Methodenartikel

Het uitvoeren van de spectroscopie op Plasmonic nanodeeltjes met transmissie-gebaseerde Nomarski-type differentiële interferentie contrast microscopie

6.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59411

⸱

5 juni 2019

1Department of Chemistry and Biochemistry, Ohio University

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om een bewezen aanpak voor de bereiding van plasmonic nanodeeltjes monsters en voor het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie op hen met differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie detail.

Samenvatting

Differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie is een krachtige imaging tool die het meest gebruikt wordt voor Imaging micro Scale objecten met behulp van zichtbare-bereik licht. Het doel van dit protocol is om een beproefde methode voor de voorbereiding van plasmonic nanodeeltjes monsters en het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie op hen met DIC microscopie detail. Een aantal belangrijke stappen moeten zorgvuldig worden gevolgd om herhaalbare spectroscopie experimenten uit te voeren. Ten eerste kunnen oriëntatiepunten worden geëtst in het monster substraat, die helpt bij het lokaliseren van het monster oppervlak en in het bijhouden van de regio van belang tijdens experimenten. Vervolgens moet het substraat goed worden gereinigd van puin en verontreinigingen die anderszins kan belemmeren of obscure onderzoek van het monster. Zodra een monster goed is voorbereid, moet het optische pad van de Microscoop worden uitgelijnd, met behulp van Kohler verlichting. Met een standaard Nomarski stijl DIC Microscoop, rotatie van het monster kan nodig zijn, met name wanneer de plasmonic nanodeeltjes vertonen oriëntatie-afhankelijke optische eigenschappen. Omdat DIC microscopie heeft twee inherente orthogonale polarisatie velden, de golflengte-afhankelijke DIC contrast patroon onthult de oriëntatie van Rod-vormige plasmonic nanodeeltjes. Tot slot moeten de data-acquisitie en gegevensanalyses zorgvuldig worden uitgevoerd. Het is gebruikelijk om op DIC gebaseerde spectroscopie gegevens te vertegenwoordigen als een contrastwaarde, maar het is ook mogelijk om het als intensiteits gegevens te presenteren. In deze demonstratie van DIC voor enkele deeltjes spectroscopie, de focus ligt op sferische en Rod-vormige goud nanodeeltjes.

Inleiding

Sinds de jaren tachtig is differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie grotendeels gezien als een belangrijke imaging methode voor micro Scale objecten binnen de biologische wetenschappen. Nochtans, tijdens zijn ontwikkeling in de jaren ' 50 en de jaren ' 60, was het bedoeld als techniek voor materialen wetenschap1. Met de recente vooruitgang in de materiële wetenschappen met betrekking tot plasmonic nanodeeltjes, heeft een verhoogde rente in de karakterisering van materialen met optische microscopie plaatsgevonden.

Vele optische technieken zijn zeker beschikbaar voor nanomateriaal karakterisering (b.v., donker gebied, helderveld, gepolariseerd licht, fluorescentie, enz.). Dark Field is zeer populair in nanodeeltjes onderzoek, maar het berust uitsluitend op de verzameling van Scatter en biedt beperkte informatie over complexe monsters2. De fluorescentie kan nuttig zijn, maar slechts met steekproeven dat luminescentie of dat kan behoorlijk worden bevlekt. DIC microscopie heeft verschillende eigenschappen die het een waardevol instrument maken voor de analyse van nanodeeltjes. De meest voorkomende voordelen van DIC in vergelijking met andere methoden en met betrekking tot plasmonic nanodeeltjes zijn: geen monster kleuring vereist, geen halo effecten, ondiepe scherptediepte, en hoge zijdelingse resolutie3. DIC heeft extra sterke punten die waardevol zijn voor plasmonic nanodeeltjes onderzoek. Allereerst, twee inherente en orthogonale polarisatie velden aanwezig zijn, en ze kunnen gelijktijdig worden gemeten voor de spectroscopie doeleinden2. Ten tweede wordt het gepolariseerde signaal van nanodeeltjes niet vastgelegd in het uiteindelijke beeld2, wat een oorzaak kan zijn van ernstige bezorgdheid in de donkere veld spectroscopie metingen.

Het doel van dit artikel is het verstrekken van een duidelijke methodologie voor het gebruik van overdraagbare licht Nomarski DIC microscopie uit te voeren spectroscopie op plasmonic nanodeeltjes. Hoewel DIC is een krachtige techniek die kan worden toegepast op zeer diverse materialen, het is ook een techniek die vereist grote vaardigheid en begrip om goed te werken wanneer beeldvorming nanodeeltjes. Transmission-based Nomarski DIC microscopie heeft een complex licht pad1 dat hier slechts kort zal worden herzien. De optische trein van DIC wordt weergegeven in Figuur 1. Het licht wordt overgebracht door de Microscoop door eerst te worden overgegaan door een polarisator en een straal-verdelend Nomarski prisma alvorens wordt geconcentreerd door de condensator op het steekproef vliegtuig. Na het passeren van de doelstelling, het licht ontmoetingen een Beam-combineren Nomarski prisma en een analysator voor het verlaten van de detector. De twee polarisatoren en Nomarski prisma's zijn cruciaal voor de vorming van de DIC beeld en zijn verantwoordelijk voor de productie van DIC de twee orthogonale polarisatie velden1. Voor de lezer geïnteresseerd in meer weten over de werkingsprincipes en optische pad van Nomarski DIC microscopen, of de verschillen tussen Nomarski DIC en andere stijlen van DIC, verwijzen wij u naar andere goed geschreven accounts over deze onderwerpen1, 4 , 5 , 6 , 7.

Het is even belangrijk om de fundamentele aard van plasmonic nanodeeltjes te begrijpen alvorens te proberen de spectroscopie uit te voeren op hen, of het nu met Nomarski DIC, Dark Field, of een andere microscopie techniek. Op het gebied van plasmonics worden nanodeeltjes gedefinieerd als deeltjes met afmetingen op de schaal van 10-100 nm8,9. Nanodeeltjes kunnen nemen op vele vormen (bijvoorbeeld bollen, staven, sterren, halters, enz.), en de meeste van hun belangrijke eigenschappen ontstaan door interacties met licht in de ultraviolet-zichtbare-near Infrarood bereik van het elektromagnetische spectrum. De term "plasmonic" is niet beperkt tot nanodeeltjes10; echter, bij de bespreking van nanodeeltjes, wordt het gebruikt in verwijzing naar gelokaliseerde oppervlakte Plasmon resonantie (LSPR). LSPR is een fenomeen waarbij de geleiding elektronen in een nanodeeltjes schommelen als gevolg van een Coulomb interactie met elektromagnetische straling van een zeer specifieke en relatief smalle frequentieband8. Bij deze zelfde frequenties, plasmonic nanodeeltjes vertonen verhoogde absorptie en verstrooiing van licht, waardoor ze waarneembaar met optische microscopie. In veel gevallen, is het de voorkeur aan de nanodeeltjes observeren tijdens het plaatsen van band filters voor de condensor2, om het beeldcontrast te verbeteren en om het licht te elimineren dat niet aan de LSPR effect te induceren. Het gebruik van filters maakt het ook mogelijk om enkele deeltjes spectroscopie experimenten uit te voeren.

LSPR optische gedrag is sterk afhankelijk van de grootte en de vorm van de nanodeeltjes, en het kan worden onderzocht met veel optische microscopie technieken. Echter, om oriëntatie informatie van plasmonic nanodeeltjes te ontcijferen met een anisotropische (dwz, niet-sferische) vorm, is het noodzakelijk om gebruik te maken van polarisatie van het lichtveld. Door het polarisatie veld of het monster substraat bij kleine stappen zorgvuldig te roteren, is het mogelijk om de oriëntatie afhankelijke spectroscopie eigenschappen van afzonderlijke nanodeeltjes te monitoren. Rotatie en polarisatie kan ook helpen bij het bepalen of een spectrale functie is te wijten aan een dipolaire of hogere orde trilling van het oppervlak van de nanodeeltjes elektronen. Echter, in het geval van isotrope (dat wil zeggen, sferische) nanodeeltjes, het spectrale profiel blijft in wezen ongewijzigd bij het roteren van het monster onder gepolariseerd licht.

Wanneer ze worden bekeken door een DIC Microscoop (Figuur 2), hebben nanodeeltjes een luchtige schijf met een schaduw-gegoten wit-en-zwart uiterlijk tegen een grijze achtergrond. Sferische nanodeeltjes zullen deze verschijning onder rotatie en met het veranderen van band filters behouden; Nochtans, zullen de deeltjes geleidelijk aan van mening langzaam verdwijnen aangezien de centrale golflengte van het filter verder van de enige dipolaire LSPR golflengte11van de bol wordt gescheiden. De verschijning van nanorods kan vrij dramatisch veranderen aangezien zij2worden gedraaid. Nanorods hebben twee LSPR banden met dipolaire gedrag, waarvan de locatie gebaseerd is op de fysieke afmetingen van de nanorods. Wanneer de longitudinale as van een nano staafje is gericht parallel aan een van de DIC polarisatie velden, zal de luchtige schijf verschijnen alle witte of alle zwarte als bekeken met een bandfilter geassocieerd met die LSPR golflengte. Na het roteren van de steekproef 90 °, zal het op de tegenovergestelde kleur. Als alternatief, aangezien de transversale as van een nano staafje loodrecht op de longitudinale as is, zal de staaf de tegenovergestelde kleur nemen wanneer het schakelen tussen filters die de LSPR golflengten voor de twee assen aanpassen. Bij andere oriëntaties en filter montages, zal nanorods meer als bollen verschijnen, die een verscheidenheid van schaduw-gegoten luchtige schijf patronen voorstellen. Voor nanorods met een transversale as < 25 nm, kan het moeilijk zijn om signaal op die LSPR golflengte te detecteren met behulp van DIC microscopie.

Voor het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie, is het belangrijk om de juiste optische componenten te gebruiken en om ze goed af te stemmen. Er moet een doelstelling voor DIC microscopie worden gebruikt. Voor enkelvoudige deeltjes experimenten, 80x of 100x olie doelstellingen zijn ideaal. Nomarski DIC prisma's komen gewoonlijk in drie variëteiten: standaard, hoog contrast, en hoge resolutie. Het ideale type hangt sterk af van het doel van het experiment en de grootte van de nanodeeltjes. Standaard prisma's zijn prima voor vele experimenten; maar wanneer het werken met kleinere nanodeeltjes (< 50 nm), kunnen de hoog contrast prisma's voordelig zijn, aangezien het deeltjes contrast vermindert aangezien de deeltjes in grootte11verminderen. Het aanpassen van de DIC contrast wordt bereikt, hetzij door het roteren van een polarisator of door het vertalen van een van de DIC prisma's, afhankelijk van de Microscoop merk of model6.

Na het instellen van Kohler verlichting en de polarisator instellingen, is het van cruciaal belang om deze instellingen niet opnieuw aan te passen, terwijl het verzamelen van spectroscopie gegevens. Bovendien moet tijdens het verzamelen van gegevens altijd een constant gemiddeld achtergrond signaal worden bijgehouden, ook bij het schakelen tussen filters en hoek instellingen. De werkelijke ideale achtergrondwaarde is afhankelijk van het dynamisch bereik van de wetenschappelijke camera, maar in het algemeen moet de achtergrond in het bereik van 15%-40% van de maximale detectie niveau van de camera. Dit vermindert de kans op verzadiging van de camera sensor terwijl het optimale particle contrast mogelijk maakt. Voor het verzamelen van de spectroscopie gegevens, is het noodzakelijk om te werken met een wetenschappelijke camera die beelden in zwart-wit, in tegenstelling tot een kleurencamera vangt.

Sample voorbereiding is een ander kritisch aspect van de beeldvorming plasmonic nanodeeltjes. Het is noodzakelijk dat de exploitanten van DIC microscopie inzicht hebben in de optische eigenschappen van het monster en het substraat van het monster. "Pre-gereinigd" Microscoop glas is niet voldoende voorbereid voorbeeld vorming nanodeeltjes, en het moet goed worden opnieuw gereinigd voordat monster depositie om onbelemmerde waarneming van het monster te waarborgen. Veel reinigings protocollen voor Microscoop dia's zijn eerder gedocumenteerd12, maar het is niet een stap die normaalgesproken wordt gerapporteerd in experimentele studies.

Ten slotte, data-analysemethoden zijn de laatste component van enkele deeltjes spectroscopie. De maximum-en minimum intensiteiten voor elke nano partikel moeten worden gemeten, evenals het lokale achtergrond gemiddelde. De deeltjes van belang zouden in gebieden met geen achtergrond puin, substraat tekorten, of ongelijke verlichting moeten worden gevestigd. Een methode voor het bepalen van het spectrale Profiel van een nano partikel is door het berekenen van particle contrast bij elke golflengte, met behulp van de vergelijking onder11,13,14,15:

figure-introduction-1

Als alternatief kan het spectrum van een enkel deeltje worden gesplitst in zijn individuele maximum-en minimum signaal componenten, die de twee polarisatie velden van DIC vertegenwoordigen, waardoor de twee gelijktijdig verzamelde directioneel afhankelijke spectra worden weergegeven, door de twee vergelijkingen:

figure-introduction-2

figure-introduction-3

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Monstervoorbereiding met standaard glas microscopie dia's

  1. Bereid glazen Microscoop dia's voor monster depositie.
    Nota: in sommige omstandigheden, kan het meer aangewezen zijn om het glas in ultrapuur water in plaats van ethylalcohol op te slaan. Echter, het opslaan in water of lucht maakt het glas hydrofobe in de tijd.
    1. Voor de beste resultaten, de aankoop glas of Quartz Microscoop dia's en cover glas.
    2. Met behulp van een pen, plaats een ondiep en korte Scratch merk op het centrum van elke glazen Afdekstrook.
    3. Reinig alle Microscoop glas, zelfs als het is gekocht "pre-gereinigd", om glasscherven, stof, poeder, organisch residu, en alle andere verontreinigingen die invloed hebben op de beeldkwaliteit of monster depositie te verwijderen.
      Opmerking: deze reinigingsmethode hieronder werkt goed voor de soorten monsters hier beschreven en vermijdt het gebruik van agressieve chemicaliën. Ruwere chemicaliën kunnen etsen het glas en vereisen meer zorg in behandeling en verwijdering.
      1. Plaats Microscoop glas op opslag rekken en vervolgens in een beker, of in een kleuring jar. Plaats geen Microscoop glas op de bodem van bekers en andere Lab glaswerk zonder rekken, omdat elk stuk en oppervlak van Microscoop glas moet volledig worden blootgesteld aan de reinigingsmiddelen.
      2. Giet ~ 1 mL vloeibaar detergens (lijst van materialen) in de container en bovenkant van de container met water. Bewerk voor 30 min.
        Opmerking: zodra het reinigingsproces begint, alleen omgaan met het glas tijdens het dragen van handschoenen, om te voorkomen dat het verlaten van vingerafdruk residu op het glas.
      3. Giet de vloeibare inhoud van de reinigings container in een gootsteen. Spoel de container meerdere malen met ultrapuur water om alle verschijning van wasmiddel te verwijderen. Vul de container met ultrapuur water. Bewerk de container met Microscoop glas voor nog eens 30 min.
      4. Herhaal de vorige stap ten minste eens te meer. Voer extra rondes van sonication in water totdat het duidelijk is dat alle sporen van het wasmiddel zijn verwijderd.
      5. Giet de inhoud van de reinigings container. Spoel de container met ultrapuur water. Vul de container met ethanol. Bewerk Microscoop glas voor 30 min.
      6. Giet de inhoud van de reinigings container in een afvalcontainer. Vullen met ethanol. Bedek de container om verlies van ethanol te voorkomen door verdamping. Bewaar de Microscoop glas in deze container tot de tijd van experiment. De dia's blijven schoon en bruikbaar zolang ze in ethanol in een overdekte container ondergedompeld blijven.
  2. Voorbereiding van de nano partikel oplossing
    1. Verwijder met behulp van een micro pipette een 100 µ L-hoeveelheid van 0,05 mg/mL Gold nano partikel oplossing uit de oorspronkelijke opslag container en haal de oplossing in een 1,5 mL centrifugebuis.
    2. Centrifugeer het monster voor 10 min bij 6.000 x g.
    3. Verwijder de bovendrijvende met een micropipet, om overtollige oppervlakteactieve stof te verwijderen.
    4. Met behulp van een micro pipette, plaats 100 µ L van ultrapuur water in de centrifugebuis.
      Opmerking: als niet alle van de bovendrijvende kan worden verwijderd op de eerste poging, herhaal de centrifugeren en herschorsing stappen.
    5. Draai het monster kort om de pellet opnieuw op te schorten. Bewerk onmiddellijk daarna voor 20 min om volledig te hersuspenderen en breken nanodeeltjes aggregaten.
      Nota: als de steekproef niet onmiddellijk wordt gebruikt, zou het sonicated opnieuw voor 20 min moeten zijn alvorens oplossing op Microscoop glas te deponeren.
  3. Steekproef afzetting
    1. Verwijder de gereinigde cover slips en Microscoop dia's uit hun opslag containers. Föhn het glas met onder druk staande stikstof of argon.
    2. Met behulp van een micropipet, druppel-gegoten 6 µ L van nano partikel oplossing van stap 1.2.5 op de cover slip. Om verspreid de druppel gelijkmatig, zorgvuldig plaats een tweede, groter stuk Microscoop glas op de top van de cover slip, zoals een tweede cover slip of een Microscoop dia. Vermijd het krijgen van luchtbellen opgesloten tussen de twee stukjes glas.
      1. Draai het monster substraat over, en sluit de randen van de cover slip met een smalle lijn van nagellak om verdamping van de middellange oplossing te voorkomen.
      2. Als alternatief, om het beeld van de steekproef "droge", laat de oplossing te staan voor 5 – 15 min op de cover slip, voordat u het ongewenste stuk glas. Blaas de cover slip droog met onder druk gezette stikstof of argon.
    3. Indien mogelijk, beeld monsters onmiddellijk na de voorbereiding. Als dat niet mogelijk is, bewaar monsters in een overdekte container, zoals een Petri schaaltje tot Imaging.

2. DIC beeldvorming

  1. Doelstelling en condensator uitlijnen.
    1. Na het plaatsen van het monster op de Microscoop, vind het focal plane met het monster op. Eerst lokaliseren en focussen op de Scratch merk eerder gemaakt. Dan fine-tunen van de focus tot nanodeeltjes in beeld komen.
    2. Voor het bepalen van de nauwkeurige plaatsing van de condensor, gebruik maken van de Kohler verlichting methode. 5 Kohler verlichting bij hoge vergroting (80x, 100x) is gemakkelijker bereikt door eerst het instellen van de Kohler verlichting op een lagere vergroting, zoals 20x.
      Opmerking: normaal, Kohler verlichting hoeft niet opnieuw te worden aangepast tijdens de beeldvorming van een enkel monster. Echter, het is een goede gewoonte om te verifiëren dat Kohler verlichting goed is ingesteld bij het overschakelen naar een nieuwe Microscoop dia.
  2. Optimaliseer de contrast instellingen.
    1. Selecteer een regio met interesse in het voorbeeld voor Imaging. Centreer de regio in het gezichtsveld van de camera en pas de focus zo nodig aan.
      1. Als de Microscoop heeft de de Senarmont ontwerp, beginnen met de polarisator in de buurt van maximale achtergrond uitsterven en geleidelijk draaien de polarisator naar afnemende achtergrond uitsterven. De achtergrond intensiteit zal geleidelijk toenemen.
      2. Als de Microscoop niet over een de Senarmont ontwerp, beginnen met de optische trein ingesteld op maximale achtergrond uitsterven. In dit geval, geleidelijk aan te passen de objectieve prisma positie naar afnemende achtergrond uitsterven.
        Opmerking: de ideale instelling wordt bereikt wanneer de nanodeeltjes hun grootste intensiteit verschil (dat wil zeggen, contrast) te bereiken van de gemiddelde lokale achtergrondwaarde. Voor plasmonic nanodeeltjes wordt het optimale contrast normaal bereikt met een relatief donkere achtergrond, dus bij instellingen in de buurt van maximale uitsterven op de achtergrond.
  3. Afbeelding van het monster.
    1. Schakelkamer verlichting om te voorkomen dat zwerf verlichting van de interactie met het proces.
    2. Tijdens het bekijken van de nanodeeltjes met een wetenschappelijke Imaging camera, bepalen de optimale achtergrondniveau. Met behulp van een 10 nm volle breedte bij half maximum (FWHM) Bandfilter met zijn centrale golflengte co-gelegen met de belangrijkste LSPR golflengte, Bekijk de regio van belang. Pas de intensiteit van de lamp of de belichtingstijd totdat de achtergrondniveau is in het bereik van 15%-40% van de maximale capaciteit van de camera niveau en geen objecten in de regio van belang vertonen signaal intensiteiten die hoger zijn dan 90% van het maximale niveau van de camera.
      Opmerking: het doel van stap 2.3.2 is om te voorkomen dat verzadiging van de sensor bij het schakelen tussen filters. Het ideale achtergrondniveau zal variëren tussen samples en camera's. Zodra deze stap is voltooid, kan de belichtingstijd worden aangepast, maar niet de lamp intensiteit.
    3. Afbeelding van het monster met een reeks van band filters die elk een FWHM van 10 nm heeft en dat als geheel in staat beeldvorming over de gehele golflengte bereik van belang. Zorg ervoor dat de achtergrond intensiteit consistent blijft van afbeelding tot afbeelding (binnen ~ 5% van elkaar) door de belichtingstijd aan te passen. Na het schakelen van filters, re-focus het monster voordat beeld vast te leggen.
    4. Sla de afbeeldingen op als niet-gecomprimeerde TIFF-bestanden en/of in de oorspronkelijke bestandsindeling van de software om alle informatie te bewaren.
  4. Draai het monster.
    1. Na het verzamelen van beelden van het monster op zijn oorspronkelijke positie, het monster kan nu worden gedraaid en afgebeeld op extra oriëntaties in het licht pad. Voer op gezette tijden rotatie uit (bijv. 10 ° of 15 °) over een bereik van 180 ° of 360 °.
      Opmerking: rotatie vereist een draaibare sample fase.
    2. Zoals in de punten 2.1-2.3, camera-instellingen aan te passen aan een consistente achtergrondniveau van beeld naar beeld te bieden.
      Opmerking: geen aanpassing aan Kohler verlichting moet worden gemaakt.

3. data-analyse met behulp van ImageJ

Nota: de volgende berekeningen kunnen in een verscheidenheid van softwarepakketten worden uitgevoerd, en soms in het inheemse programma dat wordt gebruikt om de beelden te verzamelen. ImageJ is een vrij beschikbare software van de nationale instituten van gezondheid (NIH).

  1. Bereken particle contrast of intensiteit.
    1. Open de afbeelding met ImageJ.
    2. Selecteer de rechthoek gereedschap en teken een rechthoek rond de belangrijkste regio van belang.
    3. Op de werkbalk, selecteer afbeelding, dan Zoom, vervolgens naar selectie. Het Imaging venster zal inzoomen op het geselecteerde gebied.
    4. Op de werkbalk, selecteert u afbeelding, vervolgens aanpassen, dan helderheid/contrast. Er verschijnt een nieuw venster. Om een betere weergave van het steekproef gebied mogelijk te maken, past u de vier instellingen aan: minimum, maximum, helderheid en contrast. Deze aanpassingen doen geen afbreuk aan de wetenschappelijke gegevens, maar maken een betere zichtbaarheid van de steekproef regio mogelijk.
      Opmerking: stappen 3.1.3 en 3.1.4 kunnen meerdere keren en in omgekeerde volgorde worden uitgevoerd.
    5. Met behulp van de rechthoek opnieuw, teken een doos rond de eerste nanodeeltjes te meten. De doos moet alleen iets groter dan luchtige schijf van de nano partikel.
    6. Selecteer analyserenen vervolgens metenop de werkbalk. Er wordt een nieuw venster weergegeven waarin de minimum-, maximum-en gemiddelde intensiteit wordt gerapporteerd voor de pixels die zich binnen het geselecteerde vak bevinden.
    7. Sleep de doos gebruikt om de nanodeeltjes te meten aan een gebied direct naast het deeltje, waar de achtergrond contrast is relatief gelijkmatig en geen deeltjes of contaminanten aanwezig zijn. Behoud de oorspronkelijke grootte van het vak.
    8. Gebruik het gereedschap Meetlat om de gemiddelde intensiteit voor het achtergrond gebied te bepalen.
    9. Meet de resterende deeltjes en een aangrenzende achtergrond gebied voor elk.
    10. Herhaal het proces voor elk deeltje in alle beelden in de serie.
    11. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet om het contrast of de intensiteit van elk deeltje te berekenen, over alle golflengten en hoeken.
    12. Bereken het contrast van elk deeltje met behulp van de volgende vergelijking13,14,15:
      figure-protocol-1
      Opmerking: het gebruik van deze vergelijking, particle contrast moet altijd worden > 0.
    13. Bereken de door de achtergrond gecorrigeerde maximumwaarde van het deeltje door de gemeten maximale deeltjes intensiteit door de achtergrond te delen:
      figure-protocol-2
    14. Evenzo, bereken de achtergrond-gecorrigeerde minimumwaarde door het delen van de gemeten minimale deeltjes intensiteit door de achtergrond betekent:
      figure-protocol-3
      Nota: zoals berekend, zou het maximum een waarde moeten hebben groter dan één, terwijl het minimum minder dan één zal zijn. Het is aanvaardbaar om elke waarde door "1" af te trekken, zodat de gemiddelde achtergrond in wezen nul is, wordt het maximum vertegenwoordigd als positieve waarde, en de minimumwaarde wordt toegewezen een negatieve waarde16. Deze laatste benadering kan de analist om afzonderlijk te overwegen wat er gebeurt langs elk van de polarisatie velden, die nuttig is bij het bestuderen van anisotropische deeltjes.
    15. Om het spectrale profiel op een bepaalde positie van nanodeeltjes te plaatsen, worden gegevens met de golflengte langs de x-as en het contrast of de intensiteit langs de y-as getekend.
    16. Als u het rotatie profiel bij een bepaalde golflengte wilt fotograferen, moet u de rotatie hoek langs de x-as en het contrast of de intensiteit langs de y-as plotten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bij het werken met monsters die groot genoeg zijn om gezien te worden met het blote oog, het plaatsen van oriëntatiepunten op het glassubstraat is normaalgesproken niet nodig. Echter, bij het werken met nanomaterialen of wanneer rotatie van het monster is vereist, kunnen de oriëntatiepunten een eenvoudige methode voor het lokaliseren, onderscheiden en bijhouden van de oriëntatie van het monster. Hoewel meer verfijnde technieken kunnen worden gebruikt voor het verlaten van oriëntatiepunten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wanneer Imaging met DIC microscopie, is het essentieel om de optische componenten te optimaliseren voordat het verzamelen van gegevens. Zelfs kleine aanpassingen aan de polarisator in het midden van een experiment kan leiden tot significante effecten op de definitieve gegevens6. Bovendien, verschillende materialen vereisen verschillende polarisator instellingen. Hoewel grote stap maten werden hier gebruikt om het effect van de polarisatie hoek aan te tonen, in een effectief experiment, is het nood...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dr Anthony S. stender wenst te erkennen technische ondersteuning via de Nanoscale en Quantum fenomenen Institute (NQPI) aan de Ohio University. Dit artikel werd mogelijk gemaakt doorstart-up financiering verstrekt aan Dr stender door Ohio University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Contrad 70Decon Labs, Inc.1002Voor het schoonmaken van microscoopglas, verkrijgbaar bij veel chemische leveranciers
EthanolFisher ScientificA962-4Voor het schoonmaken en opslaan van microscoopglas
Glazen microscoopdekjesTed Pella260148
Glazen microscoopglazenTed Pella26007
Gouden nanostavenNanopartzDIAM-SPR-25-650
Goudnanospheren (80 nm)Sigma Aldrich742023-25ML
ImageJNIHN/AGratis software beschikbaar voor data-analyse van NIJ
NagellakElectron Microscopy Sciences72180
Nikon Ti-E microscoopNikonN/A
StikstofgasAirgasN/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digitale sCMOS-cameraHamamatsu77054098
TekenpenAmazonN/AVeel opties beschikbaar online voor minder dan $10. Het is niet nodig om een dure versie te kopen.
Ultrapuur water18 megaohm

Referenties

  1. Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. Advanced Light Microscopy. 2, Elsevier. 146-197 (1989).
  2. Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response. ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).
  3. Stender, A. S., et al. Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy. Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).
  4. Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope. Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).
  5. Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , Wiley. 1-20 (2012).
  6. Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy. Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).
  7. Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).
  8. Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).
  9. Mulvaney, P. Not All That's Gold Does Glitter. MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).
  10. Maier, S. A. Plasmonics: Fundamentals and Applications. , Springer US. (2007).
  11. Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells. Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).
  12. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).
  13. Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles. Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).
  14. Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 2: Light and Color. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , Wiley. 21-33 (2012).
  15. Wayne, R. Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light. Light and Video Microscopy (Second Edition). , Academic Press. 43-78 (2014).
  16. Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries. The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).
  17. Hu, M., et al. Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance. Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).
  18. Choo, P., et al. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).
  19. Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries. Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DIC microscopiespectroscopie van enkelvoudige deeltjesK hler verlichtingbanddoorlaatfilterImageJ analysecontrastmetingintensiteitsprofielanalyserotatie van de polarisatormonstervoorbereiding

Gerelateerde artikelen