Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence

Samenvatting

We presenteren de protocollen te onderzoeken muis hart ontwikkelen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende op muis embryo's ontleed van ventriculaire specifieke MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen. Deze methode laat ons direct visualiseren van elke fase van de ventriculaire formatie tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis zonder arbeidsintensieve histochemische methoden.

Samenvatting

Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een methode voor de dissectie van muis embryo's en visualisatie van muis embryonale ventriculaire kamers tijdens hart ontwikkelen met behulp van ventriculaire specifieke fluorescerende verslaggever knock-in muizen (MLC-2v-tdTomato muizen). Hart ontwikkeling betekent een lineaire hart buis formatie, hart buis looping, en vier kamer septation. Deze complexe processen zijn zeer bewaard in alle gewervelden. De muis embryonale hart is wijd verbeid gebruikt voor hart developmental studies. Vanwege hun extreem kleine grootte is ontrafeling van muis embryonale harten echter technisch uitdagende. Bovendien moet de visualisatie van cardiale kamer vorming vaak in situ hybridisatie, beta-galactosidase kleuring met LacZ verslaggever muizen of immunokleuring van verdeelde embryonale harten. Hier beschrijven we hoe om te ontleden van muis embryonale harten en direct visualiseren ventriculaire kamer vorming van MLC-2v-tdTomato muizen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende. Met deze methode is het mogelijk direct onderzoeken hart buis vorming en in een lus, en vier kamer vorming zonder verdere experimentele manipulatie van muis embryo's. Hoewel de MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muis lijn als een voorbeeld in dit protocol wordt gebruikt, kan dit protocol worden toegepast op andere hart-specifieke fluorescerende verslaggever transgene muis lijnen.

Inleiding

De formatie van de kamer tijdens de ontwikkeling van het hart is een complex proces dat overstappen via verschillende morfologisch verschillende embryonale fasen^1,2. De halve maan vorm van cardiale voorlopercellen bevolking vormt een lineaire hart buis en vervolgens ondergaat rek en looping vormen de spiraalvorm van de ontwikkelingslanden hart. Na haar septation proces, het derde hart omgevormd tot het 4-chambered hart. Onderbreking van om het even welk van deze processen resulteert in developmental hartafwijkingen. Het is dus belangrijk om te begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van de kamer tijdens de ontwikkeling van het hart. Ondanks talrijke eerdere studies over hart ontwikkeling blijft ons begrip van dit complexe proces beperkt.

Kruising in situ, immunohistochemistry, en beta-galactosidase kleuring met behulp van LacZ verslaggever muizen zijn wijd gebruikt om te bestuderen van de vorming van de kamer tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis door labeling cardiale specifieke of kamer specifieke structurele genen of eiwitten (bijvoorbeeld Nppa, Coup-TFII, Irx4, MLC-2a en MLC-2v)^{3,4,5,6,7,8,9,10}. Echter, deze experimenten met behulp van de muis embryo's vereist heel wat tijd en deskundigheid, omdat meerdere verschillende experimentele stappen moeten worden uitgevoerd achtereenvolgens¹¹. Hier beschrijven we een eenvoudige hele mount epifluorescerende microscopie methode om te visualiseren de ontwikkelende ventrikels gebruik van embryo's van MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen¹²ontleed. Het voordeel van deze methode ten opzichte van eerder gebruikte methoden is om te voorkomen dat complexe experimentele stappen die vaak experimentele varianten kunnen maken. Het hoofddoel van dit protocol is te beschrijven hoe te muis embryo's en ontwikkelende harten ontleden en te onderzoeken elke ontwikkelingsfase muis cardiale kamer zonder vervelende histochemische experimenten. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast om te beoordelen hart ontwikkelen met behulp van verschillende andere transgene muis lijnen labeling van vroege cardiale markeringen (bijvoorbeeld, Mesp1Cre: Rosa26EYFP¹³, Isl1Cre: Rosa26EYFP¹³, Hcn4H2BGFP¹⁴, Hcn4Cre: Rosa mT /mG¹⁴, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Hcn4-eGFP¹⁵, Isl1Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato¹⁵, en TgMef2c-AHF-GFP¹⁶ muizen).

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Vanderbilt University Medical Center institutionele Animal Care en gebruik Comité.

1. de embryo's worden verzameld en dissectie muis

1. 8-10 week oude vrouwelijke MLC-2v-tdTomato^+/- muizen met 8-10 week oude mannelijke MLC-2v-tdTomato^+/- muizen te verkrijgen van MLC-2v-tdTomato mate^{+/ +}, MLC-2v-tdTomato^+/- en MLC-2v-tdTomato^{- / -} embryo's.
2. Controleer de dammen voor vaginale stekkers elke ochtend. 'S middags op de dag van vaginale plug detectie wordt beschouwd als E0.5.
   Opmerking: Vaginale onderzoek voor het opsporen van een vaginale stekker moet worden verricht in de ochtend (binnen 8-24 uur na de seksuele activiteit), aangezien een vaginale plug verloren gedurende de dag worden kan.
3. Euthanaseren van de zwangere dammen op verschillende dagen post coitum (b.v., E8.5, E10.5 en E12.5) met behulp van CO₂ inademing gevolgd door cervicale dislocatie.
4. Leg de muizen liggende en 70% ethanol spuiten op de buik van muizen om muis haar besmetting tijdens dissectie te voorkomen.
5. Open de buikholte door insnijding van de huid en de buikwand met scherpe chirurgische schaar en een forcep.
6. Zoek bilaterale baarmoeder horens in het dorsale deel van de buikholte.
7. Scheid de hele baarmoeder door zorgvuldig snijden boven de oviducts aan beide zijden met behulp van scherpe chirurgische schaar en een forcep.
8. Plaats van de gehele ontleed baarmoeder in een 10 cm petrischaal met ijskoude PBS en zorgvuldig scheiden elke vruchtwater sac langs de baarmoeder hoorn met scherpe chirurgische schaar en een forcep.
9. Pipetteer elk embryo in individuele putjes van 6 goed plaat gevuld met ijskoude PBS met behulp van een precisiepipet overdracht.
10. Onder een Microscoop ontleden, een vruchtwater sac open en bloot elk embryo door het afsnijden van de navelstreng met behulp van scherpe chirurgische schaar en een forcep in een individuele put van een 6 goed plaat met ijskoude PBS.
11. Bijsnijden uit de extra embryonale weefsels zo veel mogelijk zonder beschadiging van het embryo met scherpe chirurgische schaar en een forcep.
    Opmerking: Hele mount epifluorescerende beeldvorming van hele muis embryo wordt meestal uitgevoerd vóór de ontrafeling van het ontwikkelende hart, zoals hieronder beschreven.
12. Snijd het embryo hoofd met behulp van scherpe chirurgische schaar, een forcep en een overdracht tot een 1,5 mL koker met 100 µL van buffer A (25 mM NaOH en 0,2 mM EDTA) voor genotypering te correleren met de resultatenvan epifluorescerende imaging.
13. Openen van de borst van het embryo met fijne pincet, verwijder het hart uit de buurt van de longen en de therapieën met scherpe chirurgische schaar en pincet en breng het ontleed embryonale hart in een putje van een 12 goed plaat met PBS met behulp van een precisiepipet overdracht. Alle dissectie procedures zijn voltooid onder een ontleden Microscoop met een fiber optic Microscoop illuminator.
    Opmerking: Het was technisch moeilijk te ontleden van muis embryonale harten op E8.0 of E8.5, vanwege hun extreem kleine grootte en fragiele structuur. Vroege embryonale harten (dat wil zeggen E8.0 en E8.5) kan worden onderzocht binnen de hele berg embryo zonder dissectie.

2. geheel-mount epifluorescence imaging

1. Plaats de 12 goed plaat met muis embryonale hart onder een epifluorescerende ontrafeling van Microscoop.
2. Onder een epifluorescerende ontrafeling van Microscoop met fijne pincet, plaatst u het embryonale hart zodanig dat ontwikkelingslanden ventrikels zich dicht bij de examinator bevinden.
3. Aanpassen gericht van de afbeelding met de doelstelling van een 0.63 x (zoombereik tussen 3.15 x en 18,9 x) in heldere veld modus.
4. Neem heldere veld belichtingen en meerdere beelden vastleggen. De beelden werden meestal verkregen door één seconde blootstelling. Belichtingstijden kunnen echter variëren, afhankelijk van de verlichting en de camera specificationss en moet worden geoptimaliseerd voor elke setup.
5. Een vezel optische Microscoop illuminator uitschakelen en instellen van het filter voor rode fluorescentie (Ex545 nm/Em 605 nm) te visualiseren van tdTomato expressie.
6. Opnieuw aanpassen gericht van de afbeelding indien nodig.
7. Helderheid en contrast aanpassen en rode fluorescerende belichtingen nemen meerdere opnamen.
   Opmerking: De volgende afbeelding instelling werd meestal gebruikt: 2 x winst, 1.0 verzadiging en 1.0 gammacorrectie, 1 s blootstelling tijd. De optimale instelling moet worden geoptimaliseerd voor elk experiment. Zodra de optimale instelling wordt bepaald, moet dezelfde instelling worden gebruikt voor een hele experiment.

3. genotypering

1. Kook de monsters uit stap 1.12 gedurende 1 uur bij 100 ° C.
2. Centrifugeer gedurende 2 min 11,360 x goverdracht 20 µL van de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis met 20 µL van buffer B (40 mM Tris HCl, pH 5.5) en meng ze.
3. Nemen 4.5 µL van het gemengde supernatans uit stap 3.2 als een DNA-sjabloon, combineren met 0,5 µL van elk van de specifieke voorwaartse en omgekeerde inleidingen (10 µM), 10 µL van vooraf gemengde polymerase en reactie buffer (2 x) (Zie Tabel of Materials), en voeg vervolgens water toe tot een totale v volume van 20 µL. Primer sequenties zijn zoals hieronder.
   F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
   R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
   F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
   R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3'
4. Voer een polymerase-kettingreactie (PCR) met het volgende programma van de PCR (tabel 1 en tabel 2).
5. Uitvoeren van PCR monsters en DNA ladder op een 1% agarose gel op 140 V in 1 x TAE (Tris-acetaat-EDTA) buffer (40 mM Tris-acetaat en 1 mM EDTA) voor 25 min. gebruiken een 100 bp DNA-ladder te schatten van de omvang van de PCR-bands.
6. Plaats de DNA-gel op een UV-transilluminator te identificeren van de DNA-bands en zet op het UV licht.

Resultaten

Tijdens de ontwikkeling van het hart, MLC-2v wordt beschouwd als de vroegste markering voor ventriculaire zaal specificatie¹⁷. Zoals afgebeeld in Figuur 1, we ontleed muis hele embryo's en embryonale harten van MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen en onderzocht MLC-2v-tdTomato verslaggever expressie tijdens de ontwikkeling van het hart. MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen, constitutief tdTomato expressie in de ontwikke...

Discussie

De hier beschreven methode is relatief eenvoudig te onderzoeken ventriculaire kamer ontwikkeling, zonder arbeidsintensieve experimenten om label ventriculaire of cardiale-specifieke structurele genen of eiwitten uit te voeren. Dus, deze methode minimaliseert technische variabiliteiten die vaak in immunostained hart secties gevonden werden.

Er zijn twee belangrijke stappen voor het succesvol uitvoeren van deze methode, met inbegrip van precieze schatting van de embryonale leeftijd van muizen en...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
dissectiemicroscoop	Leica	MZ125
DNA ladder (100 bp)	Promega	G2101
epifluorescentie dissectiemicroscoop	Leica	M165 FC
GoTaq Green master Mix	Promega	M712
PCR-apparaat (master cycler)	Eppendorf	6336000023