We presenteren de protocollen te onderzoeken muis hart ontwikkelen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende op muis embryo's ontleed van ventriculaire specifieke MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen. Deze methode laat ons direct visualiseren van elke fase van de ventriculaire formatie tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis zonder arbeidsintensieve histochemische methoden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een methode voor de dissectie van muis embryo's en visualisatie van muis embryonale ventriculaire kamers tijdens hart ontwikkelen met behulp van ventriculaire specifieke fluorescerende verslaggever knock-in muizen (MLC-2v-tdTomato muizen). Hart ontwikkeling betekent een lineaire hart buis formatie, hart buis looping, en vier kamer septation. Deze complexe processen zijn zeer bewaard in alle gewervelden. De muis embryonale hart is wijd verbeid gebruikt voor hart developmental studies. Vanwege hun extreem kleine grootte is ontrafeling van muis embryonale harten echter technisch uitdagende. Bovendien moet de visualisatie van cardiale kamer vorming vaak in situ hybridisatie, beta-galactosidase kleuring met LacZ verslaggever muizen of immunokleuring van verdeelde embryonale harten. Hier beschrijven we hoe om te ontleden van muis embryonale harten en direct visualiseren ventriculaire kamer vorming van MLC-2v-tdTomato muizen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende. Met deze methode is het mogelijk direct onderzoeken hart buis vorming en in een lus, en vier kamer vorming zonder verdere experimentele manipulatie van muis embryo's. Hoewel de MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muis lijn als een voorbeeld in dit protocol wordt gebruikt, kan dit protocol worden toegepast op andere hart-specifieke fluorescerende verslaggever transgene muis lijnen.
Inleiding
De formatie van de kamer tijdens de ontwikkeling van het hart is een complex proces dat overstappen via verschillende morfologisch verschillende embryonale fasen1,2. De halve maan vorm van cardiale voorlopercellen bevolking vormt een lineaire hart buis en vervolgens ondergaat rek en looping vormen de spiraalvorm van de ontwikkelingslanden hart. Na haar septation proces, het derde hart omgevormd tot het 4-chambered hart. Onderbreking van om het even welk van deze processen resulteert in developmental hartafwijkingen. Het is dus belangrijk om te begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Vanderbilt University Medical Center institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. de embryo's worden verzameld en dissectie muis
- 8-10 week oude vrouwelijke MLC-2v-tdTomato+/- muizen met 8-10 week oude mannelijke MLC-2v-tdTomato+/- muizen te verkrijgen van MLC-2v-tdTomato mate+/ +, MLC-2v-tdTomato+/- en MLC-2v-tdTomato- / - embryo's.
- Controleer de dammen voor vaginale stekkers elke ochtend. 'S middags op de dag van vaginale plug detectie wordt beschouwd als E0.5.
Opmerking: Vaginale onderzoek....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tijdens de ontwikkeling van het hart, MLC-2v wordt beschouwd als de vroegste markering voor ventriculaire zaal specificatie17. Zoals afgebeeld in Figuur 1, we ontleed muis hele embryo's en embryonale harten van MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen en onderzocht MLC-2v-tdTomato verslaggever expressie tijdens de ontwikkeling van het hart. MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen, constitutief tdTomato expressie in de ontwikke.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methode is relatief eenvoudig te onderzoeken ventriculaire kamer ontwikkeling, zonder arbeidsintensieve experimenten om label ventriculaire of cardiale-specifieke structurele genen of eiwitten uit te voeren. Dus, deze methode minimaliseert technische variabiliteiten die vaak in immunostained hart secties gevonden werden.
Er zijn twee belangrijke stappen voor het succesvol uitvoeren van deze methode, met inbegrip van precieze schatting van de embryonale leeftijd van muizen en.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) en Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. N).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| dissectiemicroscoop | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescentie dissectiemicroscoop | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR-apparaat (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
Referenties
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015). ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
