Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Opsonophagocytic doden Assay te beoordelen van de immunologische reacties tegen bacteriële pathogenen

13.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59400

⸱

5 april 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Molecular Medicine and Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

In dit artikel

Samenvatting

Deze opsonophagocytic doden test wordt gebruikt om te vergelijken het vermogen van fagocytische immuuncellen reageren op en doden van de bacteriën op basis van verschillende behandelingen en/of voorwaarden. Klassiek, dient deze bepaling als de gouden standaard voor het beoordelen van effector functies van antilichamen tegen een bacterie als opsonin aan de orde gesteld.

Samenvatting

Een belangrijk aspect van de immune reactie op bacteriële kolonisatie van de host is fagocytose. Een opsonophagocytic doden assay (OPKA) is een experimentele procedure waarin fagocytische cellen mede gekweekte met bacteriële eenheden zijn. De immune cellen zal phagocytose en doden van de bacteriële culturen in een aanvulling-afhankelijke manier. De efficiëntie van het doden van de immuun-gemedieerde cel is afhankelijk van een aantal factoren en kan worden gebruikt om te bepalen hoe verschillende bacteriële culturen vergelijken met betrekking tot resistentie tegen celdood. Op deze manier kan de werkzaamheid van potentiële immuun gebaseerde therapeutics tegen specifieke bacteriestammen en/of serotypen worden beoordeeld. In dit protocol beschrijven we een vereenvoudigde OPKA dat gebruik maakt van fundamentele kweekomstandigheden en cel tellen om te bepalen van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen na co cultuur met behandeling voorwaarden en HL-60 immuuncellen. Deze methode is met succes gebruikt met een aantal verschillende pneumokokken serotypen, kapselvorming en acapsular stammen, en andere bacteriële soorten. De voordelen van dit protocol OPKA zijn zijn eenvoud, veelzijdigheid (zoals deze bepaling niet beperkt tot antilichaam behandelingen als opsonins is), en minimalisering van tijd en reagentia te beoordelen van experimentele basisgroepen.

Inleiding

De opsonophagocytic doden assay (OPKA) is een essentiële tool voor wijzigingen in de bacteriële structuur of functie te koppelen aan latere wijzigingen in de immuunrespons en functie. Als zodanig, wordt het vaak gebruikt als een aanvullende test om te bepalen van immuun gebaseerde werkzaamheid van antilichaam behandelingen, vaccin kandidaten, enzym optimalisatie, enz. Terwijl in vivo tests nodig zijn om te bepalen van de effectieve goedkeuring of bescherming in het model van een bacteriële infectie, de OPKA kan worden gebruikt voor het beoordelen van immuun bijdrage tot de bacteriële celdood op het meest elementaire componenten: bacteriën, immune cellen, en experimentele behandelingen. Eerdere studies hebben aangetoond dat OPKAs kan worden bewerkt en voor een verscheidenheid van bacteriën en serotypen gebruikt, met inbegrip van1van de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Bovendien, deze geoptimaliseerde testen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de verschillende experimentele behandelingen, met inbegrip van de mogelijkheid van een enzym dat de bacterie meer toegankelijk maken voor aanvulling-gemedieerde immuun cellen4 en antilichaam behandelingen te verbeteren opsonization5. Klassiek, OPKA assay is met succes gebruikt in fundamenteel en klinisch onderzoek instellingen als een krachtige indicator voor bescherming geïnduceerd door pathogeen-specifieke antilichamen6,7,8,9 .

Verschillende soorten immuuncellen kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van opsonophagocytic doden. Een veelgebruikte fagocytische bevolking is de HL-60 menselijke leukemische cellijn. Deze cellijn kan worden gehouden als geïnactiveerd promyelocytes in cultuur; ze kunnen echter worden gedifferentieerd in verschillende geactiveerde Staten via verschillende drug behandelingen10,11. Behandeling van HL60 met N, N-dimethylformamide onderscheidt de cellijn in geactiveerde neutrofiele granulocyten met sterke fagocytische activiteit11. Terwijl HL-60-cellen zijn geoptimaliseerd en vaak voor deze fagocytose testen10 gebruikt worden, kunnen de andere primaire polymorfonucleaire leukocyten worden gebruikt als immuun arm van het experiment12.

Daarnaast kunnen deze gehaltebepalingen vereenvoudigde13 of14 te kijken naar meerdere antibiotica-resistente stammen van de bacteriën te beproeven multiplexed. De multiplexed methode geboekt meer haalbaar door de ontwikkeling van de software die efficiënt bacteriële kolonievormende eenheden (CFUs) per plek op een agar plaat15kan rekenen. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methode met behulp van een bacteriële stam, HL-60 cellen baby konijn aanvulling en bloed agar platen. Met deze methode kunnen meerdere behandelingen snel worden beoordeeld om specifieke onderzoeksvragen op hoe de ingeboren immune reactie op bacteriële infectie kan worden gedifferentieerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. cultuur, differentiatie en validatie van de HL-60-cellen

  1. HL-60 cel cultuurmedia 500 mL RPMI met L-glutamine en 50 mL warmte-geïnactiveerd foetale runderserum verder uit te bereiden. Voeg geen antibiotica als dit van invloed kan zijn op de differentiatie van de HL-60-cellen.
  2. Voor vermeerdering/onderhoud van HL-60-cellen ontlucht cultuur 5 x 106 cellen in 10 mL van de HL-60 cel voedingsbodems in 75 cm,2 kolven op 37 ° C en 5% CO2. Passage cellen de dagen van elke 3−4 te handhaven optimale cel concentraties.
    Opmerking: De cel concentratie mag niet hoger zijn dan 5 x 106/mL.
  3. Genereren werken voorraden HL-60-cellen door aliquoting ongeveer 1 x 106 cellen/mL in HL60 voedingsbodems met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) in 1 mL cryogene buizen.
    Opmerking: Werkende voorraden kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C. De master voorraad moet worden opgeslagen bij-120 ° C.
  4. Onderscheiden HL-60-cellen door kweken 1.5 x 107 cellen in HL-60 cel voedingsbodems met 0,6% N, N-dimethylformamide (DMF) 15 mL bij 37 ° C en 5% CO2 in steriele filter-afgetopte 75 cm2 kolven voor 3 dagen vóór de OPKA.
  5. Valideren dat de HL-60-cellen met succes ligt in gedifferentieerde zijn en geschikt voor gebruik in de OPKA test zijn door het testen van de levensvatbaarheid en de oppervlakte markers cel volgens gevestigde stroom cytometry protocollen16,17, 18,19. Na differentiatie, oogst HL-60-cellen en ongeveer 1 x 104 cellen met fluorescently-geconjugeerde antilichamen/vlekken vlek voor CD71, CD35, Annexine V en propidium jodide.
    Opmerking: Gedifferentieerde cellen moet ≥65 levensvatbare, ≥55% CD35+, en ≤20% CD71+ zoals bepaald door de gevestigde validatie protocollen14 (Figuur 1).

2. bereiding van OPKA Buffers en reagentia

  1. Bereid 50 mL steriele opsonization buffer B (OBB) door het mengen van 42,5 mL steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca2 +/Mg2 +5 mL foetale runderserum warmte-geïnactiveerd, en 2,5 mL 0,1% steriele gelatine. Bewaren bij 4 ° C.
  2. Verkrijgen van baby konijn aanvulling en opslaan bij-80 ° C.
  3. Verkrijgen of bereiden bacteriecultuur platen (dat wil zeggen, 15 x 100 mm2 5% schapenmelk bloed agar platen).

3. bereiding van de bacteriële voorraad monsters

  1. Het verkrijgen van een voorraad van de bacteriële strain(s) te beproeven.
    Opmerking: Voor dit protocol, serotype 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, gulle wijze aangeboden door Dr. Moon Nahm) wordt gebruikt.
  2. Groeien de bacteriële stam in een passende Bouillon (dat wil zeggen, Todd-Hewitt Bouillon + 0,5% gistextract voor deze soort WU2) voor ongeveer 2−4 h bij 37 ° C.
    Opmerking: De optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van de cultuur moet tussen 0,6 en 0,8.
  3. De bacteriën door centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 2 min pellet en resuspendeer de cellen in de 10−30 mL 15% glycerol in de passende Bouillon. Aliquot de bacteriecultuur (500 µL per aliquot) in steriele 1,5 mL centrifuge buizen en winkel bij-80 ° C.
  4. Één flacon van bacteriële voorraad in een waterbad 37 ° C ontdooien. De bacteriecellen pellet en resuspendeer in 500 µL van OBB onder steriele omstandigheden.
  5. Maak verschillende verdunningen van het bacteriële materieel in OBB (dat wil zeggen, 10 µL van geen verwatering, 10 µL van 1:10, 10 µL van 1:100, enz.). Voert de OPKA assay (secties 4 – 6, inclusief HL-60/aanvulling co cultuur) zoals beschreven hieronder met behulp van verschillende verdunningen van de onbehandelde bacteriële voorraad. Cultuur van de platen 's nachts bij 30 ° C (CO2).
    Opmerking: De temperatuur van 30 ° C is specifiek voor WU2 ter voorkoming van overmatige groei; andere stammen/serotypen kunnen groeien optimaal bij 37 ° C.
  6. Tellen de kolonies voor elke verdunning van onbehandelde bacteriële voorraad samen met HL-60-cellen en aanvulling worden gekweekt. Bepalen welke verdunning van bacteriën levert het optimale aantal aftelbare koloniën (ongeveer 80−120 CFUs voor onbehandelde bacteriën samen gekweekt met HL-60-cellen). Opmerking deze verdunning voor toekomstige OPKAs waarbij deze bacteriële voorraad.

4. bacteriële behandeling en cultuur

  1. Ontdooi een buis van bacteriële voorraad bereid in stap 3.3. Pellet bacteriën (6.000 x g gedurende 2 minuten) en resuspendeer de pellet cel in OBB bij optimale verdunning zoals bepaald in stap 3.6.
  2. Pipetteer 10 µL van de geresuspendeerde bacteriële verdunning per putje in een ronde-onderste 96-Wells cel cultuur plaat.
  3. Voeg 20 µL van passende antilichaam of drug behandeling aan elk experimentele putje in tweevoud.
    Opmerking: In dit protocol, een serotype-specifieke antilichaam gegenereerd in muizen wordt toegevoegd als behandeling X en een glycoside hydrolase enzym bekend te degraderen de serotype 3 polysaccharide capsule is toegevoegd als behandeling204,Y (Figuur 2). Voor controleputjes, gebruikt u 1 x PBS of OBB, afhankelijk van de buffer die wordt gebruikt voor de behandeling putten.
  4. Schud de plaat van de steekproef van ongeveer 90 toeren per minuut gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Pas deze afhankelijk van de optimale temperatuur of schudden van de toestand van de behandelingen wordt getest.

5. HL-60 bacteriecultuur co

  1. HL-60-cellen voor te bereiden door de HL-60 gedifferentieerde cellen die zijn behandeld met DMF drie dagen vooraf (zie stap 1.4) in 15 mL conische buizen te oogsten. Pellet van de cellen (500 x g, 3 min), verwijder het supernatant en wassen met ten minste 10 mL 1 x PBS.
  2. Pellet de gewassen cellen (500 x g, 3 min), verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de OBB (begin met 1 mL OBB- en aanpassen voor een eindconcentratie van 1 x 107/mL na het tellen van de cel).
  3. Baby konijn aanvulling (steriel, onverdund baby konijnenserum, leeftijd 3−4 weken) toevoegen aan een eindvolume van 1:5.
    Opmerking: De uiteindelijke concentratie van de HL-60-aanvulling mengsel moet 1 x 107/mL. Als aanvulling afhankelijkheid wilt testen, een tweede oplossing met actieve HL-60-cellen met warmte-geïnactiveerd aanvulling kan worden gebruikt (aanvulling kan worden geïnactiveerd door broeden in een waterbad op > 55 ° C gedurende ten minste 30 minuten).
  4. Na 1 h bacteriecultuur is voltooid (stap 4.4), verdeel elk monster (dat wil zeggen, 10 µL van elk 30 µL monster goed in twee nieuwe waterputten) in dubbele putten voor twee groepen (gebruik bijvoorbeeld slechts 20 µL van de oorspronkelijke 30 µL co cultuur ter verantwoording voor pipetting fout) : één set zal mede gekweekte met HL-60-aanvulling en een zal alleen bacteriën bevatten. Voeg 50 µL van het mengsel van de HL-60-aanvulling (uit stap 5.3) op elke experimentele verzameling van putten (gedelegeerde + HL-60); Breng 50 µL van OBB alleen in de putjes van bacteriën slechts (gedelegeerde -HL-60).
    Opmerking: In dit voorbeeld worden ongeveer 800 bacteriële CFUs gebruikt voor de initiële co cultuur met 5 x 105/50 µL HL-60-cellen. Als deze veelheid aan infectie is te hoog of te laag zoals aangegeven door de nummers van de laatste kolonie, past u de eerste bacteriële verdunning in tegenstelling tot de HL-60 cel tellen.
  5. Schud de 96-wells-plaat bij 37 ° C gedurende 1 h (CO2).

6. voorbeeld van Plating en overnachting incubatie

  1. Verdun elk goed 1:5 met OBB, zodat elk monster een volume van minstens 50 µL heeft.
  2. Pipeteer 50 µL van elk monster rechtstreeks naar een aangewezen gebied voor een bacteriecultuur plaat, zorgen voor voldoende ruimte tussen de monsters. Voor 15 x 100 mm ronde2 agar platen, Pipetteer ongeveer 4 monsters op een bord.
  3. Dekken en laat monsters gedurende ongeveer 15 minuten bij kamertemperatuur drogen.
  4. Omkeren platen en cultuur overnachting bij 30 ° C (CO2). U kunt ook cultuur platen in anaërobe potten om te testen of zuurstofvrije omstandigheden de groei van bacteriën beïnvloeden of besturingselement voor morfologie.
  5. Na overnachting cultuur, tellen de kolonies in elke aangewezen voorbeeldgebied. Gegevens analyseren door het vergelijken van het aantal levende cellen in elke set de overeenkomstige controle en/of de monsters die niet co cultuur van de cel van de HL-60 ontvangt (kenmerkend voor de overleving van de cel van de 100%, 0% cel doden).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Validatie van de HL-60 differentiatie moet worden uitgevoerd voordat de OPKA. Dit kan worden bereikt met behulp van stroom cytometry om te bepalen van de extracellulaire uitdrukking van CD11b, CD35, CD71 en Annexine V (Figuur 1). Propidium jodide kan ook worden gebruikt als een marker van de levensvatbaarheid. Na behandeld met DMF voor 3 dagen, uitdrukking van CD35 moet worden verhoogd (≥55% van alle cellen) en expressie van CD71 moet worden verlaagd (≤20% van alle cellen). Het percentage An...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

OPKAs dienen een essentiële rol bij de beoordeling van antilichaam gemedieerde immuunreacties geïnduceerd door vaccinaties6,8. De belangrijkste betekenis van dit vereenvoudigde OPKA is het aanpassingsvermogen in de voorwaarden te beproeven (dat wil zeggen, antilichamen, enzym behandelingen, enz.). In deze zin, terwijl deze bepaling kan worden gebruikt voor het testen van de bijdrage van opsonins (dat wil zeggen, antistoffen) in fagocytose, kan het ook worden gebr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Moon Nahm (Universiteit van Alabama Birmingham) voor zijn onschatbare hulp bij het vaststellen van OPKA testen in ons laboratorium. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid Grant 1R01AI123383-01A1 naar FYA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Annexin V (APC conjugated)BioLegend640919
anti-CD35, human (PE conjugated)BioLegend333405
anti-CD71, human (PE conjugated)BioLegend334105
bacteriestam die gebruikt moet worden (d.w.z. Streptococcus pneumoniae, WU2)Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) 
bloedbouillon platenHardy DiagnosticA10
Fetal Clone serumHyCloneSH30080.03
glycerolSigmaG9012-1L
HL-60 cellenATCCCCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated)BioLegend400907
N,N-dimethylformamide (DMF)Fisher ChemicalUN2265
propidiumjodideSigmaP4864
RPMI media met L-glutamineCorning10-040-CV

Referenties

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

HL60-celdifferentiatiebacteriële fagocytoseflowcytometrie-analyseStreptococcus pneumoniaecomplement-afhankelijke dodingcolony forming unitsco-cultuur van immuuncelleneffecten van geneesmiddelenbehandelingbeoordeling van bacteriële klaring
Opsonophagocytic doden Assay te beoordelen van de immunologische reacties tegen bacteriële pathogenen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.