Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

Summary

Een pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie is ontwikkeld om specifiek te detecteren alle bekende lyssaviruses. Validatie met behulp van rabiës hersenen monsters van verschillende diersoorten bleek dat deze methode een gevoeligheid en specificiteit gelijkwaardig is aan de gouden standaard fluorescerende antilichaam test en kan worden gebruikt voor routine hondsdolheid diagnose heeft.

Abstract

Voor het opsporen van rabiësvirus en andere lid soorten van het geslacht Lyssavirus binnen de familie Rhabdoviridae, de pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reaction (geneste RT-PCR) werd ontwikkeld om de geconserveerde regio te detecteren van het nucleoproteïne (N) gen van lyssaviruses. De methode past omgekeerde transcriptie (RT) toe gebruikend Viral RNA als malplaatje en oligo (dT)₁₅ en willekeurige hexamers als inleidingen om het virale bijkomende DNA (cDNA) te synthetiseren. Dan, wordt virale cDNA gebruikt als malplaatje om een fragment van het gen van 845 BP N in eerste ronde PCR te versterken gebruikend buiten inleidingen, die door tweede-ronde geneste PCR worden gevolgd om def. 371 te versterken BP fragment gebruikend binnenprimers. Deze methode kan detecteren verschillende genetische bekleed van rabiës virussen (RABV). De validatie, met behulp van 9.624 hersen specimens uit acht huisdier soorten in 10 jaar van klinische rabiës diagnoses en surveillance in China, bleek dat de methode 100% gevoeligheid en 99,97% specificiteit in vergelijking met de directe fluorescerende de test van het antilichaam (vet), de gouden standaardmethode die door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) en de Wereldorganisatie voor dierlijke gezondheid (OIE) wordt geadviseerd. Bovendien kan de methode ook specifiek versterken de beoogde N-gen fragment van 15 andere goedgekeurde en twee nieuwe Lyssavirus soorten in het 10e verslag van het Internationaal Comite voor de taxonomie van virussen (ICTV), zoals geëvalueerd door een na te bootsen detectie van gesynthetiseerde N de plasmiden van het gen van al lyssaviruses. De methode biedt een handig alternatief voor vet voor rabiës diagnose en is goedgekeurd als een nationale norm (GB/T36789-2018) van China.

Introduction

Rabiës is een wereldwijde zoönose die wordt veroorzaakt door virussen binnen het geslacht Lyssavirus¹. Lyssaviruses (familie Rhabdoviridae) zijn enig-negatief-gestrande virussen van RNA met een ongeveer 12 KB genoom dat vijf proteïnen codeert: N, Phosphoprotein (P), matrijsproteïne (M), glycoproteïne (G), en het grote proteïne of de polymerase (L). Op basis van nucleotide sequenties van het N gen, genetische afstand, en antigene patronen, de lyssaviruses zijn onderverdeeld in 16 soorten, bestaande uit klassieke rabiësvirus (RABV) en de rabiës-gerelateerde virussen (RRV): Lagos bat virus (LBV), Duvenhage virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), Europese knuppel Lyssavirus 1 (EBLV-1), Europese knuppel Lyssavirus 2 (EBLV-2), Australische knuppel Lyssavirus (ABLV), Aravan virus (Frédéric), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh knuppel Lyssavirus (BBLV), Gannoruwa knuppel Lyssavirus (GBLV), Irkoet virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), het westen Kaukasische knuppel virus (WCBV), Shimoni het virus van de knuppel (SHIBV), en de knuppel Lyssavirus van Lleida (LLEBV)². Onlangs zijn twee extra lyssaviruses geïdentificeerd: Kotalahti bat Lyssavirus (KBLV) geïsoleerd van een brandt ' bat (Myotis brandtii) in Finland in 2017³ en Taiwan bat Lyssavirus (TWBLV) geïsoleerd van een Japanse vleermuis ( Pipistrellus abramus) in Taiwan, China in 2016 – 2017⁴.

Alle zoogdieren zijn vatbaar voor rabiës; echter, geen grove Pathognomonisch laesies of specifieke klinische symptomen mogelijk zijn identificatie, en de diagnose kan alleen worden gemaakt in het laboratorium⁵. De meest gebruikte methode voor hondsdolheid diagnose is het vet, dat wordt beschouwd als de gouden standaard door zowel de WHO en de OIE^5,6. Niettemin, het vet kan produceren onbetrouwbare resultaten op gedegradeerde/autolyzed hersenweefsel monsters. Bovendien, het kan niet worden gebruikt om biologische vloeistoffen monsters zoals hersenvocht (CB), speeksel, en urine Assay, waardoor grotendeels uitschakeling zijn werkgelegenheid in antemortem diagnose⁷. Alternatieve conventionele diagnostische tests, zoals de hondsdolheid weefselkweek infectie test (RTCIT) en de muis inenting test (MIT), vereisen enkele dagen⁶, een groot nadeel wanneer een snelle diagnose van essentieel belang is.

Diverse moleculaire kenmerkende tests (b.v., de opsporing van viraal RNA door RT-PCR, PCR-enzym-verbonden immunosorbent assay [PCR-ELISA], in situ kruising, en PCR in real time) worden gebruikt als snelle en gevoelige technieken voor hondsdolheid diagnose⁸. RT-PCR wordt nu geadviseerd door OIE voor routine hondsdolheid diagnose, en een heminested (hn) PCR wordt beschreven in het OIE handboek van kenmerkende tests en vaccins voor aardse dieren om al lyssaviruses⁵te ontdekken. Hier beschrijven we een pan-Lyssavirus geneste RT-PCR, die het mogelijk maakt de specifieke en gevoelige detectie van alle 18 Lyssavirus soorten vergelijkbaar met of hoger dan die verkregen door het vet. Het principe van de methode is een RT van het doel RNA (geconserveerd gebied van het Lyssavirus N gen) in cDNA, gevolgd door de versterking van de cDNA door twee rondes van PCR. De cDNA ondergaat de eerste ronde PCR met buitenste primers om een 845 BP fragment te versterken; dan, gebruikt tweede-ronde PCR het eerste-ronde PCR product als malplaatje om een 371 BP fragment met binneninleidingen te versterken. De twee rondes van PCR verhogen beduidend de gevoeligheid van de analyse.

Protocol

Het gebruik van muizen in dit protocol werd goedgekeurd door het administratief Comite voor het welzijn van dieren van het Instituut voor militaire veterinaire geneeskunde, de Academie voor militaire medische wetenschappen, China (laboratorium Dierzorg en het gebruik Comite vergunning, vergunning aantal JSY-DW-2010-02). Alle institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd.

1. de extractie van RNA

1. Extract RNA van rabiës-vermoedelijk hersenweefsel, huid biopten, speeksel, of CSF of uit RABV-geïnfecteerde cel cultuur, met behulp van guanidinium isothiocyanaat-fenol-chloroform-gebaseerde extractie methoden of commercieel beschikbare virale RNA extractie Kits. Gebruik onmiddellijk het voor bereide RNA of bewaar het bij-80 °C tot vereist.

2. omgekeerde transcriptie van de virale RNA

1. Verwijder de RT reagentia vermeld in tabel 1 uit de vriezer, bewaar ze op het ijs, en ontdooien en Vortex ze voor gebruik.
2. Bereid 12 µ L van RT reactie mix in een 0,2 mL PCR buis met de reagentia vermeld in tabel 1. Laat toe om variaties te pipetteren door een volume van Master mix voor te bereiden ten minste één reactie grootte groter dan nodig is.
3. Voeg 8 µ L steekproef, positieve controle RNA of negatieve controle aan de RT reactie mengeling binnen een PCR werkstation in een malplaatjeruimte toe. De RT positieve controle is RNA geëxtraheerd uit de cel cultuur geïnfecteerd met vaste RABV stam CVS-11 (Challenge virus Standard-11) en opgeslagen op-80 ° c. De negatieve controle bevat ASE-vrije ddH₂O.
4. Meng de inhoud van de RT tubes door vortexen; dan, centrifugeer kort.
5. Laad de reactie buizen in een thermische fietser. Stel het cDNA synthese programma in met de volgende voorwaarden: 42 °C voor 90 min, 95 °C voor 5 min, en 4 °C in de wacht. Stel het reactievolume in op 20 µ L. Start de RT run.

3. eerste ronde PCR

1. Houd de PCR Reagentia vermeld in tabel 2 op ijs in een schone ruimte tot het gebruik; dan, ontdooien en Vortex ze.
2. Bereid de eerste ronde PCR-mix in een 0,2 mL PCR-buis samen met de in tabel 2vermelde reagentia.
3. Voeg een 2 µ L steekproef van cDNA of plasmide in de eerste ronde PCR mengeling binnen een PCR werkstation in een malplaatjeruimte toe. De PCR positieve controle is CVS-11 cDNA voorbereid zoals vermeld in stap 2,3 voor de bovengenoemde RT methode. De PCR negatieve controle is ddH₂O.
4. Breng de verzegelde buizen over naar een PCR-thermische fietser en voer de in tabel 3vermelde parameters uit.

4. tweede-ronde PCR

1. Bereid de tweede ronde PCR-mix in een 0,2 mL PCR-buis met gebruikmaking van de in tabel 4vermelde reagentia.
2. Voeg toe 2 µ L van eerste-ronde PCR product in de tweede-ronde PCR mengeling. Bovendien omvatten ddH₂O als negatieve controle van tweede-ronde PCR.
3. Voer PCR het thermische cirkelen uit gebruikend de zelfde parameters zoals die in stap 3,4 worden gegeven.

5. analyse van de PCR producten door elektroforese op agarose gels

1. Bereid een 1,5% agarose gel voor door 1,5 g van agarose aan 100 mL van tris-acetaat-EDTA (TAE) toe te voegen en het grondig op te lossen door het in een microgolfoven te verwarmen.
2. Voeg ethidium bromide (EB) toe (bij een eindconcentratie van 0,01%) of een andere commerciële EB substitutie. Giet de gel in de mal en laat het te stollen bij omgevingstemperatuur gedurende ten minste 30 min.
3. Bereid de ladings steekproeven voor door 5 µ L van elk PCR product met 1 µ L van 6x ladings buffer te mengen.
4. Laad de monsters en de geschikte DNA-marker afzonderlijk in de putten en voer de gel voor ongeveer 30-45 min op 120 V tot de kleurstof lijn is ongeveer 75%-80% vaststelling van de gel.
5. Zet de stroom uit, koppel de elektroden uit de stroombron, en vervolgens zorgvuldig verwijderen van de gel uit de gel box.
6. Gebruik een UV-Gel documenteren apparaat te visualiseren en te fotograferen de DNA-fragmenten.

6. karakterisering van genestelde RT-PCR

1. 6,1. specificiteit en gevoeligheid voor de detectie van 18 lyssaviruses plasmiden
   1. Bestel 18 commerciële plasmiden die het volledige N gen van elke Lyssavirus (16 ICTV soorten en twee nieuwe soorten) voor PCR bevatten.
   2. Bereken het exemplaaraantal van de plasmide gebruikend het aantal van Avogadro (N_a) en de volgende formule.
      [(g/µ L plasmide DNA)/(plasmide lengte in BP x 660)] x 6,022 x 10²³ = aantal moleculen/µ l
   3. Bereid voorraad oplossingen (2,24 x 10⁹ moleculen/µ l) van alle 18 plasmiden in ddH₂O.
   4. Voer 9 10-voudige seriële verdunningen van alle 18 plasmiden in ddH₂o. Verdun 10 µ l van elke plasmide voorraad met 90 µ l van ddH₂o. Vortex en centrifugeer kort.
   5. Voer PCR versterking uit zoals beschreven in de punten 3-5.
   6. Analyseer de specificiteit en de gevoeligheid van geneste PCR door een reeks van Lyssavirus plasmiden te ontdekken.
2. Bepaling van d etection Laeremans IMIT
   1. Pas de titer van de hondsdolheid virusstam CVS-11 Cell Culture tot 10^5,5 TCID₅₀/ml (virus TITER bepaald volgens de OIE handleiding)⁵.
   2. Voer 5 10-voudige seriële verdunningen van CVS-11 (stockoplossing is 10^5,5 TCID₅₀/ml) zoals beschreven in stap 6.1.4.
   3. Voer de extractie van RNA en genestelde RT-PCR versterkings procedures van alle virale verdunningen uit zoals beschreven in secties 1-5.
3. Compar koor van het genesteld RT-PCR met de "Gold Standard" Fat
   1. Test alle klinische monsters door geneste RT-PCR, en bevestig vervolgens de resultaten met de FAT⁵ en N Gene sequencing⁹.
   2. Gebruik genormaliseerde gegevens voor een statistische analyse met SAS 9,1. Gebruik de Kappa test en McNemar Chi-kwadraat test voor een statistische vergelijking van de diagnostische tests (SAS commando: proc freq; tabel/agree). Bereken betrouwbaarheidsintervallen uitgaande van abinomial distributie.
4. Evaluatie van de werkzaamheid bij het testen van gedegradeerde monsters
   1. Expose twee bevestigde klinische hersenweefsel monsters van hondsdolle honden op 37 ° c.
   2. Test de twee steekproeven op elke dag van blootstelling bij 37 °C door genestelde RT-PCR, het vet, en MIT⁵.

Results

De resultaten van genestelde RT-PCR om 18 Lyssavirus soorten te ontdekken worden getoond in Figuur 1. Alle PCR positieve controles toonden verwachte 845 BP in eerste-en 371 BP in de tweede-ronde versterking met geen band in de negatieve controle. Alle 18 lyssaviruses produceerde de verwachte 845 en/of 371 BP bands, wat aangeeft dat de geneste RT-PCR alle 18 lyssaviruses gedetecteerd. Zestien lyssaviruses plasmiden hadden efficiënte versterking in twee rondes van PCR, maar twee, namelijk Fréd...

Discussion

Momenteel, is RABV een belangrijke Lyssavirus verantwoordelijk voor bijna al menselijke en dierlijke hondsdolheid in China, evenals in andere landen. Bovendien werd een IRKV variant eerst geïdentificeerde van a Murina leucogaster knuppel in de provincie Jilin in noordoostelijk China in 2012¹⁰, en het is gemeld om de dood van een hond in de provincie Liaoning in 2017¹¹te veroorzaken. Onlangs, werd een roman Lyssavirus, TWBLV, ook geïdentificeerde van een Ja...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 × TAE	Various	Various
6 × laadbuffer	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Various	Various
DL 2,000 Marker	Takara	3427A
dNTP's (10 mM)	TakaRa	4019
dNTP's (2.5 mM)	TakaRa	4030
Elekforesesysteem	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
Gelbeeldsysteem	UVITEC	Fire Reader
Microcentrifugebuizen	Various	Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/μL)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 Spectrofotometer	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR Machine	BIO-RAD	T100
PCR buizen	Various	Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipetten	Various	Various
Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/μL)	TakaRa	2313A
RNase-vrije ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10×)	TakaRa	9152A
Tips	Various	Various
Vortexmixer	Various	Various