De gepresenteerde diagnostische FL-DNA kit is een tijdbesparende en gebruiksvriendelijke methode om de betrouwbare waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van colorectale kankerlaesies te bepalen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Tegenwoordig kan ontlasting DNA worden geïsoleerd en geanalyseerd door verschillende methoden. De lange fragmenten van DNA in ontlasting kunnen worden gedetecteerd door een qPCR-test, die een betrouwbare waarschijnlijkheid biedt van de aanwezigheid van pre-neoplastische of neoplastische colorectale laesies. Deze methode, genaamd fluorescentie lang DNA (FL-DNA), is een snelle, niet-invasieve procedure die een verbetering is ten opzichte van het primaire preventiesysteem. Deze methode is gebaseerd op de evaluatie van fecale DNA-integriteit door kwantitatieve versterking van specifieke doelen van genomisch DNA. Met name de evaluatie van DNA-fragmenten langer dan 200 bp maakt detectie van patiënten met colorectale laesies met een zeer hoge specificiteit mogelijk. Dit systeem en alle momenteel beschikbare dna-tests met ontlasting geven echter een aantal algemene problemen die moeten worden aangepakt (bijvoorbeeld de frequentie waarop tests moeten worden uitgevoerd en een optimaal aantal ontlastingsmonsters die op elk tijdstip voor elk individu worden verzameld). Het belangrijkste voordeel van FL-DNA is echter de mogelijkheid om het te gebruiken in combinatie met een test die momenteel wordt gebruikt in het CRC-screeningprogramma, bekend als de immunochemische fecale occulte bloedtest (iFOBT). Beide tests kunnen namelijk op hetzelfde monster worden uitgevoerd, waardoor de kosten worden verlaagd en een betere voorspelling wordt gedaan van de uiteindelijke aanwezigheid van colorectale laesies.
Inleiding
Colorectale kanker (CRC) is afgeleid van een multi-step proces waarbij gezond epitheel zich langzaam ontwikkelt tot adenomen of poliepen, die in de loop van de tijd uitgroeien tot kwaadaardige carcinomen1,2. Ondanks het hoge incidentiepercentage van CRC is er de afgelopentienjaar een neerwaartse trend in het percentage sterfgevallen waargenomen . Inderdaad, vroege diagnostische instrumenten die in screeningsprogramma's zijn aangenomen, hebben geleid tot vroegtijdige opsporing en verwijdering van pre-neoplastische adenomen of poliepen4. Echter, vanwege de verschil....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Tussen 2013 en 2015 werden patiënten aangeworven bij de Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) van Meldola (FC, Italië). Ingeschreven patiënten waren opgenomen in protocol IRSTB002, goedgekeurd door de Ethische Commissie van IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten.
1. DNA-extractie uit ontlasting
- Gebruik een kit om ontlastingsmonsters voor te bereiden (zie Tabel met materialen)). Selecteer en behand....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De werkstroom van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1. De werkstroom biedt twee controlestappen en verschillende acties op basis van deze stapresultaten. Ten eerste, als een monster ongeschikte besturingselementen bevat, moet de versterking worden herhaald. Ten tweede, als de versterking wordt geremd, moet het monster vanaf het begin worden herverwerkt of als niet waardevol worden geclassificeerd.
Figuur 2 toont de fluorescentiecurven die worden geprodu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eerdere studies hebben aangetoond dat DNA-integriteitsanalyse van ontlasting die wordt geëxtraheerd door handmatige en semi-automatische benaderingen een alternatief instrument kan zijn voor de vroegtijdige detectie van colorectale laesies7,8,9,10,11,12. Moleculaire, niet-invasieve screening tests zijn ontwikkeld door de jare.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Maura Menghi is fulltime medewerker van Diatech Pharmacogenetics srl.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen erkenningen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL en 2 mL polypropyleen twist-lock buisjes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR remmer-vrij) | Benodigdheden voor DNA-extractie en Real Time PCR | ||
| Absoluut Ethanol (kwaliteit van analytische graad) | Reagens vereist voor DNA-extractie | ||
| Centrifuge voor op tafel | Maximale snelheid van 20000 x g. Instrument vereist voor DNA-extractie | ||
| EasyPGX analysesoftware versie 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysesoftware |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument aanbevolen voor de Real Time PCR-test |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument aanbevolen voor de Real Time PCR-test |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit vereist voor de Real Time PCR-test |
| Micropipetten (volumes van 1 tot 1.000 µL) | Benodigdheden voor DNA-extractie en Real Time PCR | ||
| Poedervrije wegwerphandschoenen | Benodigdheden voor DNA-extractie en Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit aanbevolen voor de DNA-extractie en zuivering uit ontlasting |
| Steriele filtertips DNase-, RNase-vrij (volumes van 1 tot 1.000 µL) | Benodigdheden voor DNA-extractie en Real Time PCR | ||
| Thermische blok bijv. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument vereist voor DNA-extractie |
| Vortex bijv. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument vereist voor DNA-extractie |
Referenties
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.
The first affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy
