$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
RABV-geïnfecteerde, PFA-vaste gearchiveerde hersen materiaal werd gebruikt. De respectieve dierexperimentele studies werden geëvalueerd door de verantwoordelijke dierenzorg, het gebruik en de ethische commissie van het staatsbureau voor landbouw, voedselveiligheid en visserij in Mecklenburg-Voor-Pommeren (LALFF M-V) en hebben goedkeuring gekregen met machtigingen 7221.3-2.1-002/11 (muizen) en 7221.3-1-068/16 (fretten). De algemene zorg en methoden die bij de dierproeven worden gebruikt, zijn volgens de goedgekeurde richtsnoeren uitgevoerd.
Let op: dit protocol maakt gebruik van verschillende toxische en/of schadelijke stoffen, waaronder PFA, methanol (MeOH), waterstofperoxide (H2O2), natrium natriumazide (Nan3), TBA, BA, BB en DPE. MeOH en TBA zijn zeer licht ontvlambaar. Vermijd blootstelling door het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (een Labcoat, handschoenen en oogbescherming) en het uitvoeren van experimenten in een rook afzuigkap. Verzamel afval afzonderlijk in geschikte containers en gooi het weg volgens de lokale voorschriften. Rabiësvirus is geclassificeerd als een bioveiligheidsniveau (BSL)-2 pathogeen en kan, daarom, over het algemeen worden behandeld onder BSL-2 voorwaarden. Sommige activiteiten, waaronder procedures die aërosolen kunnen genereren, werken met hoge virus concentraties of werken met roman lyssavirussen, kunnen BSL-3-classificatie vereisen. Pre-exposure profylaxe wordt aanbevolen voor risicovolle personeel, met inbegrip van dierenverzorgers en laboratoriummedewerkers18,19. Raadpleeg de voorschriften van de lokale overheid.
1. fixatie van hersenweefsel en snijden
- Repareer hersen monsters in een geschikt volume van 4% PFA in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS [pH 7,4]) voor ten minste 48 uur bij 4 °C (met een geschatte weefsel-tot-fixerende verhouding van 1:10 [v/v]).
- Was de weefselmonsters 3x in PBS gedurende ten minste 30 min elke was en bewaar ze in 0,02% NaN3/PBS bij 4 °c tot het gebruik.
- Sectie het weefsel in 1 mm dikke delen met behulp van een vibratome (Blade feed rate: 0.3 – 0.5 mm/s, amplitude: 1 mm, segment dikte: 1.000 μm).
- Om de juiste segment volgorde te behouden, moet u elke weefsel sectie afzonderlijk opslaan in een put van een multi well-celkweek plaat. Voeg 0,02% NaN3/PBS toe en bewaar de weefsel secties bij 4 °c tot het gebruik.
2. monstervoorbehandeling met methanol
Opmerking: Voer alle incubatie stappen uit met zachte oscillatie en, indien niet anders aangegeven, bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht. De voor behandeling van het monster dient het algemene doel van het verbeteren van de antilichaam diffusie en het verminderen van weefsel autofluorescentie door blootstelling aan MeOH en H2O2, respectievelijk14.
- Bereid 20% (v/v), 40%, 60% en 80% MeOH-oplossingen in gedistilleerd water. Bijvoorbeeld, voor 20% MeOH, voeg 10 mL 100% MeOH toe aan 40 mL gedistilleerd water in een geschikt afsluitbare vat en meng door het te inverteren.
- Breng de monsters over naar redelijk grote vaten (bijv. 5 mL reactie buizen). Zorg voor het gebruik van materialen die chemisch resistent zijn voor de reagentia die in dit protocol worden gebruikt. Bijvoorbeeld, merk op dat terwijl polypropyleen geschikt is, polystyreen is niet.
Opmerking: de volume specificaties in dit protocol verwijzen naar 5 mL reactie buizen. Als een ander vat wordt gebruikt, past u de volumes dienovereenkomstig aan.
- Inbroed de monsters in 4 mL van elke concentratie van de bereide reeks MeOH-oplossingen in oplopende volgorde van elk 1 uur.
- Inincuberen de monsters 2x voor 1 h elk in puur (100%) MeOH.
- Koel de monsters af tot 4 °C (bijv. in een laboratorium veilige koelkast).
- Bereiding bleek oplossing (5% H2o2 in meoh) door bijvoorbeeld een 30% h2o2 stockoplossing te verdunen bij 1:6 in pure (100%) MeOH, en chill het op 4 °C.
- Verwijder de 100% MeOH uit de gekoelde monsters en voeg 4 mL voorgekoelde bleek oplossing (5% H2O2 in meoh) toe. Inincuberen op 4 °C.
- Ruil de bleek oplossing in voor 4 mL 80% MeOH en inincuberen gedurende 1 uur. Gebruik de bereide reeks MeOH-oplossingen in aflopende volgorde voor 1 uur per stuk totdat de monsters gedurende 1 uur in 4 mL van 20% MeOH zijn geïnbroed.
- Was de monsters 1x voor 1 uur met 4 mL PBS.
3. immunokleuring
Opmerking: Voer alle incubatie stappen uit met zachte oscillatie en, indien niet anders aangegeven, bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht. Om microbiële groei te voorkomen, voegt u NaN3 toe aan een eindconcentratie van 0,02% aan de oplossingen in deze sectie. Weefselmonsters worden verder doordrongen door behandeling met nietionogene detergenten Triton X-100 en tween 20. Normaal serum wordt gebruikt om onspecifieke antilichaam binding te blokkeren. Glycine en heparine worden toegevoegd om de immunolabeling-achtergrond te verminderen14.
- Was de monsters 2x voor 1 h per stuk in 4 mL 0,2% Triton X-100/PBS.
- Permeabiliseer de monsters gedurende 2 dagen bij 37 °C met 4 mL 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M glycine/PBS.
- Blokkeer de niet-specifieke binding van antilichamen door de monsters gedurende 2 dagen te bebroed bij 37 °C in 4 mL 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% normaal serum/PBS.
Opmerking: gebruik het normale serum van dezelfde soort als het secundaire antilichaam werd verhoogd om ideale blokkerende resultaten te bereiken.
- Inincuberen de monsters in 2 mL primaire antilichaam oplossing (3% normaal serum/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 met heparine] + primair antilichaam/antilichamen) gedurende 5 dagen bij 37 °C. Vernieuw de primaire antilichaam oplossing na 2,5 dagen.
- Voor PTwH, reconstitueer het heparine natriumzout in gedistilleerd water om een 10 mg/mL stockoplossing te maken (Bewaar deze oplossing, alicgeciteerd, bij 4 °C). Voeg de stockoplossing toe aan 0,2% tween 20/PBS tot een eindconcentratie van 10 μg/mL.
Opmerking: het kiezen van de juiste antilichaam verdunning kan optimalisatie vereisen. Over het algemeen zijn standaard immunohistochemie concentraties een goed uitgangspunt.
- Was de monsters 1 dag in 4 mL PTwH, ruil de reinigings buffer ten minste 4x – 5x in de loop van de dag en laat de laatste wasbeurt 's nachts rusten.
- Inincuberen de monsters in 2 mL secundaire antilichaam oplossing (3% normaal serum/PTwH + secundair antilichaam/antilichamen) gedurende 5 dagen bij 37 °C. Vernieuw de secundaire antilichaam oplossing na 2,5 dagen.
- Verdun het secundaire antilichaam/antilichamen tegen 1:500 in secundaire antilichaam oplossing (d.w.z. 4 μL in 2 mL).
- Was de monsters 1 dag zoals beschreven in stap 3,5, waardoor de laatste wasbeurt 's nachts wordt verlaten.
4. nucleaire kleuring
Opmerking: Voer alle incubatie stappen uit met zachte oscillatie en, indien niet anders aangegeven, bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht. Als er geen nucleaire kleuring vereist is of als de excitatie golflengte/emissiespectrum van TO-PRO-3 vereist is voor de excitatie of detectie van een andere fluorophore, sla deze stap dan over.
- Verdun de nucleïnezuur vlek tot-PRO-3 bij 1:1000 in PTwH en inbroed de monsters in 4 mL kern kleurings oplossing gedurende 5 uur.
- Was de monsters 1 dag zoals beschreven in stap 3,5, waardoor de laatste wasbeurt 's nachts wordt verlaten.
Opmerking: na de wassen kunnen de monsters worden opgeslagen in PBS bij 4 °C tot de optische clearing.
5. weefsel clearing
Opmerking: Voer alle incubatie stappen uit met zachte oscillatie en, indien niet anders aangegeven, bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht. De weefselmonsters zijn gedehydrateerd in een gesorteerde reeks van TBA-oplossingen. Aangezien bij de immunokleuring waterige oplossingen nodig zijn, moeten alle kleurings procedures vóór de weefsel clearing worden voltooid. Optische klaring en brekingsindex matching worden bereikt door behandeling met een mengsel van BA, BB en DPE. De clearing oplossing wordt aangevuld met DL-α-tocoferol als een antioxidant13.
- Bereid 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% en 96% TBA-oplossingen in gedistilleerd water. Voeg bijvoorbeeld voor 30% TBA 15 mL 100% TBA toe aan 35 mL gedistilleerd water in een geschikt afsluitbaar vat en meng door inverting.
Opmerking: TBA heeft een smeltpunt van 25 – 26 °C; Dus, het neigt te zijn solide bij kamertemperatuur. Verwarm de goed afgedichte fles op 37 °C in een incubator of waterbad om TBA-oplossingen voor te bereiden.
- Dehydraat de monsters met 4 mL van elke concentratie van de bereide reeks TBA-oplossingen in oplopende volgorde voor elk 2 uur. Laat de 96% TBA 's nachts.
- Dehydraat de monsters verder in zuivere (100%) TBA voor 2 uur.
- Maak clearing Solution BABB-D15.
Opmerking: BABB-D15 is een combinatie van BA en BB (BABB) die wordt gemengd met DPE in een verhouding van x: 1, waarbij x is opgegeven in de naam van de oplossing, in dit geval 15.
- Meng voor BABB een deel BA met twee delen BB.
- Meng BABB en DPE in een verhouding van 15:1.
- Voeg 0,4 vol% DL-α-tocoferol (vitamine E) toe.
Opmerking: Meng bijvoorbeeld voor 20 mL BABB-D15 6,25 mL BA met 12,5 mL BB. Voeg 1,25 mL DPE toe en vul het aan met 0,08 mL DL-α-tocoferol.
- Wis de monsters in de klaringoplossing totdat ze optisch transparant zijn (2 – 6 h).
- De monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C in BABB-D15, beschermd tegen licht, tot montage en beeldvorming.
6. monster montage
- Druk met behulp van een 3D-printer de beeldvormings kamer en het deksel (materiaal: copolyester [CPE], nozzle: 0,25 mm, laag hoogte: 0,06 mm, wanddikte: 0,88 mm, wand graaf: 4, infill: 100%, geen ondersteuningsstructuur; de corresponderende. STL-bestand kan worden gevonden in de aanvullende materialen van dit Protocol).
- Monteer de Imaging kamer (Figuur 2).
- Monteer een ronde Afdeklijst (diameter: 30 mm) op de Imaging kamer met RTV-1 (één-component kamer-temperatuur-vulcanizing) Silicone rubber. Verwijder het overtollige Silicone rubber met een waterbevoafd wattenstaafje en genezen 's nachts.
- Monteer een ronde afdek (diameter: 22 mm) op het deksel met RTV-1 Silicone rubber. Verwijder het overtollige Silicone rubber met een waterbevoafd wattenstaafje en genezen 's nachts.
- Plaats het monster in een beeldvormings kamer, voeg een klein volume BABB-D15 toe en plaats het deksel. Vul de kamer met BABB-D15 door de inlaat, met behulp van een hypodermische naald (27 G x 3/4 inch [0,40 mm x 20 mm]).
- Sluit de inlaat aan en verzegel de Imaging kamer met RTV-1 Silicone rubber. 'S nachts genezen in het donker.
7. Imaging en beeldverwerking
- Stel de beeld verwerving in door de respectieve laserlijnen te selecteren die overeenkomen met de gebruikte fluor. Pas het detectiebereik van elke detector aan om te voorkomen dat het signaal overlapping tussen kanalen.
Opmerking: voorbeeldige detectie marges voor Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 en TO-PRO-3 zijn respectievelijk 500 – 550 nm, 590 – 620 nm en 645 – 700 nm.
- Kies de acquisitie parameters, definieer de boven-en onderrand van de z-stack en verkrijg de afbeeldings stack.
Opmerking: voorbeeldige acquisitie parameters zijn een sequentiële scan met een pixelgrootte van 60-90 nm, een z-Step grootte van 0,5 μm, een lijn gemiddelde van 1, een scansnelheid van 400 Hz en een pinhole grootte van 1 luchtige eenheid.
- Verwerk de afbeeldings stack met behulp van de juiste beeldanalyse software (bijvoorbeeld Fiji) om 3D-projecties te genereren of diepgaande analyses uit te voeren.
Opmerking: vanwege de grote omvang van de verkregen afbeeldingsbestanden is het gebruik van een werkstation meestal noodzakelijk.
- Open de acquisitie of het afbeeldingsbestand (en) in Fiji (bestand | Open | Selecteer bestanden).
- Als u bijvoorbeeld gebruikt. LIF-bestanden, selecteert u de gewenste opties in het dialoogvenster bio-indelingen en schakelt u deze uit. Bekijk de stack met Hyper stack. Anders dan dat, zijn geen specifieke selecties of teken nodig. Druk op OK.
- Als het bestand meerdere afbeeldingsstapels bevat, selecteert u de bestanden die u wilt analyseren en bevestigt u door op OKte drukken.
- Voer de Bleach-correctie uit door de samengevoegde afbeelding in afzonderlijke kanalen te splitsen (afbeelding | Kleur | Kanalen toolen selecteer meer | Gesplitste kanalen). Selecteer voor elk kanaal Bleach Correction (afbeelding | Aanpassen | Bleekmiddel correctie) en kies eenvoudige verhouding (achtergrond intensiteit: 0,0).
Opmerking: in sommige gevallen, bijvoorbeeld, wanneer er geen lineair verval van het signaal of het signaal is te zwak over het algemeen, eenvoudige verhouding kan mislukken. U ook exponentiële pasvorm uitproberen of de Bleach-correctie overslaan.
- Pas de helderheid en het contrast voor elk kanaal aan met behulp van de schuifregelaars (afbeelding | Aanpassen | Helderheid | Contrast).
- De kanalen samenvoegen (afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen), maak een composiet (afbeelding | Kleur | Kanalen toolen selecteer meer | Maak composiet) en converteer het naar de RGB-indeling (afbeelding | Kleur | Kanalen toolen selecteer meer | Converteren naar RGB).
- Wijzig zo nodig de grootte van de afbeeldingsstapel om de berekeningstijd en bestandsgrootte te verkleinen (afbeelding | Aanpassen | Grootte, beide opties aangevinkt plus bilineaire interpolatie).
- Een 3D-projectie genereren (afbeelding | Stapels | 3D-project). Kies helderste punt als projectie methode en stel de segment afstand in op de grootte van de z-stap van de verworven afbeeldingsstapel. Voor maximale kwaliteit stelt u de stap voor rotatiehoek in op 1 en schakelt u interpolatie in. Wijzig indien nodig de totale rotatie, transparantie drempels en dekking.
- Pas zo nodig het contrast en de helderheid aan door de 3D-projectie terug te zetten naar 8-bits indeling (afbeelding | Type | 8-bits). Gebruik de respectieve schuifregelaars (afbeelding | Aanpassen | Helderheid | Contrast) en converteer de afbeeldingsstapel opnieuw naar de RGB-indeling zoals beschreven in stap 7.3.4.
- Sla de 3D-projectie op als. TIF-bestand (Image File Format) en. AVI-bestand (videobestandsformaat).