Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

10.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59414

⸱

24 april 2019

 , 
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln

In dit artikel

Samenvatting

Reproducibly het om getallen te tellen van mRNAs in individuele eicellen, enkel molecuul RNA fluorescentie in situ is hybridisatie (RNA-vis) geoptimaliseerd voor niet-aanhanger cellen. Eicellen werden verzameld, gekruist met het transcript specifieke sondes en gekwantificeerd aan de hand van een afbeelding kwantificering software.

Samenvatting

Huidige methoden routinematig gebruikt om mRNA te kwantificeren in eicellen en embryo's omvatten digitale omgekeerde-transcriptie polymerase-kettingreactie (dPCR), kwantitatieve, real-time RT-PCR (RT-qPCR) en RNA sequencing. Wanneer deze technieken worden uitgevoerd met behulp van een enkele oöcyt of embryo, zijn laag-kopie mRNAs niet betrouwbaar gedetecteerd. Om dit probleem te verhelpen, kunnen eicellen of embryo's worden gepoold samen voor analyse; Dit leidt echter vaak tot hoge veranderlijkheid onder de monsters. In dit protocol beschrijven we het gebruik van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met behulp van vertakte DNA chemie. Deze techniek geeft het ruimtelijk patroon van mRNAs in afzonderlijke cellen. Wanneer de techniek is gekoppeld aan het vinden van de plek en de opsporingssoftware van de computer, kan de overvloed van mRNAs in de cel ook worden gekwantificeerd. Met behulp van deze techniek, er is verminderde variabiliteit binnen een experimentele groep en minder eicellen en embryo's zijn nodig voor de detectie van verschillen tussen experimentele groepen. Verkrijgbare vertakt-DNA SM-vis kits zijn geoptimaliseerd om te sporen mRNAs in verdeelde weefsels of Adherente cellen op dia's. Echter eicellen niet effectief voldoen aan dia's en sommige reagentia in de kit waren te hard resulterend in lysis van de oöcyt. Om te voorkomen dat deze lysis, verschillende wijzigingen aangebracht aan de vis-kit. In het bijzonder vervangen oöcyt permeabilization en wastafel buffers ontworpen voor de immunofluorescentie van eicellen en embryo's de merkgebonden buffers. De permeabilization, wast en incubations met sondes en versterker werden uitgevoerd in 6-Wells-platen en eicellen werden op dia's aan het einde van het protocol gebruik van montage media geplaatst. Deze wijzigingen waren in staat om te overwinnen van de beperkingen van de verkrijgbare kit, in het bijzonder de lysis van de oöcyt. Als u reproducibly en nauwkeurig tellen het aantal mRNAs in individuele eicellen, werd computersoftware gebruikt. Samen, vertegenwoordigt dit protocol een alternatief voor PCR en rangschikken om te vergelijken van de expressie van specifieke afschriften in afzonderlijke cellen.

Inleiding

Reverse-transcriptase polymerase-kettingreactie (PCR) is de gouden standaard voor mRNA kwantificatie. Twee tests, digitale PCR (dPCR)1 en kwantitatieve, real time PCR (qPCR)2 worden momenteel gebruikt. Van de twee PCR technieken heeft dPCR grotere gevoeligheid dan qPCR suggereren dat het kan worden gebruikt voor het meten van de mRNA overvloed in afzonderlijke cellen. Echter, in onze handen, dPCR analyse van lage overvloed mRNAs in poules van 5 tot en met 10 eicellen per elk experimentele monster heeft gegevens met lage reproduceerbaarheid en hoge variatie3. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de experimentele fout RNA extractie en omgekeerde transcriptie efficiëntie is gekoppeld. RNA sequencing is ook uitgevoerd met behulp van een enkele muis en menselijke eicellen4,5. Deze techniek vereist cDNA amplificatie stappen die nodig zijn voor de bibliotheek-generatie waardoor waarschijnlijk variabiliteit binnen een experimentele groep. Bovendien, lage overvloed afschriften mogelijk niet aantoonbaar. Hoewel sequencing prijzen zijn gedaald in de afgelopen jaren, kan het nog steeds kosten onbetaalbaar vanwege de hoge kosten van bioinformatica analyses. Ten slotte, mRNA lokalisatie is een dynamisch proces met ruimtelijke veranderingen bij te dragen aan eiwit functie6. Daarom zetten we uit te nemen van een techniek die nauwkeurige en reproduceerbare kwantitatieve maatregelen en lokalisatie van individuele mRNAs in enkele eicellen produceren zou.

Vertakte DNA gekoppeld aan fluorescentie in situ hybridisatie versterkt fluorescentie signaal in plaats van uitdeinende RNA/cDNA inschakelen detectie van één mRNAs in afzonderlijke cellen 7,8,9. De test wordt uitgevoerd door middel van een reeks van hybridisatie, versterking (met behulp van vertakte DNA) en fluorescentie labeling stappen om het versterken van de fluorescentie signaal7. De techniek begint met bindende 18 - tot 25-base oligonucleotide sonde-paren die complementair aan een specifieke mRNA3,8,10 zijn. Vijftien tot twintig sonde paren zijn ontworpen voor elke specificiteit transcript te zorgen voor het transcript van de doelgroep. De mRNA specifieke hybridisatie wordt gevolgd door voorversterker en versterker sondes die een vertakte configuratie vormen. Ongeveer binden 400 label fluorophores aan elke versterker, resulterend in een verhoging van de 8000-fold in fluorescentie waardoor detectie van individuele mRNAs (Figuur 1)11.

figure-introduction-1
Figuur 1: schematische van de SM-vis protocol. Sequentiële kruising van transcript specifieke sonde, vertakt DNA versterker en fluorophore naar een doel dat mRNA wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Eerdere studies met behulp van één molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (SM-vis) gelokaliseerd β-actine mRNAs in individuele neuronen12 en humaan papillomavirus DNA in cervicale kanker cel lijnen7. De computersoftware plek vinden en Tracking programma identificeert individuele punctate fluorescent signaal en is met succes gebruikt om het aantal mRNAs in elke cel3,13te kwantificeren.

Op basis van de resultaten van mRNA detectie in neuronen12, veronderstelde wij dat SM-vis zou blijken een nuttig hulpmiddel om te kwantificeren transcript niveaus in lymfkliertest eicellen en embryo's met inbegrip van lage overvloed mRNAs. Echter, de techniek is geoptimaliseerd voor het gebruik met aanhangend vaste cellen en formaldehyde vaste paraffine ingesloten weefselsecties (FFPE). Eicellen niet kunnen voldoen aan een dia, zelfs wanneer ze zijn bekleed met een Poly-L-lysine. Bovendien zijn ze kwetsbaarder dan somatische cellen en weefselsecties resulterend in lysis van de cel wanneer onderworpen aan sommige van de merkgebonden buffers in commercieel beschikbare kits3. Om deze uitdagingen te overwinnen, waren de eicellen vast en handmatig worden overgedragen tussen de buffers druppels. Bovendien, permeabilization en wastafel buffers in de kits werden vervangen ter vermindering van de lysis van de cel. Vooraf ontworpen sondes worden gekocht naast de vis kit of specifieke afschriften kunnen aangevraagd worden. Elke set merkgebonden sonde is beschikbaar in een van de drie kanalen van de fluorescentie (C1, C2 en C3) om multiplexing mogelijk te maken. In het huidige experiment waren lymfkliertest eicellen dual-gekleurd en gekwantificeerde met behulp van een sonde C2 Nanog en een C3 Pou5f1 -sonde. Deze sondes werden geselecteerd op basis van de gerapporteerde uitdrukking van Nanog en Pou5f1 in eicellen en embryo's. Aan het einde van de kruising stappen, werden de eicellen in druppels anti-fade montage media voor toepassing op histologische dia's geplaatst. Confocale afbeeldingen werden gebruikt om het kwantificeren van het aantal punctate fluorescerende signalen die individuele mRNAs vertegenwoordigen. Naast het kwantificeren van de mRNAs, imaging bleek ook de ruimtelijke spreiding van de specifieke mRNA in de cel, zijn welke andere RNA kwantificering methoden niet in staat om te bereiken. Deze techniek bleek te hebben lage variabiliteit binnen een experimentele groep toestaan van het gebruik van kleinere aantallen van eicellen in elke experimentele groep te identificeren van significante verschillen tussen experimentele groepen3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierlijke procedures werden herzien en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Universiteit van Nebraska-Lincoln en alle methoden werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Voor deze studie, CD-1 outbred muizen had ad libitum toegang tot normale knaagdier chow en water; zij werden onderhouden in een 12:12 donker: cyclus licht.

1. voorbereiding van de vereiste media

  1. Voor base media (OMM), 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.5 mM KH2PO4en 1,7 mM CaCl2-2 H2O toevoegen aan 100 mL steriel water.
    Opmerking: OMM medium kan worden opgeslagen voor maximaal 1 maand.
  2. Voor volledige media (OMOPS), Voeg 20 mM 3-morpholinopropane-1-Sulfonzure zuur (MOPS), 1.2 mM MgSO4-7 H2O, glucose van 0.5 mM, 6 mM L-lactaat, 1 mM ala-gln, 0.1 mM taurine, 1 x niet-essentiële aminozuren (NEAA), ethyleendiamminetetra zuur (0,01 mM) EDTA), 10 µM Alfa liponzuur, 10 µg/mL onverdund gentamicine, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM NaHCO3, 0,2 mM pyruvaat, 0.5 mM citraat, 4 mg/mL FAF BSA naar een 1:10 verdunning van OMM in steriel water voor een totaal volume van 100 mL. Steriliseren het medium met een 0,22 µM filter.
    Opmerking: OMOPS kunnen worden opgeslagen voor maximaal 1 week.
  3. Toevoegen 5% foetale runderserum aan OMOPS voor het bedrijf medium (HM). Vul 2 mL HM per muis.
  4. Voor hyaluronidase toevoegen oplossing 0,1 mg/mL hyaluronidase afgeleid van runderen testes, 1 mL HM.
  5. Voor de fixatie buffer combineren 4% paraformaldehyde in 10 mL 1 x PBS samen met 0,1% embryo rang Polyvinylpyrrolidon (PVP)14.
  6. Ter voorbereiding van 50 mL was buffer (WB), het toevoegen van niet-ionogene oppervlakteactieve stof van 0,1% en 0,1% PVP op 1 x PBS14.
  7. Toevoegen aan bereiden 10 mL permeabilization buffer, 1% niet - ionogene oppervlakteactieve stof tot en met 1 x PBS14.
    Nota: Vervang de buffers van het wassen en permeabilization zoals hierboven beschreven de merkgebonden buffers in de handel verkrijgbare kits.

2. verzameling van algemeen eicellen van vrouwelijke muizen

  1. Bereiding:
    1. Stimuleren van vrouwelijke muizen op 5-8 weken oud door intraperitoneale injectie van (IP) van 5 IU paarden choriongonadotrofine (eCG) gevolgd door 5 IU humaan choriongonadotrofine (hCG) 44-48 h later15,16.
    2. 35 mm petrischalen met 2 mL HM op een opwarming van de aarde plaat van 37 ° C te houden. Pipetteer een, 100-µL druppel HM met verdunde hyaluronidase gevolgd door drie, 50 µL druppels HM zonder hyaluronidase in een petrischaal 60 mm. Plaats de platen met druppels op de opwarming van de 37 ° C voorafgaand aan gebruik plaat.
      Nota: De hyaluronidase druppels moeten worden gemaakt vóór de dissectie van elk paar oviduct om te voorkomen dat de verdamping en de concentratie van de bestanddelen van HM met of zonder hyaluronidase.
  2. Muizen, 16 h na de IP-injectie met hCG euthanaseren, met behulp van Isofluraan overdosis gevolgd door cervicale dislocatie.
  3. Reinig de muis met 70% ethanol. Bloot van de buikholte en visualiseren van het vrouwelijke voortplantingssysteem. Houd de eierstok met pincet en verwijder de baarmoeder ligamenten en overtollige vetweefsel van rond de eierstok. Knip het oviduct van de baarmoeder en het ovarium-oviduct paar in de warme HM in de 35 mm-schotel plaatsen.
  4. Het verwijderen van de eierstok en alle omliggende vetweefsel. Scheur de gezwollen Papil van het oviduct met behulp van een ½ inch 27-gauge naald. Duw het oviduct op de plaats van de scheur en de cumulus cel-oöcyt complexen (COCs) zal worden uitgezet. Overdracht van de ovulated eicellen, die worden geacht in de metafase II (MII) van meiose, aan de daling van de 100 μl met HM media met hyaluronidase met behulp van een precisiepipet mond (Figuur 2).

figure-protocol-1
Figuur 2 : Delen van de mond pipet gebruikt voor de overdracht van de eicellen. (A) mond stuk (B) 0.22 um, 4 mm filter (C) aspirator buis (D) 1000 μL pipet tip (E) 9" Pasteur Pipetteer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Pipetteer de MII oöcyt-cumulus cel complexen op en neer in de hyaluronidase met HM met de mond pipet te verjagen cumulus cellen. Overdracht van elke oöcyt, zodra zij zijn verstoken van cumulus cellen naar een wash neerzetten met HM alleen met behulp van de mond pipet. Herhaal dit voor elke druppel wassen. Gefragmenteerde of transparante eicellen15niet overdragen.
    Opmerking: Het is belangrijk dat de eicellen van elke daling in de 35 mm-schotel met als weinig HM mogelijk overbrengen. Dit geldt voor elke overdracht in het protocol. De MII eicellen mag niet blijven in de hyaluronidase HM medium met meer dan een minuut.

3. SM-vis kleuring van eicellen

  1. Corrigeer eicellen in een individuele putje van de plaat van een 6-well met 500 µL van fixatie Buffer. 20 eicellen dompelen of minder in de put. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Elke SM-vis kleuring stap gebeurt binnen een afzonderlijke put in een 6-well conische plaat. Ervoor zorgen dat eicellen volledig ondergedompeld in buffers en niet zwevend op de top van de buffer. Elke stap moet worden uitgevoerd met 20 eicellen of minder in elk putje.
  2. Vaste eicellen overbrengen 500 μL van was buffer (beschreven in stap 1.6 WB) voor elke 10 min. Herhaal 2 vaker.
  3. Eicellen in permeabilization buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    Opmerking: De buffer van de permeabilization beschreven in stap 1.7 vervangt de correctheid permeabilization buffer.
    1. Verzamel sonde sets en draaien ze snel naar beneden in een microcentrifuge. Warme elke sonde ingesteld gedurende 10 minuten in een waterbad 40 ° C of incubator. Koel af tot kamertemperatuur.
      Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd tijdens de incubatie van permeabilization
  4. Wassen eicellen in 500 µL van WB gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Eicellen overbrengen in 80 μL van Protease III Buffer (verkrijgbaar bij de kit), die is verdund 1:8 in 1 X PBS, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Het volume van 80 µL adequaat heeft betrekking op de bodem van een individuele put in een 6-well-plate.
  6. Wassen eicellen in 500 µL van WB gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Verdun de verwarmde sonde sets voor Nanog, Pou5f1, en DapB (een negatieve controle-gen), 1:50 in sonde verdunningsmiddel. Eicellen in 80 μL van de chat-kopie-specifieke sonde Incubeer gedurende 2 uur op 40° C.
    Opmerking: Elke private sonde set is beschikbaar in een van de drie kanalen van de fluorescentie (C1, C2 en C3). De Nanog en Pou5f1 sondes waren gelabeld met C2 en C3, respectievelijk.
  8. Warm de merkgebonden, versterker 1 (1 AMP), versterker 2 (AMP2), 3 (AMP3) van de versterker en versterker 4-fluorescentie (AMP 4-FL) bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd tijdens de incubatie binnen 2 uur transcript-specifieke sonde.
  9. De eicellen overbrengen 500 μL van de WB en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Incubeer eicellen volgorde van versterking buffers.
    1. Eicellen in 80 µL van AMP1 gedurende 30 minuten op 40° C. overdracht eicellen tot 500 µL van WB gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    2. Incubeer eicellen in 80 µL van AMP2 voor 15 min bij 40 ° C. Eicellen overbrengen in 500 µL van WB gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Incubeer de eicellen in 80 µL van AMP3 gedurende 30 minuten bij 40 ° C. Eicellen overbrengen in 500 µL van WB gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: De rest van het protocol wordt uitgevoerd in het donker omdat AMP-FL de fluorophore bevat. Bij het werken onder de Microscoop ontleden, verminderen het licht zoveel mogelijk.
    4. Eicellen toevoegen aan 80 μL van AMP4-FL gedurende 15 minuten op 40° C.
      Opmerking: AMP4-FL worden verstrekt als alternatief buffer-A (Alt-A), Alt-B of Alt-C. Selecteer de AMP4-FL buffer afhankelijk op welke emissie golflengte is gewenst.
  11. Wassen eicellen in 500 µL van WB gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Eicellen in 80 µL van DAPI gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Wassen eicellen in 500 µL van WB gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Pipetteer 12 µL van anti-fading montage media in het midden van een dia zonder bubbels toe te voegen aan het reagens. Pipetteer van eicellen met als weinig WB mogelijk in de montage-media en breng een dekglaasje aan.
    1. Kantel het dekglaasje aan in een hoek en langzaam en voorzichtig plaats boven de vloeistof op de dia. Vermijd te hard om te voorkomen dat de vervorming van de eicellen en de invoering van bubbels indrukken van het dekglaasje aan.
    2. De dia's opslaan in een donkere kast te droge overnachting bij kamertemperatuur. Coat de randen van de dia's in duidelijke nagellak te verzegelen dekglaasje aan.
  13. Gebruik een standaard Microscoop te vinden van eicellen op de dia en de cirkel met een permanent marker.
    Opmerking: Deze stap is niet vereist maar lokaliseren eicellen op de dia verbetert. Voor het beste resultaat, foto dia's binnen 1 tot 5 dagen als het fluorescent signaal zal beginnen te vervagen.

4. de beeldverwerking

  1. Het imago van de 3-dimensionale eicellen, met behulp van z stap confocale microscopie.
    Opmerking: Voor het nauwkeurig analyseren van de beelden, moet elke stap z 1.0 µm/slice.
  2. Confocale afbeeldingen opslaan als een gecomprimeerd nd2 of individueel. TIFF-bestanden voor elke oöcyt. Beide afbeeldingstypen zijn compatibel met de open source image processing programma, Fiji.
  3. Download en installeer de software voor de open toegang-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    1. Sleep nd2 bestanden naar Fiji en kies hyperstack. Confocale afbeeldingen zijn opgeslagen als. TIFF-bestanden gaat u naar stap 4.4.
      Opmerking: Wanneer het bestand nd2 is gedaald in Fiji de dropdown hyperstack moet verschijnen automatisch.
    2. Klik op het tabblad afbeelding , kleurselecteren en klik op Kanalen splitsen om te scheiden van de fluorescerende kanalen van het nd2-bestand.
    3. Genereer afzonderlijke. TIFF-bestanden voor elk z-segment van de oöcyt in elk fluorescerende kanaal. Klik op het tabblad afbeelding , selecteer stapelsen klikt u op stapel aan beelden. Klik op het tabblad afbeelding , selecteer Typeen klik op RGB-kleuren als u wilt elke z segment omzetten in een individuele RGB color-afbeelding.
      Opmerking: De RGB-kleur is kunstmatige en kan worden gekozen als gewenst voor elke golflengte emissie.
    4. Sla elke geconverteerde afbeelding als. TIFF-bestand. Afbeeldingen uit een enkele oöcyt voor elk fluorescerende kanaal plaatsen in een nieuwe map om te voorkomen dat verwarring tijdens stiksels (stap 4.3).
  4. Normaliseren elk. TIFF-afbeelding voor Pou5f1 en Nanog met behulp van beelden van de negatieve controle (DapB).
    Opmerking: Normalization wordt uitgevoerd met behulp van een fotobewerkingsprogramma. Zorg ervoor dat dezelfde niveaus van achtergrond fluorescentie van elke controle-afbeelding verwijderen.
  5. Open elk genormaliseerd. TIFF-bestand in Fiji te stik alle z-segmenten voor elke oöcyt in elke golflengte.
    1. Klik op het tabblad Plugins , selecteer Stitchingen klik op Raster/collectie (figuur 3A). Opeenvolgende beelden selecteren in de vervolgkeuzelijst en Klik op OK (figuur 3B).
    2. Blader in de directory en selecteer de map met alle z-delige beelden voor een individuele oöcyt bij één golflengte (zie stap 4.3.4). Klik op OK.
    3. Verplaats de schuifregelaar bij de bodem van de gestikte beeld naar de juiste kleurkanaal voor de golflengte gebruikt en maken de uiteindelijke gestikte RGB-afbeelding door te klikken op beeld, Type, selecteren en klik op RGB-kleur.
      Opmerking: Deze afbeelding zal worden gebruikt voor fluorescentie kwantificatie in stap 4.6 hieronder beschreven.
  6. Het gestikte afbeelding omzetten in 32-bits maximale geprojecteerde beeld. Klik op de afbeelding, selecteer Typeen klikt u op 32-bits (Figuur 3 c). Deze afbeelding opslaan als een nieuwe. TIFF-bestand.

figure-protocol-2
Figuur 3 : Stitching samen confocal z-serie beelden van eicellen. (A) Screenshot de Plug-in raster/collectie tool in Fiji die werd gebruikt voor de productie van samengestelde afbeeldingen van de oöcyt tonen. (B) opeenvolgende beelden gebruikt fluorescentie overlapping tussen opeenvolgende. TIFF-bestanden voor het genereren van een samengestelde afbeelding. (C) de samengestelde afbeelding is opgeslagen als een 32-bits. TIFF-bestand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Download en installeer de plek vinden en Tracking programma13, die verkrijgbaar via de website voor D.R. Larson, een onderzoeker aan de nationale instituten van gezondheid National Cancer Institute (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson is). Download en installeer de virtuele machine van open toegang voor het besturingssysteem van het interactieve gegevens language (IDL) die is vereist voor het uitvoeren van de Spot vinden and Tracking Program (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
  2. Open de 32-bits, gestikte afbeelding, die is gegenereerd in stap 4.6 (figuur 4A), in de Spot vinden en Tracking Program. Selecteer de Lokaliseer dropdown en klik op Lokaliseer (figuur 4B), die zal het berekenen van het aantal plekken gevonden in de afbeelding.
    Opmerking: Elke vlek geteld vertegenwoordigt een afzonderlijke mRNA. Band pass en foton drempel instellingen worden weergegeven in de screenshot (figuur 4B). Voor dit protocol, de standaard voor elke drempel instelling werd gebruikt. Vertegenwoordiger positieve en achtergrond spots staan (figuur 4C).

figure-protocol-3
Figuur 4 : Kwantificering van mRNAs Spot Finder gebruiken en bijhouden. (A) individuele z-serie beelden waren samen zoals beschreven in Figuur 3 gestikt en opgeslagen als een 32-bits maximaal geprojecteerd. TIFF-bestand. (B) Composietbeeld werd geopend in de Finder van de plek en Tracking. Lokaliseren werd gebruikt om te tellen de fluorescerende vlekken (rode doos). Band pass en foton drempel worden aangegeven door het blauwe vak. (C) de blauwe pijl wijst naar een positief signaal (boven de drempel). De witte pijl toont een TL plek onder de drempel en, derhalve, niet meegeteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na de voltooiing van het protocol, het resultaat zal worden individuele beelden uit confocal z-serie (figuur 4A en Figuur 5), gestikte afbeeldingen (figuur 4C), en mRNA telt (figuur 4B). Wanneer multiplexing wordt uitgevoerd, zal ook er samengevoegde afbeeldingen tonen de label voor twee verschillende mRNAs (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een aantal kleine stappen tijdens het protocol zorgt voor succesvolle fluorescentie en nauwkeurige graven van mRNAs. Ten eerste moet het protocol worden uitgevoerd onmiddellijk na het verzamelen en fixatie van de eicellen. Merk op dat de PVP is toegevoegd aan de 4% paraformaldehyde fixatie buffer om te voorkomen dat eicellen kleven aan elkaar. We vonden dat het noodzakelijk is voor het uitvoeren van het experiment onmiddellijk na het verzamelen en fixatie van de eicellen is. Elke vertraging resulteert in een veel lagere ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te verklaren

Dankbetuigingen

Wij Dr. Daniel R. Larson bedanken voor zijn genereuze hulp met de installatie en het gebruik van het vinden van de plek en Tracking programma 13 en de technische ondersteuning van de Universiteit van Nebraska-Lincoln microscopie kern voor de beeldvorming van de confocal microscopie. Deze studie vormt een bijdrage van de Universiteit van Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska en werd gesteund door UNL Hatch fondsen (NEB-26-206/toetreding nummer-232435 en NEB-26-231/toetreding nummer-1013511).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(±)-α-Lipoic acidSigma-AldrichT1395Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty AcidMP Biomedicals, LLC199899FAF BSA
BD 10mL TB SyringeBecton, Dickinson and Company30965910 mL syringe
BD PrecisionGlide NeedleBecton, Dickinson and Company30510927 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC7902CaCl2-2H2O
Citric acidSigma-AldrichC2404Citrate
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG6152Glucose
Disodium phosphateNa2HPO4
Easy Grip Petri DishFalcon Corning35100835 mm dish
Edetate DisodiumAvantor8994-01EDTA
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine SerumAtlanta biologicalsS10250FBS
Gentamicin Reagent Solutiongibco15710-064Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)gibco35050-061Glutamax
Gold Seal Micro SlidesGold Seal303925 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' SerumSigmaG4877eCG
hCG recombinantNHPPAFP8456AhCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine TestesSigma-AldrichH3884Hyaluronidase
Jewelers Style ForcepsIntegra17-305XForceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid MP Biomedicals, LLC190228L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM2773MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino AcidsCorning 25-025-ClNEAA
Microscope Cover GlassFisher Scientific12-542-C25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope ProbeAdvanced Cell Diagnostics501891-C2Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope ProbeAdvanced Cell Diagnostics501611-C3Pou5f1 Probe
MOPSSigma-AldrichM3183
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterileMillex-GPSLGP033RS0.22 um filters
PolyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichP0930PVP
Potassium chlorideSigma-Aldrich60128KCl
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich60218KH2PO4
Prolong Gold antifade reagentinvitrogenP36934Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPIAdvanced Cell Diagnostics320858DAPI
RNAscope FL AMP 1Advanced Cell Diagnostics320852Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2Advanced Cell Diagnostics320853Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3Advanced Cell Diagnostics320854Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT AAdvanced Cell Diagnostics320855Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT BAdvanced Cell Diagnostics320856Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT CAdvanced Cell Diagnostics320857Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents KitAdvanced Cell Diagnostics320851FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics320871Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive ControlAdvanced Cell Diagnostics320881Positive Control
RNAscope Probe DiluentAdvanced Cell Diagnostics300041Probe Diluent
RNAscope Protease IIIAdvanced Cell Diagnositics322337Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics322340FISH Protease Kit
RNAscope Protease IVAdvanced Cell Diagnostics322336Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30GComponent Supply Co.NE-301PL-50blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6297NaHCO3
Sodium chlorideSigma-AldrichS6191NaCl
Sodium hydroxideSigma-Aldrich306576NaOH
Sodium pyruvate, >= 99%Sigma-AldrichP5280Pyruvate
Solution 6 Well DishAgtechincD186 well dish
TaurineSigma-AldrichT8691Taurine
Tissue Culture DishFalcon Corning35300260 mm dish
Triton X-100Sigma-AldrichX100Triton X-100

Referenties

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
  3. Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930(2018).
  4. Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
  5. Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
  6. Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
  7. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
  8. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  9. Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
  10. Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  11. Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , https://www.biotek.com/resources/application-notes/multiplexed-detection-of-cytokine-cancer-biomarkers-using-fluorescence-rna-in-situ-hybridization-and-cellular-imaging/ 1-5 (2016).
  12. Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
  13. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  14. Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
  15. Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
  16. Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
  17. Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
  18. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
  19. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
  20. Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
  21. Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4(2016).
  22. Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
  23. Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459(2017).
  24. Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
  25. Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, Elsevier Inc. (2016).
  26. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
  27. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855(2010).
  28. Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15(2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Single Molecule FISHmRNA kwantificeringfluorescentie in situ hybridisatiespot finding trackingconfocale microscopiepermeabilisatie van oocytenverdunning van proteasebuffermRNA lokalisatieco lokalisatieanalyse
Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.