Onderzoeken van veranderingen in caecum microbiota na traumatisch hersenletsel bij muizen

Samenvatting

Hier gepresenteerd is een protocol voor het opwekken van diffuse traumatisch hersenletsel met behulp van een laterale vloeistof percussie-apparaat gevolgd door de verzameling van het caecum inhoud voor gut microbiome analyse.

Samenvatting

Steeds meer bewijsmateriaal toont aan dat de microbiota-gut-Brain as een belangrijke rol speelt in de pathogenese van hersenziekten. Verschillende studies tonen ook aan dat traumatische hersenletsel veranderingen in de darm microbiota veroorzaken. Echter, mechanismen die aan de bidirectionele regulering van de hersenen-gut as blijven onbekend. Op dit moment, enkele modellen bestaan voor het bestuderen van de veranderingen in gut microbiota na traumatisch hersenletsel. Daarom, de gepresenteerde studie combineert protocollen voor het induceren van traumatisch hersenletsel met behulp van een laterale vloeistof percussie-apparaat en analyse van caecum monsters na letsel voor het onderzoeken van veranderingen in de darm-microbiome. Wijzigingen van de darm microbiota samenstelling na traumatisch hersenletsel worden bepaald met behulp van 16S-rDNA-sequencing. Dit protocol biedt een effectieve methode voor het bestuderen van de relaties tussen enterische micro-organismen en traumatisch hersenletsel.

Inleiding

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een wereldwijd volksgezondheidsprobleem en de belangrijkste doodsoorzaak en handicap bij jongvolwassenen^1,2. TBI veroorzaakt jaarlijks vele sterfgevallen, en overlevenden ervaren een verscheidenheid aan lichamelijke, psychiatrische, emotionele en cognitieve handicaps. Daarom is TBI een zware last voor de familie en de maatschappelijke middelen van de patiënt. TBI omvat zowel het primaire hersenletsel dat optreedt op het moment van trauma en eventuele secundaire hersenletsels die uren tot maanden na het eerste letsel ontwikkelen. Secundaire hersenletsel wordt gemedieerd door verschillende biochemische Cascades, die niet alleen schadelijk zijn voor de hersenen, maar ook aanzienlijke negatieve effecten hebben op verschillende orgaansystemen, waaronder het gastro-intestinale systeem³.

Op dit moment zijn er drie modellen om TBI te induceren in dier experimenten: vloeistof percussie letsel, controle corticale impact (CCI), en gewicht drop versnelling. Laterale vloeistof percussie letsel (LFPI) is het meest gebruikte model om diffuus hersenletsel (DAI)⁴vast te stellen. Het apparaat produceert hersenletsel door een craniectomie door een korte vloeistofdruk puls toe te passen op de intact Dura. Deze puls wordt gecreëerd door de staking van de slinger. LFPI is een reproduceerbare en bestuurbare modelleringsmethode voor TBI-onderzoek.

De microbiome wordt gedefinieerd als de collectieve genomen van alle micro-organismen die zich in het menselijk lichaam bevinden. Intestinale microben in het bijzonder spelen niet alleen een belangrijke rol in de intestinale homeostase en functie, maar ook het reguleren van vele aspecten van gastheer fysiologie en het functioneren van andere organen⁵. In de afgelopen jaren, er is steeds meer bewijs dat geeft aan dat gut microbiota reguleren van de ontwikkeling van de hersenen en functie via hersenen-gut assen⁶. Verstoring van de darm microbiota is gekoppeld aan verschillende hersenfunctie aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, stemmingsstoornissen, en autisme⁷. Onlangs, preklinische studies hebben ook gemeld dat acute hersenletsel veranderingen in gut microbiota kan induceren^8,9.

Een studie van Treangen et al.¹⁰ vond significante dalingen in drie microbiële soorten en verhogingen in twee microbiële soorten na CCI-geïnduceerde TBI. Dit bewijs geeft aan dat de modulatie van gut microbiota een therapeutische methode in TBI Management kan zijn. Echter, de mechanismen onderliggende hersenen letsel-geïnduceerde gut microbiota veranderingen blijven onbekend. Om deze reden is een relatief eenvoudig en efficiënt model van het bestuderen van de veranderingen in gut microbiota na TBI vereist. Daarom presenteert de huidige studie een protocol om veranderingen in gut microbiota na TBI bij muizen te onderzoeken.

Protocol

Alle uitgevoerde procedures werden goedgekeurd door de experimentele dierenethiek Commissie van de Zhejiang University. Alle instrumenten en materialen die worden gebruikt in chirurgie zijn steriel. De TBI proceudre duurt ongeveer 20 minuten.

1. verzorging van dieren

1. Gebruik 5 tot 6 weken oude mannelijke C57BL/6J muizen (20-25 g gewicht) in dit experiment.
2. Handhaaf muizen op een licht/donkere cyclus van 12 uur/12 uur en zorg ervoor dat ze voedsel en water ad libitum krijgen. Verstrek dezelfde hoeveelheden voedsel en water aan zowel de Sham-als de TBI-groep tijdens de studie.
3. Doe alle inspanningen om het dier pijn en ongemak te minimaliseren.

2. inductie van traumatisch hersenletsel

1. Injecteer ketamine (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP voor anesthesie. Test de diepte van de anesthesie met behulp van een oogreflex of pijn reflex. Gebruik kunstmatige tranen of smeermiddel oogzalf om de ogen te houden van het drogen.
2. Na anesthesie, zet de muis in de liggende positie. Gebruik een temperatuurgestuurde verwarmingspad om de temperatuur bij 37 °C te houden tijdens de operatie en gedurende 30 minuten na TBI.
3. Scheer het haar van het incisie gebied.
4. Desinfecteer de hoofdhuid met 70% ethanol met behulp van drie alternerende Scrubs en geef vervolgens de hoofdhuid op in een Sagittaal vlak.
5. Gebruik de tang om de incisie aan beide zijden in te trekken en het periosteum iets te scheiden.
6. Gebruik een marker om een cirkel (3 mm diameter) te tekenen op het rechter pariëtale gebied van de schedel, op 2 mm afstand van de middenlijn.
7. Boor de schedel met een elektrische boor. Zorg ervoor dat deze stap zorgvuldig wordt uitgevoerd om de Dura te beschermen tegen beschadiging.
8. Verwijder de botflap en stel een klein botvenster (3 mm in diameter) bloot.
9. Plaats een kunststof letsel canule (inwendige diameter = 2,5 mm, lengte = 8 mm) over de craniotomie en cement de canule aan de schedel met behulp van een tandheelkundige acryl.
10. Vul de canule met steriele 0,9% NaCl (normale zoutoplossing) met behulp van een spuit (5 mL) om er zeker van te zijn dat er geen bubbels in de canule zitten.
11. Schakel de oscilloscoop en de versterker in en zorg ervoor dat de Hogedruk buis van het laterale vloeistof percussie letsel (LFPI)-apparaat vrij is van luchtbellen. Test het apparaat door ongeveer 10 pulsen te leveren totdat het een stabiel signaal geeft. Pas de hoek van de startpositie van de slinger aan om een puls-intensiteit van ongeveer 2,0 ATM te bereiken.
12. Sluit de blessure canule aan op het LFPI-apparaat. Hersenletsel induceren door de trigger te trekken en de slinger los te laten. Vervolgens verkrijgt u een puls en zendt u deze door het volledige slangen systeem met gesloten vloeistoftoevoer naar de Dura.
13. Bedien de muizen in de Sham-groep met dezelfde chirurgische ingreep. Voer de LFPI niet uit.

3. behandeling na de operatie

1. Na het induceren van de hersenletsel, verwijder de plastic canule en hechting van de incisie. Tijdens chirurgie toedienen buprenorfine (2mg/kg) SQ of IP en daarna elke 6-12 h gedurende drie dagen.
2. Leg de muis op een verwarmingskussen totdat het ambulant is. Stel de temperatuur van het verwarmingspaneel in op 37 °C om anestheticum reanimatie te versnellen.
3. Zet de muis terug in de kooi en dien voedsel en water ad libitumtoe.

4. laparotomie en monsterverzameling uit het caecum

1. Euthaniseer de muizen door CO₂ gevolgd door cervicale dislocatie op de corresponderende tijdstippen.
   Opmerking: in dit experiment waren de gekozen tijdspunten 1 h, 6 h, 1 d, 3 d en 7 d post-traumatisch hersenletsel om de dynamische evolutie van gut microbiota te analyseren.
2. Verwijder het haar van het oppervlak van de buik. Desinfecteer de buik met 70% ethanol.
3. Plaats een steriel gordijn over de muis. Maak een incisie van de onderste buik middenlijn, net boven de voor huid in de mannelijke muizen.
4. Nadat de darmen zijn blootgesteld, lokaliseren van de blindedarm en zachtjes gescheiden van andere intestinale tracten. Vermijd het grijpen van de blindedarm met getande of scherpe Tang. Gebruik atraumatische Tang, zoals Adson Tang met serraties.
5. Snijd het caecum met een scherpe schaar.
6. Extraheer de caecum-inhoud handmatig op steriel verband en bewaar de inhoud in 1,5 mL micro centrifugebuizen.
7. Bewaar de caecum inhoud bij-80 °C tot de microbiome analyse.

5. DNA-extractie en 16S-rDNA-sequencing en data-analyse

1. Isolatie van DNA uit ontlasting
   Opmerking: voor dit experiment is een in de handel verkrijgbare DNA-isolatiekit (tabel met materialen) gebruikt.
   1. Gebruik een scalpel om 300 mg uitwerpselen in een 2 ml micro centrifugebuis te Schraap en plaats de buis op ijs.
   2. Voeg 1 mL van de remmen buffer toe aan elk monster. Vortex continu gedurende 1 min of totdat het uitwerpselen monster grondig wordt gehomogeniseerd.
   3. Centrifugeer het monster met de maximale snelheid gedurende 1 minuut om de feces deeltjes te pellet.
   4. Pipetteer 2 μL proteïnase K in een nieuwe micro centrifugebuis van 2 ml. Pipet teren 600 μL van de supernatant uit stap 5.1.3 in de micro centrifugebuis van 2 ml die proteïnase K bevat. Voeg vervolgens 600 μL buffer 1 en Vortex toe voor 15 sec.
   5. Incuberen het monster gedurende 10 min bij 70 °C.
   6. Voeg 600 μL 100% ethanol toe aan het lysaat (1:1 ratio) en meng door vortexing. Centrifugeer bij de maximumsnelheid kort om druppels van de binnenkant van het buis deksel te verwijderen.
   7. Breng 600 μL lysaat aan op de spin kolom. Centrifugeer bij de maximumsnelheid gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom weg. Herhaal deze stap nog een keer. Vervolgens de kolom overbrengen naar een nieuwe 2 mL collectie buis.
   8. Open de draai kolom en voeg 500 μL buffer 2 toe. Centrifugeer bij de maximumsnelheid gedurende 1 min. Verwijder de kolom en plaats deze in een nieuwe 2 mL opvang buis.
   9. Voeg 500 μL buffer 3 toe aan de kolom. Centrifugeer bij de maximumsnelheid gedurende 3 min. Gooi de doorstroom weg. Herhaal het Centrifugeer proces eenmaal om er zeker van te zijn dat de buffer 3 volledig is geellueerd.
   10. Plaats de spin kolom in een nieuw buisje van 2 mL en Pipetteer 200 μL buffer 4 rechtstreeks op het membraan. Inbroed gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) en centrifugeer vervolgens op de maximumsnelheid gedurende 1 minuut om het DNA te Elderen.
2. 16S-rDNA-sequencing en data-analyse
   1. Gebruik 20-30 ng van DNA om amplicons te genereren.
   2. Gebruik in de handel verkrijgbare primers ontworpen voor de relatief geconcongeerde regio's grenzend aan de V3 en v4 hypervariable regio's van bacteriën 16S rDNA. De voorwaartse primers met de sequentie "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" en omgekeerde primers met de sequentie "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" werden gebruikt in de huidige studie.
   3. Maak de PCR-reacties mengsel door toevoeging van 2,5 μL buffer 1,2 μL dNTPs, 1 μL van elke primer, 0,5 μL van de DNA-polymerase en 20 ng van het template-DNA in een buisje. Gebruik ddH₂O om het reactiesysteem aan te passen tot 25 μL.
   4. Stel de PCR-reactieparameters als volgt in: Voer de pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 3 minuten. Voer denaturatie uit bij 94 °C gedurende 5 s, anneal bij 57 °C voor 90 s, Verleng bij 72 °C gedurende 10 sec. en herhaal deze 24x.
   5. Voer PE250/300 gekoppelde-end-sequencing uit volgens de instructies van de fabrikant en gebruik het QIIME-gegevensanalyse pakket voor 16S rRNA-gegevensanalyse.
      Opmerking: in dit experiment, de DNA-sequencing en data-analyse werden voornamelijk gedaan door een professionele sequencing bedrijf.

Resultaten

De oprichting van TBI wordt weergegeven in Figuur 1. Na anesthesie en desinfectie, de hoofdhuid werd ingesneden sagittally (Figuur 1a). Een craniotomie (3 mm in diameter) werd in de schedel op de rechter pariëtale cortex getreesd met een elektrische boor, de Dura werd intact gehouden (Figuur 1b, C). Een plastic letsel canule werd geplaatst over het botvenster en gecementeerd aan de s...

Discussie

Hier gepresenteerd is een eenvoudig en efficiënt protocol om veranderingen in cecal microbiota na TBI bij muizen te bepalen. Inductie van hersenletsel en het verzamelen van caecum-inhoud monsters zijn kritische delen van het protocol.

Ondanks onderzoekers hebben bestudeerd de veranderingen van gut microbiota na TBI, de hersenen letsel gebruikt in deze studies waren CCI-⁸ en gewicht drop/impact-geïnduceerde modellen⁹. Echter, het CCI model replice...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DNA isolation kit	QIAGEN	51604	Voor snelle zuivering van genomisch DNA uit ontlastingsmonsters
Gene analysis service	GENEWIZ		Gene analyse service
Heating pad	Shanghai SAFE Biotech Co.	TR-200	verwarmingskussen
Injector	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		injector
LFPI device	Virginia Commonwealth University	FP302	LFPI-apparaat
Micro cranial drill	RWD Life Science	78061	Micro craniale boor
Povidone Iodine	The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University		Povidone jodium