met het handhaven van de steriele condities, met behulp van steriele buffers en apparatuur.
   2. Wilt uitpakken het bovenbeen en onderbeen, eerst maken van een incisie rond de enkel en naar boven helemaal tot aan de heup met behulp van direct fijn schaar uit te breiden. Met behulp van een zware pincet of duim en wijsvinger, trek de huid omhoog en uit het been naar het lichaam. Ook trekken de huid naar beneden en uit de mond.
   3. Pop uit de knie en enkel gewrichten door grijpen het been in de heup en de voet krachtig trekken. Ga naar de enkel gezamenlijke breken en trek de voet naar het lichaam terwijl het vasthouden aan het scheenbeen, waardoor het strippen van de pezen en spieren van het onderbeen.
   4. Breken de knie gezamenlijke vrij te geven van het scheenbeen, en trek dit ook naar het lichaam terwijl het vasthouden aan het dijbeen, waardoor het strippen van pezen en spieren uit het dijbeen. Maken van een sneetje in het heupgewricht en knippen de pezen en vervolgens trek het dijbeen uit de hip-aansluiting. Herhaal stap 2.2.2-2.2.4 voor de contralaterale zijde.
   5. De botten zorgvuldig schoon te wrijven ze met een grof papieren handdoek te verwijderen van alle resterende spier- en bindweefsel. Vervolgens spoel ze af in ijskoude BM buffer voordat eindelijk over te dragen naar verse koude BM buffer op ijs met behulp van een paar van de verlostang Dumont #7. Herhaal stap 2.2 voor de PA-GFP-donoren.
      Opmerking: Het aantal cellen van het beenmerg van een enkele donor is afhankelijk van geslacht en leeftijd. De schaal van het aantal donoren volgens gewenste input beenmerg ratio's en getallen en het gewenste aantal ontvangers. Als donoren schaars zijn, kunnen de voorste ledematen worden opgenomen voor het beenmerg extractie. Dit levert doorgaans een extra 1/3 tot ½ van de cellen verkregen van de achterste ledematen. Typisch, overal uit 50-200 miljoen cellen kunnen worden hersteld per donor, afhankelijk van leeftijd, geslacht, achtergrond en of alleen hind of zowel hind en voorste ledematen opgenomen worden.
3. Het beenmerg cell extractie
   1. Bereid de mortel door spoelen in ijskoude BM buffer. Afvoer van de spoelen buffer en gebruik van een elektrische pipet controller met een serologische pipet 10 mL toevoegen van 10 mL verse ijskoude BM buffer.
   2. De botten van de 564Igi donors overbrengen in de mortel met behulp van een paar van de verlostang Dumont #7 en gebruiken de stamper om te verpletteren en slijpen van de botten om het beenmerg vrij te geven. Het beenmerg extract met een serologische pipet 10 mL gecombineerd en passeren het een 70 µm cel zeef in een tube van 50 mL op ijs.
   3. Voeg een extra 10 mL van de verse ijskoude BM buffer naar de mortel en herhaal dit om te zorgen voor volledig herstel van cellen. Beendermateriaal verwijderen uit de mortel met een papieren handdoek, negeren op de juiste manier, en spoel de mortier zorgvuldig met 70% ethanol, gevolgd door BM buffer. Herhaal stap 2.3 voor de PA-GFP beenmerg donor groep.
4. Het beenmergcellen tellen
   1. Plaats een micropipet met een droplet met 40 µL van RBC lysis buffer op een stukje kunststof paraffine film. Omkeren van de 564Igi het beenmerg buis een paar keer en neem uit een 10 µL aliquoot met behulp van een micropipet. Meng het met de 40 µL van RBC lysis buffer drop.
   2. De daling van de alsnog 50 µL van Trypan blauw (0,4% in waterige oplossing). Onmiddellijk laden 10 µL van de resulterende mix in een Burker-Türk hemocytometer en tellen onder de Microscoop. Bereken het aantal cellen per mL, met behulp van de 10 x totale verdunningsfactor. Levensvatbaarheid van voldoende cellen bevestigen > 90%. Herhaal stap 2.4 voor de PA-GFP beenmerg donor groep.
5. Voorbereiding van donor schorsingen
   1. Op basis van de graven verkregen in stap 2.4 en het gewenste aantal geadresseerden, het berekenen van het volume van beenmerg van de donor uit elk van de twee donor groepen worden gemengd in de donor mix buis.
      Opmerking: bijvoorbeeld voor het opzetten van een groep van gemengd 1:2-564Igi:PA-GFP chimaeren met 6 CD45.1 ontvangers: elke ontvanger vereist 20 x 10⁶ donor cellen totaal, 1 deel 564Igi en 2 delen PA-GFP. Dit vereist dus, 6 x 1/3 x 20 x 10⁶ = 40 x 10⁶ 564Igi donor cellen en 6 2/3 x 20 x 10 x⁶ = 80 x 10⁶ PA-GFP donor cellen.
   2. Meng de juiste bedragen van PA-GFP en 564lgi donor-merg in een conische tube van 50 mL. Centrifugeer het beenmerg mengsel bij 200 x g - en 4 ° C gedurende 10 minuten met behulp van een swingende emmer rotor.
   3. Giet het supernatant en resuspendeer de cellen in de ijskoude BM buffer bij een dichtheid van 1 x 10⁸ cellen per mL. Overbrengen naar een precooled 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs.
6. Reconstitueren beenmerg ontvangers met beenmerg van de donor
   1. Geadresseerden die gebruikmaken van inductie met continue stroom van 4% Isofluraan in lucht, gevolgd door onderhoud op 3,75% anesthetize. Controleer of u voldoende vlak van verdoving door afwezigheid van Teen-snuifje reflex.
   2. Zorgvuldig flick de buis met het beenmerg mix om te zorgen voor voldoende resuspensie van beenmergcellen, dan aspirate 200 µL van het beenmerg mix (~ 20 x 10⁶ cellen), in een 0.3 mL, 30 meten insuline spuit.
   3. Plaats de ontvanger op zijn kant, voorzichtig rekken de huid boven en onder de ogen voor iets 'pop het oogje', en zachtjes Breng de tip van de spuit ongeveer in een hoek van 30° in de voorkant van de oogkas, verzorgen het oog en het omringende weefsel te voorkomen. Toen het puntje van de naald is voelde te raken het bot onderstrepen de oogkas, intrekken iets (~0.5 mm) en het beenmerg van de donor met behulp van de constante druk langzaam te injecteren.
      Opmerking: Er mag geen bloeden, geen lekkage van vloeistof en niet te zeer kleine bolling van het oog na injectie.
   4. De muis terug te keren naar de kooi met ad libitum antibiotica water en controleer of onmiddellijke herstel van de procedure. Herhaal stap 2.6 voor elke geadresseerde.
      Opmerking: Staart-veneuze injectie kan worden gebruikt in plaats van retroorbital injectie met vergelijkbare resultaten, echter, in onze handen is aanzienlijk trager, die wellicht een bron van zorg bij het werken met grote groepen geadresseerden. Herstel van verdoofde dieren rechtstreeks op kleine diameter beddengoed moet worden vermeden, want dit een risico op aspiratie en verstikking vormt
7. Verwijderen van antibiotica water (dag 14)
   1. Het antibioticum water uit de cage(s) verwijderen en vervangen door regelmatig drinkwater.

3. controle van de succesvolle reconstitutie en controleren van de passende mate van chimerism (Week 6)

1. Retroorbital bloeden van chimaera en controles
   1. Bereiden bloed collectie buizen door etikettering 1,5 mL microcentrifuge buizen volgens ontvangende oor tag nummers en het toevoegen van 50 µL van PBS met 5 mM EDTA.
      Opmerking: Omvatten passende controles voor PA-GFP, CD45.1 en CD45.2 en 9D 11 (idiotype). Dit kan worden gedaan door met inbegrip van 1 PA-GFP + muis, 1 CD45.1-muis, 1 B6 mouse en 1 564Igi mouse.
   2. Anesthetize muizen en controleer of voldoende vliegtuig van de verdoving zoals in stap 2.6.1. De Chimaera plaatsen op zijn kant, voorzichtig rekken de huid boven en onder de ogen voor iets 'pop het oogje'.
   3. Zachtjes invoegen een BoPET-verpakt heparinized capillair (60 µL inwendige volume) ongeveer in een hoek van 40° in de voorkant van de oogkas, verzorgen om te voorkomen beschadiging van het oog en het omringende weefsel. Zachtjes twist/draai de buis totdat het begint te vullen met bloed.
   4. Toestaan dat het bloed te passief het vullen van de buis door capillaire werking, totdat bijna helemaal vol, dan het intrekken van de buis en leg deze in de corresponderende vooraf gelabelde collectie buis, terwijl op hetzelfde moment onmiddellijk de greep rond het oog dat het oog om te ontspannen regelen terug op zijn plaats. Bloeden moet onmiddellijk stoppen.
   5. Zorgen dat het capillair in de collectie buis heeft leeggemaakt en gooi het in een container slijpsel. Sluit de tube en drie keer om ervoor te zorgen volledige mengen met de PBS/EDTA omkeren.
   6. De muis terug te keren naar de kooi en controleer of onmiddellijke herstel van de procedure. Herhaal stap 3.1 voor elke experimentele muis en de nodige controles.
      Opmerking: Nemen voorzichtigheid bij het gebruik van de submandibulaire ader punctie als deze methode een groter risico voor onvoorziene besmetting in bestraalde ontvangers vormen kan voordat deze volledig zijn aangemaakt. Verder, in onze ervaring vinden we dat het volume van bloed verzameld en de hoeveelheid bloed verloren als gevolg van excessief bloeden meer variabel. Beide van deze overwegingen zijn belangrijk, zoals het beenmerg Chimaera gevoelig in de reconstitutie fase, zijn voordat het nieuwe beenmerg is volledig geaccepteerd en Haematopoiese heeft hervat normale niveaus.
2. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) zuivering
   1. Na voltooiing van de bloedinzameling, kort (10 s) centrifugeren van de buizen bij lage snelheid (< 200 x g) gestabiliseerd te verzamelen het verdunde bloed op de bodem van de buizen.
   2. Vul een 10 mL spuit met lymfocyt scheiding medium en hechten een naald 18 G. Plaats de naald naar de onderkant van de eerste buis en het bloedmonster met 1 mL van lymfocyt scheiding medium onderlaag. Voorzichtig terugtrekken van de naald en veeg het met een papieren handdoek ter voorkoming van kruisbesmetting van het volgende monster.
   3. Doorloop alle monsters en Centrifugeer gedurende 25 minuten op 800 x g, bij kamertemperatuur, in een swingende-emmer centrifuge, met de remmen ingesteld op laag/uit.
   4. Bereid een reeks dienovereenkomstig gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buizen met 1 mL ijskoud BM buffer elke;
   5. Na centrifugeren, voor elk monster, voer de laag bovenste (plasma) met een micropipet van 200 µL en de mononucleaire (MNC)-cellaag net boven de interface gecombineerd. De cellen aan de dienovereenkomstig gelabelde buis met 1 mL BM buffer overdragen. Sluit het deksel en omkeren als u wilt mengen. Gooi de lymfocyt scheiding middellange-bevattende buis.
   6. Doorloop alle monsters en vervolgens Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min, 4 ° C in een swingende emmer rotor. Gecombineerd en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van ijskoude BM buffer. De monsters zijn nu klaar voor antilichaam-kleuring en flow cytometrische analyse.
3. Kleuring voor stroom cytometrische evaluatie
   Opmerking: Deelvenster voorgesteld: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. Niet-geactiveerde PA-GFP wordt gedetecteerd in de Pacific oranje (of gelijkwaardig) kanaal. Geen kleurstof levensvatbaarheid is nodig omdat de lymfocyt scheiding van dode cellen ontdoen krijgt.
   1. Met behulp van een micropipet, voeg 100 µL celsuspensie per putje voor elk monster hersenschim en controle, toe aan een 96-wells-plaat.
   2. Zwembad voor de 3 niet-PA-GFP controlemonsters, de resterende 100 µL van elk monster (300 totale µL). Voeg 50 µL van dit materiaal voor onbevlekt controle en één gekleurd-controleputjes. Voor het PA-GFP single gebeitste besturingselement toevoegen bovendien 50 µL van onbevlekt PA-GFP monster.
   3. Aan elk putje, voeg 100 µL van de buffer (onbevlekt), één antilichaam (single gebeitste compensatie bedieningsorganen, met uitzondering van PA-GFP compensatie controle) of antilichaam mix (monsters). Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
   4. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Ledig de buffer. Voeg 200 µL van BM buffer aan elk putje en Centrifugeer nogmaals om te wassen. Ledig de buffer en resuspendeer de cellen in elk putje in 200 µL van BM buffer. De monsters zijn nu klaar voor analyse op een stroom cytometer (Figuur 1).
      Opmerking: Germinal center reacties in de Chimaera kunnen op elk gewenst moment vanaf 6 weken verder worden geanalyseerd.

4. In vivo labeling van de marginale zone/subcapsular sinus aan de identificatie van enkele germinal centra

Opmerking: Dit protocol voor struikrover/spronggewricht (popliteale lymfeklier) en intraveneuze (i.v., milt) injecties is aangetoond, maar kan variëren volgens de doelsite.

1. Bilaterale struikrover injectie voor het labelen van popliteale lymfeklier
   1. Anesthetize de muizen zoals in stap 2.6.1.
   2. Verdun in een tube van 1,5 mL microcentrifuge, 2 µL van PE-geëtiketteerden rat anti-muis CD169 antilichaam in 18 µL van PBS, pH 7.4. Plaats twee druppels van elk 10 µL van het mengsel op een stukje kunststof paraffine film. Gecombineerd elke druppel met een 0.3 mL insuline-injectiespuit met een naald van 30 meter.
   3. De 10 µL van labeling mix in hetzij de struikrover injecteren (ingaan met de naald onder een hoek van 5-10° in het centrale deel van de struikrover, proximale vanaf het begin van de tenen, en plaats de naald ongeveer halverwege naar de hiel) of het spronggewricht (Voer met de naald op een 5 - 10 ° hoek net boven de hiel en invoegen over halverwege van de lengte langs de as van de achillespees in de richting van de knie). De muizen terug te keren naar hun kooien en wacht ongeveer 15 minuten voordat u verdergaat met stap 5.
2. Intraveneuze injectie voor het labelen van de milt
   1. Anesthetize de muizen overeenkomstig punt 2.6.1.
   2. In een buis van de microcentrifuge 1,5 mL, Verdun 10 µL van PE-geëtiketteerden rat anti-muis CD169 antilichaam in 90 µL van PBS. Het mengsel gecombineerd met een 0.3 mL insuline spuit.
   3. Retroorbital i.v. injectie per stap 2.6 uitvoeren De muizen terug te keren naar hun kooien en wacht ongeveer 15 minuten voordat u verdergaat met stap 5.
      Opmerking: als alternatief voor Isofluraan, injectie verdoving zoals Ketamine/Xylazine combinatie kan worden gebruikt; echter, dit leidt meestal tot langzamer hersteltijden. Aangezien lymfedrainage wordt meestal beïnvloed door skeletspieren beweging, dit zal naar verwachting leiden tot tragere drainage tijd.

5. explanting van de milt en de lymfeklieren en het voorbereiden van photoactivation

1. Voorbereiding van een dubbelzijdige beeldvorming en photoactivation kamer
   1. Verwijder de zuiger uit een 20 mL spuit en rug-load het met vacuüm vet door het invoegen van de verstuiver van een buis vacuüm vet erin. Vervolgens Verwijder de zuiger uit een 5 mL-spuit en gebruik van de 20 mL spuit aan rug-load het met vacuüm vet.
   2. Gebruik de vacuüm-vet geladen 5 mL spuit om te bereiden een beeldvorming en photoactivation kamer door te plaatsen van een vierkante dekglaasje aan op een vlakke ondergrond en langs de randen van het dekglaasje aan traceren met vacuüm vet (ongeveer 1-2 mm van de randen).
      Opmerking: zorg vacuüm vet om besmetting te voorkomen van om het even welk en alle oppervlakken die later in contact met de Microscoop lens komen, zoals microdruppels vacuüm vet geëmulgeerd in het water onderdompeling de lens besmetten kunnen.
   3. Opvullen van de cover-slip vacuüm vet kamer met ijskoude BM buffer en plaats op een koud vlak oppervlak.
2. Oogsten van lymfklieren en de milt
   1. De in vivo euthanaseren label Chimeer muis te analyseren per stap 2.2.1. Spuiten van het karkas met 70% ethanol.
   2. Voor toegang tot de popliteale lymfeklier, direct fijn schaar gebruik te maken van een incisie in de huid net onder de knie pit en verlengen van de snede omhoog langs de hamstring-lijn bijna tot het heupgewricht. Dumont #5 of #7 trekken pincet, elk van de blootgestelde kleppen van de huid naar buiten, naar het blootstellen van het weefsel in de popliteale fossa (figuur 2A).
   3. Met behulp van een paar van de verlostang Dumont #5, zorgvuldig Voer de popliteale fossa gewoon mediale naar de popliteale ader en ontleden openen van het vet door invoegen en openen en sluiten van de verlostang langs de as van de leg, om de onderliggende popliteale lymfeklier bloot.
   4. Pop de lymfeklier uit de fossa door het knijpen van de quadriceps spier vanaf de voorzijde proximale aan de knie met behulp van de duim en wijsvinger (figuur 2B). Pak de lymfeklier van onderen met de pincet om het bevrijden van het omliggende weefsel (figuur 2C) en plaats het in de zaal van de vacuüm vet bereid in stap 5.1.
   5. Herhaal stap 5.2.2 – 5.2.4 voor de contralaterale zijde. Meerdere lymfeklieren kunnen worden aangebracht in een enkelvoudige kamer, indien gewenst.
   6. Ten slotte sluit de zaal door een tweede dekglaasje aan op de top van de vacuüm vet rand te plaatsen en druk op zachtjes naar beneden, verzorgen aan het extruderen van alle luchtbellen.
      Opmerking: Sommige van de buffer kan ook worden geduwd, maar het vacuüm vet moet vormen een goede afdichting, voorkomen lekkage van vloeistof (figuur 2D). De lymfeklieren zijn nu in een ' double-sided imaging kamer.
   7. Voor toegang tot de milt, met behulp van een paar direct fijn schaar Maak een incisie via de buikwand aan de linkerzijde van de muis, proximale aan de voorste mediale lijn, net onder de ribbenkast en het rond het lichaam naar de achterste axillaire lijn uit te breiden. De tip van de milt moet zichtbaar (figuur 3A).
   8. De milt met een paar van Dumont #7 verlostang uitlichten en snijd de verklevingen aan de onderzijde vrij te geven. Gebruik het paar direct fijn schaar te snijden ~ 2 mm dik, transversale, segmenten.
   9. Plaats het segment in de zaal van de vacuüm vet bereid in stap 5.1. Meerdere segmenten van de milt kunnen worden gemonteerd in een enkelvoudige kamer, indien gewenst.
   10. Ten slotte sluit de zaal door een tweede dekglaasje aan op de top van de vacuüm vet rand te plaatsen en druk op zachtjes naar beneden, verzorgen aan het extruderen van alle luchtbellen. Houd alle imaging chambers op ijs te allen tijde, met uitzondering van tijdens de beeldvorming en de photoactivation.
       Opmerking: Sommige van de buffer kan ook worden geduwd, maar het vacuüm vet moet vormen een goede afdichting, voorkomen lekkage van vloeistof. De milt segmenten zijn nu in een ' double-sided imaging kamer (figuur 3B).

6. Photoactivation

1. Identificeren van één germinal centra
   Opmerking: Dit protocol wordt beschreven voor de milt, maar is volledig analoog voor de lymfeklieren.
   1. Plaats de imaging kamer in het werkgebied van de Microscoop. Met behulp van een pipet 3,5 mL kunststof overdracht, breng een druppel gedestilleerd water op de top van de bovenste dekglaasje aan en lager de doelstelling tot het aanspreekpunt. Focus op de bovenkant van het weefsel met behulp van de doorvallend licht.
   2. Ga naar de donkere modus en twee-foton excitatie en afstemmen van de laser 940 nm.
      Opmerking: Met de juiste filter sets, deze golflengte toelaat excitatie en opsporing van de tweede generatie van de harmonischen in de collageen-bevattende structuren die zijn gekoppeld aan grote schepen en structurele elementen, evenals de CD169-PE geïnjecteerd in stap 4.2, die identificeert de marginale zone. 940 nm excitatie doet echter niet photoactivate PA-GFP.
   3. Lokaliseren van afzonderlijke wit-pulp gebieden (dat wordt begrensd door CD169-PE kleuring) in de buurt van het oppervlak van het weefsel en de identificatie van de periarteriolar lymfoïde schede (PALS, T cel zone) door de tweede generatie van de harmonischen die is gekoppeld aan de centrale arteriole. In de zone tussen de PALS en de marginale zone, kijk voor de aanwezigheid van zeer autofluorescent, tingible-body macrofagen (sterke autofluorescent signaal in alle kanalen, blob-achtige verschijning met donkere vacuolen) geactiveerd (figuur 4A).
      Opmerking: Indien nodig, door ongewenste oriëntatie van het weefsel, de imaging kamer kan worden ingeklapt en beeldvorming kan worden uitgevoerd vanuit de andere richting.
   4. Op basis van kenmerken die geïdentificeerd in stap 6.1.3., tekenen van een gebied van belang het identificeren van een enkele germinal centrum-gebied. Instellen van een Z-stapel rond 100-150 µm diepte, vanaf het oppervlak van het weefsel, en met behulp van een stap grootte van ~ 3 µm.
   5. Overschakelen naar 830 nm excitatie golflengte. Uitgeschakeld of dim alle kanalen om te voorkomen dat photodamage detectoren (zoals laser macht en uitvoer fluorescentie is meestal aanzienlijk hoger bij deze golflengte), en dan 'beeld' van de stapel.
      Opmerking: Specifieke instellingen, zoals laser macht en pixel nadruktijd, afhankelijk van de diepte in het weefsel, de specifieke weefsel gebruikt en het imaging systeem. Elke aanvraag moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke imaging systeem gebruikt. Terwijl het is essentieel om een efficiënt photoactivation in de stack, moet worden gezorgd om het niet te photodamage de cellen.
   6. Ga terug naar 940 nm excitatie golflengte en heropenen van kanalen. Scannen via de schoorsteen om efficiënte photoactivation in de gehele (figuur 4B) en gebrek aan photodamage (diffuse, niet-cel-begrensd PA-GFP-signaal, donkere vlekken of hoge mate autofluorescence op het gebied van de photoactivated) te bevestigen.
   7. Gaat u verder met de photoactivate van alle relevante weefsels in de beeldvorming zaal, dan onmiddellijk terug aan ijs totdat zij worden verwerkt. Ga verder met de photoactivation van extra imaging kamers.
      Opmerking: Explanting van weefsel-, montage- en met name photoactivation zijn tijdrovende processen, maar de totale turn-around tijd moet worden beperkt tot 4-6 uur, om te voorkomen dat een dramatische afname van de levensvatbaarheid van de cellen.

7. herstel en analyse van photoactivated cellen

1. Extractie van lymfocyten van lymfklieren en de milt
   1. Voor elk monster photoactivated, een dienovereenkomstig gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis met 500 µL van BM buffer op ijs te bereiden. Monsters van een niet-PA-GFP-besturingselement en een niet-geactiveerde PA-GFP muis omvatten. Dit kan worden bereikt door één B6-besturingselement en een PA-GFP controle muis.
   2. Verwijder voorzichtig de bovenste cover slip uit de imaging zaal, verzorgen te handhaven van de positie van de steekproeven (als meerdere monsters in een enkele kamer aanwezig zijn), en elk monster in haar respectieve monsterbuisje plaatsen.
   3. Met behulp van een stamper-homogenizer, het weefsel knijp en draai de stamper in de buis vrij te geven van de lymfocyten. Met behulp van een micropipet, de lysate gecombineerd en filtreer door een 70 µm cel zeef in een frisse, vooraf gekoelde 1,5 mL microcentrifuge buis. Voor lymfeklier monsters, wip voor trede 7.1.5.
   4. Voor monsters van de milt, centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in een swingende emmer rotor. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van RBC lysis-buffermengsel. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, dan Voeg 800 µL van ijskoude BM buffer en gaat u verder met stap 7.1.5.
   5. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in een swingende emmer rotor. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 200 µL van ijskoude BM buffer. De monsters zijn nu klaar voor kleuring voor stroom cytometrische evaluatie en sorteren, indien gewenst.
2. Kleuring voor stroom cytometrische evaluatie
   Opmerking: Deelvenster voorgesteld: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A647, CD38-PE-Cy7, Fixable levensvatbaarheid kleurstof Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Niet-geactiveerde PA-GFP wordt gedetecteerd in de Pacific oranje (of gelijkwaardig) kanaal. Photoactivated PA-GFP is in het GFP-kanaal gedetecteerd. Elke co gezuiverde macrofagen (dit kunnen dan misschien niet geweest in vivo aangeduid met CD169-PE) kunnen worden uitgesloten door kleuring met CD169-PE en dit te gebruiken als een dump-gate.
   1. Met behulp van een micropipet, voeg 100 µL celsuspensie per putje voor elk monster hersenschim en controle in een 96-wells-plaat.
   2. Voor de B6 controlemonsters; toevoegen 50 µL van dit materiaal voor onbevlekt controle en één gekleurd-controleputjes. Voor het besturingselement niet-geactiveerde PA-GFP-honkslag gebeitste bovendien toevoegen 50 µL van onbevlekt niet-geactiveerde PA-GFP monster. Zwembad voor de geactiveerde PA-GFP single gebeitste controle, het resterende materiaal voor alle photoactivated monsters.
   3. Aan elk putje, voeg 100 µL van buffer (onbevlekt en PA-GFP compensatie besturingselementen), één antilichaam (single gebeitste compensatie controles) of mix (photoactivated monsters) van de antilichaam. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
   4. Centrifugeer bij 200 x g 5 minuten bij 4 ° C. Ledig de buffer. Voeg 200 µL van BM buffer aan elk putje en Centrifugeer nogmaals om te wassen. Ledig de buffer en resuspendeer de cellen in elk putje in 200 µL van BM buffer. De monsters zijn nu klaar voor analyse op een cytometer van de stroom of de sorter (representatieve resultaten in Figuur 5).

Resultaten

Generatie van gemengde beenmerg Chimaera

Dit protocol behaalt krachtig gemengde beenmerg chimaeren met een chimerism in de buurt van-volledig in het compartiment B-cel zoals aangegeven in het representatieve resultaat in Figuur 1 (voor statistische significantie verwijzen wij u naar ¹²). De serotyping onthult genormaliseerde B-cel nummers op 6 weken post reconstitutie (figuur 1A), met een lage frequentie van 9D 11 (idiotype) positieve circulerende B-cellen die voortvloeien uit het compartiment van de 564Igi (figuur 1B). Binnen de totale lymfocyt poort, is er een lage frequentie van residuele ontvanger-afgeleide cellen, ~ 6% CD45.1 (Q1), met vermelding van een algehele mate van chimerism van ~ 94% (Figuur 1 c). Binnen de donor compartiment gaat roesten (CD45.1-, Q4 + Q3) de verhouding van 564Igi (Q4) naar PA-GFP (Q3) is ongeveer 23 tot 77%. Dit is iets lager dan input 33 tot 66% verhouding te door de zware negatieve selectie van B-cellen verklaren is afgeleid van de 564Igi compartiment ¹². Zoals te zien in Figuur 1 d, is er vrijwel volledig chimerism in het compartiment B-cel (99,9% CD45.1-) en de dominantie van PA-GFP beenmerg-afgeleide B cellen (Q3), dat een gevolg van de zware negatieve selectie van 564Igi-afgeleide B cellen is.

Oogst van weefsels, verwerking en evaluatie van stroom cytometrische

Figuur 2 en Figuur 3 tonen proceduresvoor en resultaten van explanting vers geïsoleerd lymfklieren en de milt segmenten. Figuur 4 geeft een representatief resultaat voor in vivo labeling en photoactivation van een enkele germinal center-ruimte in een segment transplanteren milt. Zoals te zien is (figuur 4A), de in vivo labelen met CD169-PE heeft krachtig gelabeld de marginale zone (rood, aangegeven door "MZ"). Het tweede signaal van de harmonischen is herkenbaar in de collageen-bevattende structurele elementen en grote schepen (blauw), met inbegrip van de centrale arteriole van de lymfoïde schede van periarteriolar (PALS). Zeer autofluorescent, geactiveerde tingible-body macrofagen worden geassocieerd met germinal center activiteit (pijlpunten). Samen genomen, kunt de identificatie van de marginale zone, PALS en tingible-body macrofagen, identificatie van een regio van belang waarin waarschijnlijk een enkele germinal centrum. De regio van belang is photoactivated zoals geïllustreerd in figuur 4B. Zoals aangetoond, is photoactivation microanatomically nauwkeurige⁹, opbrengst van een bepaald gebied van de activering. De gepresenteerde resultaten bovendien dienen als bevestiging van een hoge dichtheid van PA-GFP + lymfocyten in het gereconstitueerde Chimaera en de aanwezigheid van spontane germinal centra. Stroomafwaarts stroom cytometrische evaluatie verder bevestigt genormaliseerde B-cel compartiment getallen (figuur 5D), een spontane germinal center bevolking (figuur 5E) en de aanwezigheid van een subset van germinal center B-cellen die zijn geweest photoactivated (figuur 5F).

Dus, dit protocol presenteert een robuuste methode voor generatie van gemengde beenmerg chimaeren met spontane autoreactieve germinal centra, die overwegend zijn samengesteld uit wild-type afgeleide B-cellen die een verslaggever van de photoactivatable. Dit zorgt op zijn beurt voor downstream analyses van individuele germinal centra (grafisch overzicht in Figuur 6).

Figuur 1: Flow cytometrische evaluatie van de mate van chimerism in het bloed van 564Igi (CD45.1-, PA - GFP-): PA-GFP (CD45.1-, PA-GFP +) gemengd Chimaera in dodelijk bestraalde CD45.1 ontvangers (CD45.1 +, PA - GFP-), 6 weken post reconstitutie. A) Plot tonen gating B220 + B-cellen, vooraf gated op singlet lymfocyten. B) Subgate van perceel A, weergegeven: 9D 11 + (idiotype) frequentie binnen de B-celpopulatie. C) Plot van PA-GFP versus CD45.1, vooraf gated op singlet lymfocyten. D) Plot van PA-GFP versus CD45.1 in de subgate van de B-cel van perceel A. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Procedure voor het verzamelen en montage popliteale lymfklieren voor beeldvorming en photoactivation. A) een insnijding gemaakt onder de knie en verlengd tot en met het heupgewricht, en de randen aan de zijkanten, om de popliteale fossa (pijlpunt) bloot zijn ingetrokken. B) het eventuele fatpad wordt geopend en de popliteale lymfeklier is blootgesteld (pijlpunt). C) de popliteale lymfeklier wordt opgehaald uit de fossa. D) de procedure wordt herhaald voor de contralaterale zijde en beide knooppunten zijn gemonteerd in een ' double-sided dekglaasje aan/vacuüm-vet kamer gevuld met BM buffer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Procedure voor het verzamelen en montage van de milt voor beeldbewerking en photoactivation. Een) een insnijding wordt gemaakt op de voorste mediale lijn net onder de ribbenkast en uitgebreid rond het lichaam naar de achterste axillaire lijn, en de randen zijn ingetrokken om het topje van de milt (pijlpunt) bloot te stellen. B) de milt is ingetrokken en weggesneden en snijd in plakjes van dun (1-2 mm), die zijn gemonteerd in een ' double-sided dekglaasje aan/vacuüm-vet kamer gevuld met BM buffer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Photoactivation. A) twee-foton opname voor een germinal center in de milt voor photoactivation. In vivo labelen met anti-CD169-PE werd uitgevoerd vóór de oogst van de milt aan het label van de marginale zone (rood, aangegeven door "MZ"). De tweede harmonischen signaal blijkt in collageen-bevattende structuren die zijn gekoppeld aan de omhulling en de grote schepen (blauw). Pijlpunten identificeren zeer autofluorescent, geactiveerde tingible-body macrofagen germinal center activiteit is gekoppeld. Imaging werd uitgevoerd in 940 nm excitatie. Schaal geeft de balk in de linker bovenhoek 200 µm. B) A, maar na photoactivation op 830 nm. Photoactivated cellen zijn nu zichtbaar (groen) in een bepaald gebied van belang dat wordt begrensd door de marginale zone en omvat de eerder geconstateerde tingible-body macrofagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: Flow cytometrische analyse van photoactivated germinal center B cellen. A) Plot van forward versus kant spreidings- en lymfocyt poort. B) Plot van voorwaartse scatter gebied als een functie van voorwaartse scatter hoogte binnen de lymfocyt poort en resulterende singlet poort. C) levensvatbaarheid kleurstof uitsluiting perceel binnen het singlet poort, en de resulterende levende cellen poort. D) Gating B220 + B cellen. E) Gating germinal center B-cellen, geïdentificeerd als CD38lo GL7hi cellen binnen de B220 + poort. F) Gating photoactivated cellen in de GC B-celpopulatie, geïdentificeerd als de subset van cellen samen uiting geven aan niet-geactiveerde en photoactivated PA-GFP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: grafisch overzicht van het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Een groot aantal lymfkliertest modellen van autoimmuniteit beschikbaar zijn, waarvan vele presenteren met spontane germinal centra¹⁶. Echter, veel van de beschikbare modellen haven complexe genetische achtergronden of mutaties in centrale regelgevers van lymfocyt proliferatie of activering, waardoor ze slecht geschikt voor intercrossing met verslaggever lijnen en studies van normale lymfocyt gedrag in autoimmuniteit, respectievelijk. Het huidige model, integendeel, laat een 'plug-and-play' benadering van grondige analyses van autoreactieve wild-type-afgeleide germinal center B cellen met elke gewenste combinatie van transgenen, knock-outs en verslaggevers, in het onderhavige geval vertegenwoordigd door photoactivatable GFP. Met behulp van in vivo labeling strategieën, kunnen interne germinal centra worden gevisualiseerd in transplanteren lymfoïde weefsels en hun cellulaire bestanddelen photoactivated met behulp van een twee-foton microscoop. Photoactivated lymfocyten van één germinal centra kunnen vervolgens geanalyseerd of gesorteerde stroom cytometrically, als afzonderlijke cellen of in bulk. Deze cellen kunnen vervolgens worden onderworpen aan extra downstream moleculaire en functionele analyses te bieden van nieuwe inzichten op het gebied van auto-immuniteit.

Er zijn enkele kritische stappen voor de succesvolle uitvoering van deze procedure. Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, bestraling (1.100 Rad) en donor beenmerg reconstitutie vervangen met succes het compartiment van de ontvangende beenmerg oplevert in de buurt van-volledige chimerism in het compartiment B-cel. Dit is een belangrijk punt, zoals residuele ontvanger-afgeleide B cellen van een subset van de populatie germinal center maken zou 'donker'. Ongeacht de bron voor bestraling gebruikt, moet de dosis/timing van bestraling worden geoptimaliseerd om maximale myeloablative effect met minimale collaterale weefselschade zwichten voor de dieren. Voor reconstructie, het bot-crush-protocol en de reconstitutie met 20 miljoen totale donor cellen geconstateerd krachtig opbrengst hoge reconstitutie graden. Werken van steriele en koude/op ijs voor de extractie van het beenmerg zorgt voor een hoge levensvatbaarheid van de donor beenmerg. Om te bereiken de gewenste donor beenmerg ratio's, is het essentieel te oefenen grote zorg wanneer tellen aliquots van cellen, zowel voor de telling zelf en bij het nemen van uit de deelsteekproef van het beenmerg om te tellen. Mengen en co pillering de donor courgettes, in plaats van centrifugeren en resuspending afzonderlijk en dan mengen, dient om te voorkomen dat eventuele schuintrekken in donor verhoudingen na het tellen van de cel.

De gemengde beenmerg chimera generatie van het protocol kan stand-alone en hierdoor generatie chimaeren met autoreactieve germinal centra met gewenste verslaggever, transgenic of knock-out. Een beperking hieraan is echter de noodzaak om histocompatibel donoren. De 564Igi-stam is op een C57Bl/6J congenisch achtergrond, en dientengevolge de andere donor en de ontvangers moeten hebben een achtergrond van de congenisch H-2b (of als alternatief, de 564Igi-stam moet worden backcrossed naar de gewenste spanning en het auto-immune fenotype gecontroleerd op de nieuwe achtergrond). De bestraling procedure neiging om het voordeel van een tolerogenic omgeving¹⁷, en incongruenties in sommige kleine histocompatibility antigenen kunnen worden getolereerd. Echter moet dit aspect grondig overwegen, met name als mengen van mannelijke en vrouwelijke donoren en/of ontvangers, als gevolg van het potentieel voor vrouwelijke reactiviteit met man-beperkte Y-antigenen.

Ook het aspect van de photoactivation van het protocol kan zelfstandig, en kan worden gebruikt in vele verschillende contexten. Echter is de PA-GFP-verslaggever is momenteel alleen beschikbaar met de promotor van UBC, die actief is in alle cellen van de hematopoietische afkomst, maar niet in stromale cellen. Zoals vermeld in de inleiding, andere photoactivatable, photoswitchable of photoconvertible verslaggever stammen zijn beschikbaar, en kunnen worden vervangen door PA-GFP, met de juiste aanpassing van de experimentele omstandigheden.

Het is belangrijk om te voorkomen dat onbedoelde photoactivation van ongewenste gebieden, door het behoud van de laser ruim boven de 900 nm wanneer imaging, als deze golflengte zal niet photoactivate PA-GFP. Voor de photoactivation zelf, specifieke instellingen, zoals laser macht en pixel nadruktijd, hangt af van de diepte in het weefsel en de specifieke weefsel gebruikt de imaging systeem en elke toepassing moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke imaging systeem gebruikt. Let erop niet aan photodamage de cellen, maar het is tegelijkertijd noodzakelijk om efficiënte photoactivation in de stack, om een voldoende vertegenwoordiging van geactiveerde cellen voor downstream analyses. Germinal center B-cellen in het algemeen vormen overal van 0,5% tot ~ 2% van de milt of cutane lymfeklier B-cellen, en kan worden gezien vanaf de representatieve resultaten (Figuur 5), photoactivated één germinal center B cellen ~ 1% van de totale kunnen make-up bevolking in een enkele milt segment aanwezig. Succesvolle analyse of sorteren van een aanzienlijk aantal cellen vereist daarom een groot aantal gebeurtenissen te verwerken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibody, 9D11-A568	In-house generated		9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647	In-house generated		9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1	Biolegend	110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker)	Biolegend	144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1)	Biolegend	142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38	Biolegend	102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220	Biolegend	103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized	Fisher Scientific	211766
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Conical tubes, 50 mL	Falcon	352235
Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm	Thermo Fisher Scientific	22X22-1
EDTA	Merck	1,084,180,250
Ethanol, 70%	VWR	8301.360
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270106
Flow cytometer, FACS Canto II	BD Biosciences	338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP	BD Biosciences	-	Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning	VWR	DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk	VWR	630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet.	Orion Pharma	9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media)	Cedarlane	CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf)	Sarstedt	72.690.550
Microscope, Two-photon	Prairie Technologies (now Bruker)	-	Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml	VWR	410-0110
NaHCO3	Merck	1063290500
Needle, 18 gauge	BD Medical	304622
NH4Cl	VWR	87,769,290
PBS	Sigma	d8537
Pestle homogenizer	VWR	47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm	VWR	410-0122
Pipette, Serological, 10 ml	VWR	612-3700
Pipette, transfer, plastic	Sarstedt	861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M)	Bemis	PM996
Plate, 96-well	Falcon	353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps	FST - Fine Science Tools	91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps	FST - Fine Science Tools	91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight	FST - Fine Science Tools	91460-11
Syringe, 10 mL	Terumo	SS-10ES1
Syringe, 20 mL	Terumo	SS-20ES1
Syringe, 5 mL	Terumo	SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc	BD Medical	324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml	MSD Animal health	431577
Trypan blue solution, 0.4%	VWR	K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	65-0865-14