Methodenartikel

Verbeterde bewaking van rabiës met behulp van een directe snelle immunohistochemische test

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59416

⸱

30 april 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

In dit artikel

Samenvatting

De directe Rapid immunohistochemische test (DRIT) biedt een Wereldorganisatie voor diergezondheid en Wereldgezondheidsorganisatie (OIE/WHO) erkend alternatief voor de direct fluorescent antilichaam (DFA) test voor de diagnose van rabiës. Deze test maakt het mogelijk voor veld-gebaseerde toepassingen die kunnen worden uitgevoerd in ongeveer 1 h na hersen vertoningen met behulp van Lichtmicroscopie.

Samenvatting

Laboratorium toezicht is een integraal onderdeel voor preventie, controle en beheer van rabiës. Hoewel de DFA de gouden standaard is voor de diagnose van rabiës, is het noodzakelijk om aanvullende diagnostische technieken te valideren om het toezicht op rabiës te verbeteren, met name in ontwikkelingslanden. Hier presenteren we een standaardprotocol voor de DRIT als een alternatieve, laboratorium of veld-gebaseerde test optie die Lichtmicroscopie gebruikt in vergelijking met de DFA. Aanraking indrukken van hersenweefsel verzameld van verdachte dieren zijn vastgesteld in 10% gebufferde formalin. De DRIT gebruikt rabiësvirus-specifieke monoklonale of Polyklonale antilichamen (geconjugeerd met biotine), een streptavidin-peroxidase enzym, en een chromogeen Reporter (zoals acetyl 3-amino-9-ethylcarbazol) om virale insluitsels binnen geïnfecteerd weefsel te detecteren. In ongeveer 1 uur kan een hersenweefsel monster worden getest en geïnterpreteerd door de DRIT. Evaluatie van verdachte dierlijke hersenen getest uit een verscheidenheid van soorten in Noord-Amerika, Azië, Afrika, en Europa hebben geïllustreerd hoge gevoeligheid en specificiteit door de DRIT naderen 100% met resultaten in vergelijking met DFA. Sinds 2005, het Amerikaanse ministerie van landbouw Wildlife Services (USDA WS) programma heeft grootschalige versterkte rabiës surveillance inspanningen uitgevoerd met behulp van de DRIT te testen > 94000 monsters verzameld uit de natuur in strategische rabiës beheer gebieden . De DRIT biedt een krachtig, zuinig hulpmiddel voor de diagnose van rabiës, dat door laboratorianen en veld biologen kan worden gebruikt om de huidige bewakings-, preventie-en controleprogramma's van de rabiës wereldwijd te verbeteren.

Inleiding

Hoewel de DFA de meest gebruikte test is voor routine rabiës diagnose1, kunnen de aanschaf-en onderhoudskosten van een fluorescerende Microscoop worden beperkt tot ontwikkelingslanden2,3,4 en voor brede, grootschalige versterkte rabiës surveillance Programma's3,4. Bovendien vereist de DFA de mogelijkheid om monsters te koelen tijdens de fixatie en om monsters boven de omgevingstemperatuur te inbrotsen tijdens de antilichaam-antigeen reacties, wat een aanzienlijke hindernis kan zijn in landen zonder geschikte infrastructuur. Vanwege de beperkingen in verband met moderne DFA-testen, is de wereldwijde impact van hondsdolheid al lang onderschat5.

In dit verband is het noodzakelijk om aanvullende diagnostische technieken te valideren om het toezicht op rabiës wereldwijd te verbeteren, met name in ontwikkelingslanden. Het hier gepresenteerde DRIT-protocol biedt een laboratorium of veld-gebaseerd test alternatief voor de DFA die Lichtmicroscopie gebruikt en geen koeling of laboratorium incubatie nodig heeft tijdens de test6. De DRIT en DFA zijn vergelijkbaar in dat beide technieken Touch indrukken van hersen monsters verzameld uit mogelijk rabiate dieren gebruiken. Echter, de eerste stap van de DRIT gebruikt formaline als een historische fixeermiddel voor monsters, die rabiësvirus inactiveert. Dit zorgt voor een substantiële bioveiligheid verbetering ten opzichte van de aceton gebruikt om monsters te repareren in het DFA protocol3, dat is belangrijk niet alleen in het laboratorium, maar misschien nog meer in het veld-gebaseerde of gedecentraliseerde lab-omgevingen. Tot op heden toont de DRIT gevoeligheid en specificiteit gelijk aan de DFA2,7,8,9.

Sinds 2005 heeft het USDA WS programma grootschalige versterkte rabiës surveillance-inspanningen in Noord-Amerika uitgevoerd met behulp van de DRIT als onderdeel van een uitgebreid Wildlife rabiës Management programma10. De verscherpte bewaking van rabiës wordt gebruikt als aanvulling op op blootstelling gebaseerde volksgezondheids surveillance en-tests, voornamelijk in de fauna Meso-Carnivore soorten, waaronder wasberen (Procyon lotor), gestreepte Stink (Mephitis mephitis), Gray Foxes ( Urocyon cinereoargenteus), Rode Vossen (Vulpes vulpes) en coyotes (Canis latrans) die niet betrokken zijn geweest bij een blootstelling aan mens of huisdier. Dier karkassen die in het onderzoek zijn gebruikt, zijn aan USDA WS verstrekt door middel van verbeterde surveillance-inspanningen voor rabiës en bestond uit rabiës vector soorten die: ziek of vreemd handelen; dood aangetroffen, weggedood of hinderlijk; en zijn niet geassocieerd met een blootstelling aan mens of huisdier. De DRIT geeft een rabiës diagnostische test die kan worden gebruikt door getrainde veld biologen met weinig of geen laboratorium ervaring om het toezicht op rabiës te verbeteren en de financiële last en de werklast van de diagnostische laboratoria voor de volksgezondheid te verminderen10. De Basic DRIT training voor USDA WS veld medewerkers duurt meestal 1,5 tot 2 dagen, die ongeveer 4 h van de klas instructie met betrekking tot de fundamentele principes van bioveiligheid, methoden voor monster inzameling en de DRIT processen, alsmede > 8 h van laboratorium tijd die de test uitvoert. Er zijn opleidingsmogelijkheden beschikbaar voor USDA WS en Program coopera tors via de centra voor ziektebestrijding en preventie (CDC), LYSSA LLC en het Wistar Institute.

Binnen strategische beheer gebieden heeft USDA WS meer dan 94.000 Wildlife monsters getest met behulp van de DRIT en heeft meer dan 1.850 rabiate monsters gedetecteerd die waarschijnlijk onopgemerkt zouden zijn gebleven, waarbij alleen werd uitgegaan van blootstelling op basis van openbare gezondheidstests van verdachte dieren. Versterkte rabiës surveillancegegevens verstrekt door DRIT resultaten zijn van cruciaal belang voor het bieden van een completere temporele en ruimtelijke representatie van rabiës op het landschap ter ondersteuning van orale rabiësvaccinatie Programma's voor wilde dieren in de VS10, 11. Op dezelfde manier hebben provinciale natuur agentschappen in Canada DRIT in grootschalige Wildlife rabiës surveillance-inspanningen in tandem met hun volksgezondheidsprogramma's met succes8opgenomen. Zowel USDA WS als Canadian DRIT surveillance Programma's hebben nationale referentielaboratoria gebruikt om rabiës door DFA te bevestigen en een virale variant te typen die geschikt is voor8. Bovendien zenden USDA WS-veld biologen 10% van de negatieve specimens voor de bevestiging van DFA aan referentielaboratoria en sinds 2008, hebben deelgenomen aan tweejaarlijkse DRIT bekwaamheidsproeven die zijn verstrekt door het Wisconsin State Laboratory of Hygiene, als onderdeel van standaard maatregelen voor kwaliteitsborging.

Het doel van deze methode is om een alternatieve aanpak voor rabiës diagnostische tests die kunnen worden gedaan in gedecentraliseerde laboratoria, in het veld, of in gebieden zonder routine toegang tot elektronenmicroscopie bieden.

Protocol

Elke persoon die de diagnostische tests van rabiës uitvoert, moet een standaard vaccinatiereeks voor rabiës met een voor blootstelling ondergaan en regelmatig een serologische evaluatie van het antilichaam krijgen, met Booster-immunisaties indien nodig. Niet-geïmmobiliseerde personen mogen geen laboratoria of gebieden betreden waar dergelijke werkzaamheden worden uitgevoerd. Alle manipulatie van weefsels en dia's moet worden uitgevoerd om geen vloeistoffen te aerosoliseren of deeltjes in de lucht te produceren. Rook afzuigkappen zijn niet nodig, maar indien haalbaar kunnen ze extra bescherming bieden tegen geuren, ectoparasieten en botfragmenten. Minimale persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief handschoenen en oogbescherming, moeten tijdens het verzamelen en testen van monsters te allen tijde worden gedragen.

1. Brain stem collectie

  1. Verzamelmonsters van hersenstam onmiddellijk na het verzamelen van het karkas of zorg ervoor dat karkassen in vrieskisten worden geplaatst totdat ze later worden getest. Als karkassen zijn bevroren, ontdooien bij omgevingstemperatuur voorafgaand aan de collectie van brain stem voor het gemak van de inzameling. Onder bepaalde omstandigheden worden monsters rechtstreeks van een bevroren dier verzameld.
  2. Voor dieren die vers zijn ingezameld of zijn ontdooid tot aan de omgevingstemperatuur, plaatst u het dier op een vlakke ondergrond met de cervicale wervelkolom die lichtjes naar de examinator is gedraaid. Palpate om de atlanto-occipital joint op het laterale aspect van de cervicale wervelkolom te identificeren.
    1. Voor karkassen die nog volledig zijn bevroren, plaats de dieren rugligging zoals hierboven beschreven, indien praktisch. Gebruik zagen, messen, been scharen of soortgelijke apparatuur om het hoofd volledig van het lichaam te scheiden.
      Opmerking: Alle gebruikte apparatuur die niet eenmalig wordt gebruikt, moet grondig worden gereinigd tussen de monsters.
  3. Gebruik een scalpel-blad om een incisie te maken op het niveau van het atlanto-occipitale gewricht op het ventrale aspect, door alle lagen van spieren en weke delen te snijden, inclusief de luchtpijp en de slokdarm. Ga door totdat het voorste aspect van de cervicale wervelkolom wordt benaderd. Voor bevroren weefsel, gebruik een scalpel Blade om alle overgebleven lagen van spier en zacht weefsel te verwijderen om de foramen magnum bloot.
  4. Beweeg de kop van het dier in de eindbereik verlenging tot de hersenstam zichtbaar is. Gebruik een scalpel Blade om alle zichtbare hersenstam/centrale zenuwstelsel (CNS) weefsel voor bemonstering te verwijderen. Voor een bevroren monster, gebruik een scalpel Blade om zoveel mogelijk van de bevroren hersenstam/CNS weefsel te verwijderen van binnen de schedel.
  5. Plaats de monsters van de hersenstam in een onbreekbaar reservoir (d.w.z. metalen zalf tin, Cryo-injectieflacon, enz.) en breng het etiket dienovereenkomstig aan.
  6. Zorg ervoor dat de monsters van de hersenstam onmiddellijk na het verzamelen worden getest via de DRIT test, gekoeld (4 °C) tot 24 uur vóór het testen, of bevroren (-20 °C) tot het moment van testen, indien de test meer dan 24 uur na de monsterafname plaatsvindt.

2. voorbereiding van de materialen voor DRIT

  1. 10 dia-kleurings gerechten instellen (figuur 1)
    Opmerking: Kleurings gerechten zijn diep genoeg om een volledige onderdompeling van de glijbaan mogelijk te maken (diameter 96 mm, hoogte 72 mm, diepte 42 mm, volume 250 mL). 6
    1. Vul schotel 1 met 10% fosfaatgebufferde formalin. Vervang formaline na 2 test runs of wekelijks.
    2. Vul de gerechten 2, 4 en 5 met fosfaatgebufferde zoutoplossing met 1% Tween-80 (TPBS). Vervang met verse TPBS voor elke test.
    3. Vul schotel 3 met 3% waterstofperoxide. Vervang waterstofperoxide vóór elke test.
    4. Vul de gerechten 6, 8, 9 en 10 met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Vervang water voor elke test.
    5. Vul schotel 7 met kieuwen hematoxyline formulering #2 verdund in een 1:1 verhouding in gedistilleerd water6. Vervang hematoxyline na 2 test runs of wekelijks.
      Opmerking: Volgens het oorspronkelijke DRIT-protocol ontwikkeld door de CDC12, kan een 1:2-verhouding van kieuwen hematoxyline naar water worden gebruikt als tegen kleuring te donker is.
  2. Bereiding van amino-ethylcarbazol (AEC) stockoplossing
    1. Gebruik een glazen pipet en plaats 5 mL N, N-dimethylformamide in een glazen recipiënt.
    2. Voeg 1 20 mg tablet 3-amino-9-ethylcarbazol toe en schud totdat het volledig is opgelost. Label de pot met "AEC Stock" en de datum waarop de voorraad is gemaakt.
      Opmerking: De AEC stockoplossing kan worden bewaard onder koeling (4 °C) en gebruikt worden voor 1-2 maanden.
  3. Bereiding van de AEC-werkverdunning
    1. Voeg 7 mL acetaatbuffer toe aan een centrifugebuis van 15 mL.
    2. Voeg met behulp van een glazen pipet 0,5 mL van de AEC-voorraadoplossing toe aan de centrifugebuis.
    3. Voeg 0,075 mL van 3% waterstofperoxide toe aan de buis.
    4. Filter de oplossing met een injectiespuit van 10 mL met een spuit filter van 0,45 μm.
      Opmerking: De AEC-werkverdunning moet net voor elke DRIT test worden gemaakt, omdat deze alleen stabiel is voor 2-3 uur.

3. directe snelle immunohistochemie test

  1. Label Glass Microscoop dia's met een uniek nummer voor elk specimen met een uitstrijkje bestendige, waterbestendige, permanente inkt marker.
    1. Gebruik een scalpel-blad om de hersenstam uit de container te verwijderen en op een papieren handdoek te plaatsen. DEP voorzichtig overtollig vocht, bloed of bont weg met een tweede papieren handdoek om alleen het hersenstam weefsel13te onthullen. Indien nodig, sectie het hersenstam weefsel om een dwarsdoorsnede te onthullen.
    2. Raak de Microscoop-dia zeer voorzichtig aan de dwarsdoorsnede van het hersenstam weefsel. Raak de schuif aan de hersenstam op verschillende punten zonder laterale beweging, zodat meerdere delen van de hersenstam kunnen worden overgebracht naar dia13. Zorg ervoor dat slechts 1 of 2 lagen cellen van het hersenweefsel naar de glijbaan worden overgebracht met een zachte aanraking. Er is geen montage middel nodig om het hersenstam weefsel op de dia's aan te brengen. Neem zowel een positieve als een negatieve controle op in elke DRIT-run.
  2. Laat de lantaarnplaten ongeveer 5 minuten lucht drogen bij kamertemperatuur.
  3. Dompel de glaasjes in 10% gebufferde formaline gedurende 10 min (Dish 1).
  4. Verwijder de glaasjes van formaline en spoel in een oplossing van TPBS (gerecht 2).
  5. Dompel de dia's in 3% waterstofperoxide gedurende 10 min (Dish 3).
  6. Verwijder de glaasjes uit de waterstofperoxide en DIP-rinse in verse TPBS (gerecht 4). Na het verwijderen van overtollige waterstofperoxide, plaats de dia's in verse TPBS (schotel 5) en werk met één dia tegelijk, terwijl de andere dia's blijven ondergedompeld in TPBS.
  7. Neem de dia's van TPBS (Dish 5) een voor een, schud af en DEP overtollige buffer, en plaats op een bevochtigde papieren handdoek op Lab Bench, als basis van een ' vochtigheids kamer '. Gebruik een pipet en laat voldoende primair anti-rabiësvirus antilichaam op elke dia vallen om het CZS-weefsel te bedekken. Inbroed de glaasjes gedurende 10 minuten in de vochtigheids kamer (d.w.z. dia's met goed platen of andere eenvoudige afdekking bedekken terwijl ze op de vochtige papieren handdoek leggen) bij kamertemperatuur (Figuur 2).
  8. Verwijder de glaasjes uit de vochtigheids kamer, schud en DEP de overtollige conjugaat af en spoel de glaasjes in TPBS (hergebruik dezelfde TPBS in Dish 5).
  9. Werken met één dia tegelijk, terwijl anderen ondergedompeld blijven in TPBS — gebruik een pipet om voldoende streptavidin-peroxidase complex te laten vallen om het CZS-weefsel te bedekken. Inincuberen in de vochtigheids kamer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  10. Verwijder de glaasjes uit de vochtigheids kamer, schud en DEP het overtollige complex af en spoel de glaasjes in TPBS (schotel 5).
  11. Werken met één dia tegelijk, schud af en DEP overtollige buffer, terwijl anderen ondergedompeld blijven in TPBS-gebruik een pipet om voldoende AEC te laten vallen (voorbereiding wordt hierboven uitgelegd en moet onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik worden gedaan) om het CZS-weefsel te bedekken. Inincuberen in de vochtigheids kamer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  12. DIP-spoel de glaasjes in gedestilleerd water (schotel 6).
  13. Plaats de glaasjes in Contra vlekken van de kieuwen HEMA Oxylin (verdund 1:1 met gedestilleerd water) gedurende 2 minuten (gerecht 7).
  14. Onmiddellijk spoelen-spoel alle glaasjes in gedestilleerd water (schotel 8). Herhaal tweemaal met vers water elke keer (gerechten 9 en 10).
  15. Werken met één dia tegelijk, terwijl anderen ondergedompeld blijven in gedistilleerd water (schotel 10) — schud en DEP overtollig water af en gebruik een in water oplosbaar bevestigings medium om een afdekplaat aan te brengen.
  16. Gebruik een lichte Microscoop met een 20x-doelstelling om de dia's en een 40x-doelstelling te bekijken als een nadere inspectie nodig is.

Resultaten

Positieve resultaten van de DRIT tonen rode intracytoplasmorische virale insluitsels die kunnen variëren in vorm en grootte (Figuur 3) binnen het cytoplasma van blauwachtige cellichamen. De insluitsels lijken glad met zeer heldere marges en een minder intensief bevlekt centraal gebied. De intensiteit en antigeen verdeling worden geregistreerd wanneer insluitsels worden gedetecteerd. Intensiteit wordt beoordeeld van + 4 tot + 1. De positieve controle Slide moet een intense, flauw magenta schittering hebben die wordt aangeduid als een + 4 intensiteit. Een licht verlies van kleur kan vooral optreden wanneer de behandeling van het monster niet optimaal is (d.w.z. dat het monster weefsel lichtjes is afgebroken) en deze moeten worden beoordeeld als + 3. Merkbaar saaie vlek wordt beoordeeld als een + 2 tot + 1, wordt niet beschouwd als diagnostische voor rabiësvirus infectie en is gelabeld als onbepaalde.

Bovendien wordt antigeen-verdeling beoordeeld van + 4 tot + 1 met + 4 die antigen-distributie vertegenwoordigt die bestaat uit een overvloed aan grote en kleine insluitsels variërend in grootte en vorm, en aanwezig in elk veld (of bijna elk veld) in het CZS-weefsel Aanraak vertoning. De positieve controle heeft meestal een + 4 antigen-verdeling. Een antigeen-verdeling van + 3 zou worden toegewezen wanneer er in een verscheidenheid van formaten in de meeste, maar niet alle weergave gebieden inclusies zijn. Indien insluitsels worden aangetroffen in 10%-50% van de Microscoop velden, wordt een a + 2 antigeen distributie toegewezen. Wanneer insluitsels worden aangetroffen in < 10% van de Microscoop velden, wordt een + 1-antigeen verdeling toegewezen.

Meeste CNS weefsel met rabiësvirus vertonen typische virale insluitsels ingedeeld als + 3 of + 4 intensiteit en antigeen distributie. Als de resultaten duiden op een + 2 of + 1 intensiteit of een + 2 of + 1 antigeen distributie, wordt het monster een "onbepaalde" verklaard en wordt het herhaald testen gerechtvaardigd. Als hetzelfde monster een herhaalde onbepaalde testuitslag heeft, moet het monster worden verzonden naar een referentielaboratorium voor DFA of verwante bevestigende testen.

Een testmonster met behulp van de DRIT wordt beschouwd als negatief voor rabiësvirus antigenen nadat de dia met het CZS-weefsel is gescand bij een vergroting van 200X of hoger en er geen typische virus insluitsels worden gedetecteerd (Figuur 4). Negatieve monsters vertonen blauwachtige cellichamen met weinig of geen niet-specifieke kleuring.

figure-results-1
Figuur 1: installatie van 10 dia-kleurings gerechten met reagentia voor testen. De gerechten zijn gelabeld met reagensnaam in de volgorde die nodig is om het protocol te volgen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: eenvoudige vochtigheids kamer gemaakt met een natte papieren handdoek en celcultuurplaten.  Een eenvoudige vochtigheids kamer met een natte papieren handdoek en celcultuurplaten maakt toepassing op veld basis mogelijk.  Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: representatieve glijbanen van rabiës positieve virale insluitsels met + 4 intensiteit en + 4 antigeen verdeling. (A en B) tonen positieve rabiës virale insluitsels bij een vergroting van 200x. (C en D) tonen positieve rabiës virale insluitsels bij een vergroting van 400x. Schaal staven = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: representatieve dia's van negatieve monsters zonder virale rabiës-insluitsels. (A en B) Toon monsters negatief voor rabiës virale insluitsels bij een vergroting van 200x. (C en D) Toon monsters negatief voor rabiës virale insluitsels bij 400x vergroting. Schaal staven = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: representatieve foto's van de proefinstallaties die door USDA WS worden gebruikt. A) mobiele testfaciliteit in een afgesloten aanhangwagen voor vervoer. B) recreatief voertuig dat is uitgerust voor proef proeven. C) DRIT testfaciliteit in combinatie met universitair laboratorium. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

De DRIT is een flexibele methode die geschikt is voor veld-based Surveillance voor het opsporen van de aanwezigheid van rabiësvirus dat kan worden gebruikt in gedecentraliseerde laboratorium gebieden. Hoewel het mogelijk is om de hele test uit te voeren in een veld-gebaseerde setting zoals op de achterklep van een truck, is het ideaal om een kleine binnenruimte te hebben die is gewijd aan DRIT vanwege chemische, apparatuur en Supply-opslagproblemen. Daarnaast moet rekening worden gehouden met de naleving van alle toepasselijke federale, staats-en lokale wetten en voorschriften voor chemisch gebruik en verwijdering. Op dit moment heeft USDA WS 15 DRIT faciliteiten om samples uit 17 Staten te testen. De USDA WS DRIT-faciliteiten worden opgericht in samenwerking met de Universiteit en de staat volksgezondheids laboratoria, in aangewezen kamers binnen grotere faciliteiten en in gesloten aanhangwagens die zijn omgebouwd en geconverteerd om als mobiele testunits te dienen in de geval van een nood uitbraak reactie waarbij verscherpte rabiës surveillance tests met onmiddellijke doorlooptijd kritisch zijn (Figuur 5).

Hoewel de test succesvol is geweest met behulp van hersenstam materiaal van variabele kwaliteit, is vers hersenstam weefsel zonder weefsel ontleding optimaal. Als ontleding, uitdroging of vloeibaarmaking optreedt, neemt de monster kwaliteit af en kan de test meer niet-specifieke vlekken detecteren die de resultaten kunnen verwarren. Deze waarneming is vergelijkbaar tussen DFA en DRIT2. Hersenstam/CNS moet zo snel mogelijk worden verzameld en vervolgens bevroren (-20 °C) worden bewaard tot het testen.

Meestal verwerken de meeste USDA WS-faciliteiten in één keer van 12 tot 24 dia's tijdens een DRIT sessie, inclusief één positieve controle en één negatieve controle die is bevestigd via DFA. Positieve en negatieve controles bieden een referentiepunt voor elke DRIT run om ervoor te zorgen dat de test geslaagd is en om te bevestigen of interpretatieve vragen op de test dia's ontstaan. Als een monster niet is vastbesloten om een duidelijk positief of negatief resultaat te hebben, wordt het aangeduid als een onbepaalde en een tweede keer getest door DRIT. Als dit monster niet duidelijk positief of negatief is na twee DRIT tests, wordt het naar een referentielaboratorium voor DFA of verwant testen gestuurd.

Zoals bij elke diagnostische test is ' Trouble Shooting ' handig bij onverwachte bevindingen. Als een DRIT-run bijvoorbeeld niet lukt (d.w.z. de positieve controle vertoont geen + 3 of + 4 kleurings intensiteit en antigeen-verdeling), zorg er dan voor dat alle chemicaliën en reagentia niet zijn verlopen. We hebben gevonden met behulp van een nieuw geopende fles waterstofperoxide ten minste eenmaal per week is nuttig om te helpen voorkomen dat niet-specifieke kleuring door oxidatie van het hersenweefsel. Bovendien wordt u aangeraden acetaat-buffer ten minste eenmaal per jaar minimaal te vervangen, ongeacht de gelabelde vervaldatum.

Er zijn een aantal voordelen van de DRIT over DFA inclusief lagere kosten, de mogelijkheid om de test uit te voeren buiten een gecentraliseerd laboratorium, alleen Lichtmicroscopie nodig in plaats van een fluorescerende Microscoop, en het relatief eenvoudige trainingsproces voor mensen die de test2,3,4beheren en lezen. Deze voordelen, in combinatie met de gevoeligheid en specificiteit van de DRIT die vergelijkbaar zijn met DFA2,7,8,9 , hebben al bewezen dat de test als een belangrijk instrument op grote schaal dient versterkte rabiës surveillance Programma's8,10 in Noord-Amerika. Daarnaast heeft de DRIT potentieel om meer surveillance en meer snelle tests mogelijk te maken in ontwikkelingslanden of andere gebieden met beperkte middelen, vooral na recente OIE/WHO-richtlijnen als een aanbevolen test.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij erkennen alle USDA Wildlife diensten personeel die momenteel of hebben eerder verzameld verbeterde rabiës surveillance monsters en hebben de DRIT voor rabiës diagnose uitgevoerd. Evenzo erkennen we de vele coopera toren die ons helpen met de uitgebreide surveillance collectie van rabies. We danken ook de centra voor ziektebestrijding en preventie en het Wistar Institute voor toegang tot kritische reagentia die nodig zijn om de DRIT te voeren en om opleidingsmogelijkheden te bieden. Daarnaast waarderen we de bevestigende diagnostiek en technische bijstand van de centra voor ziektebestrijding en preventie en door het Wadsworth Center met het New Yorkse State Department of Health. Het gebruik van commerciële producten is uitsluitend voor vergelijkingsdoeleinden en vormt geen goedkeuring.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC-tabletten; 50 stuks)Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)A6926
Acetaatbuffer, 0,1M, 5,2 pH, 32 ozPoly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/)s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Niet-steriele #10, 40 per verpakkingPatterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)PN110Aanvullend materiaal voor monster-touch impressies; Ook verkrijgbaar via Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Wegwerpspuit zonder naald, 10 ccFisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-823-2ABD Fabrikantnummer 309604
Binoculair Lichtmicroscoop met Seidentopf-kop of equivalentMeerdere leveranciers
Blauwe rechthoekige niet-geclassificeerde afvoercontainer, 5GBerlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01BLUAanvullend materiaal voor opslag/verwijdering van chemisch afval (Gill hematoxylinen en AEC-oplossing)
Corning vierkante en rechthoekige dekglasjes, 24x60Fisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)12-553-465Corning Fabrikantnummer 2975246
Corning Universal Fit Pipettips: Opgestapeld, Niet-steriele (1-200ul)Fisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)07-200-300Corning Fabrikantnummer 4863
Falcon 15 mL Conische Centrifugeerbuizen, polypropyleenFisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-959-70CCorning Fabrikantnummer 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Weefselkweekplaatdeksels)Fisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)08-772-5Corning Fabrikantnummer 353910
Fisher Brand 25mm Spuitfilter, Nylon, 0,45 μm, SterieleFisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)09-719D
Fisher Chemical Gill Methode Hematoxylinen Stain (Gill-2), 4LFisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qtFisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-827-122Aanvullend materiaal voor goede BSL-2 Laboratorium Instelling
Fluoro-Gel met Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mLVWR, onderdeel van Avantor (https://vwr.com)102092-122Fluoro-Gel Vervanger voor BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formaline, Gebufferd, 10%, 4LFisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SF100-4Beschikbaar per stuk of in een doos van 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μLDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF9930E
Hy-Clone Fosfaat Gebufferde Saline, 1x Oplossing, 1 L (PBS)Fisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SH30256LSAlternatieve droogpoeder product kan worden gebruikt
Waterstofperoxide, 3%Meerdere LeveranciersElke commercieel verkrijgbare bron, zoals apotheek of winkelmerken, etc.
Lens Microscoop Objectief 20x en 40xMeerdere Leveranciers
Lysol IC Kwartaire Desinfecterende Reiniger, 1GDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF8481Aanvullend materiaal voor goede BSL-2 Laboratorium desinfectie
Miltex merk Wegwerp Scalpel Maat 22 (alternatieve maat voor MiniScalpel)AMD Next (www.amdnext.com)999112314Aanvullend materiaal voor monster-touch impressies; Alternatieve maat voor Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Barnsteen Glas Verpakking, 500 mLFisher Scientific (onderdeel van Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)D119-500
Peroxidase Gelabelde Streptavidine, 50 mLSeraCare (https://www.seracare.com/)5550-0001KPL Immunoassay en Kits Referentienummer 71-00-38
Fosfaat Gebufferde Saline Poeder (alternatief voor Fisher vloeibaar PBS)Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)P3813Moet worden bereid in 1 L gedistilleerd water; Beschikbaar in hoeveelheden van 1, 10 en 50 verpakkingen
Primaire antilichaam: Polyklonaal anti-nucleoproteïne of cocktail van anti-lyssavirus gebiotinyleerde antilichamenBewaar bij 4 °C
PYREX Wegwerp Serologische Pipetten, Glas, Steriele, Pluggen, Corning, 1,0 mLVWR, onderdeel van Avantor (https://vwr.com)7078D-1VWR Fabrikantnummer 89091-220
PYREX Wegwerp Serologische Pipetten, Glas, Steriele, Pluggen, Corning, 10,0 mLVWR, onderdeel van Avantor (https://vwr.com)7078D-10VWR Fabrikantnummer 89091-106
PYREX Wegwerp Serologische Pipetten, Glas, Steriele, Pluggen, Corning, 5,0 mLVWR, onderdeel van Avantor (https://vwr.com)7078D-5VWR Fabrikantnummer 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylinen Stain No. 2, 1PT (alternatief voor bovenstaande)Fisher Scientific (onderdeel

Referenties

  1. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).
  2. Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206(2008).
  3. Rupprecht, C., et al. Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
  4. Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
  5. Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
  6. Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , Centers for Disease Control and Prevention. (2016).
  7. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  8. Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21(2017).
  9. Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189(2014).
  10. Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34(2017).
  11. Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549(2009).
  12. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols. , Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019).
  13. Khalid, A., Haque, A. Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lichtmicroscopieafdruk van hersenweefselstreptavidine peroxidasecomplexAEC werkoplossingGill s hematoxyline tegenkleuringrabi svirus antilichaam10 gebufferde formalineTPBS oplossing

Gerelateerde artikelen