Methodenartikel

CRISPR/Cas9 technologie in het herstellen van Dystrofine expressie in door iPSC afgeleide spier voorlopercellen

7.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59432

⸱

14 september 2019

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een Cas9-gebaseerd exon23 deletie protocol om Dystrofine expressie in iPSC te herstellen van DMDMDX Mouse-afgeleide huid fibroblasten en direct ipscs te onderscheiden in myogene voorlopercellen (MPC) met behulp van het Tet-on myod activeringssysteem.

Samenvatting

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige progressieve spierziekte veroorzaakt door mutaties in het Dystrofine gen, wat uiteindelijk leidt tot uitputting van spier voorlopercellen. Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR-geassocieerde 9 (CRISPR/Cas9) genbewerking heeft het potentieel om de uitdrukking van het Dystrofine-gen te herstellen. Autologe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)-afgeleide spier voorlopercellen (MPC) kunnen de stam-/voorloper celpool aanvullen, schade herstellen en verdere complicaties in DMD voorkomen zonder een immuunrespons te veroorzaken. In deze studie introduceren we een combinatie van CRISPR/Cas9 en niet-geïntegreerde iPSC-technologieën om spier voorlopercellen te verkrijgen met teruggewonnen Dystrofine-eiwit expressie. Kort samengevat gebruiken we een niet-integrerende Sendai-vector om een iPSC-lijn op te zetten van dermale fibroblasten van DMDMDX -muizen. Vervolgens gebruiken we de crispr/Cas9 verwijderings strategie om Dystrofine expressie te herstellen door een niet-homologe eind verbinding van het de Dystrofine gen. Na PCR-validering van exon23 depletie in drie kolonies uit 94 geplukt iPSC-kolonies, onderscheiden we iPSC in MPC door doxycycline (Dox)-geïnduceerde expressie van MyoD, een belangrijke transcriptiefactor die een belangrijke rol speelt bij het reguleren van spier differentiatie. Onze resultaten tonen de haalbaarheid van het gebruik van CRISPR/Cas9 verwijderings strategie om Dystrofine-expressie te herstellen in de met iPSC afgeleide MPC, die een significant potentieel heeft voor het ontwikkelen van toekomstige therapieën voor de behandeling van DMD.

Inleiding

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een van de meest voorkomende spier dystrofieën en wordt gekenmerkt door de afwezigheid van Dystrofine, die 1 van ongeveer 5.000 pasgeboren jongens wereldwijd1. Verlies van Dystrofine-genen functie resulteert in structurele spier defecten die leiden tot progressieve myovezels degeneratie1,2. Recombinant Adeno-associated virus (rAAV)-gemedieerd gentherapie systeem is getest om de Dystrofine expressie te herstellen en de spierfunctie te verbeteren, zoals het vervangen van genen met behulp van micro-dystrofines (μ-dys). De raav-benadering vereist echter herhaalde injecties om de expressie van het functionele eiwit3,4te ondersteunen. Daarom hebben we een strategie nodig die een effectief en permanent herstel van Dystrofine genexpressie kan bieden bij patiënten met DMD. De DMDMDX Mouse, een muismodel voor DMD, heeft een puntmutatie in Exon 23 van het Dystrofine gen dat een vroegtijdige beëindiging codon introduceert en resulteert in een niet-functioneel afgeknotte proteïne zonder het C-terminale dystroglycan bindings domein. Recente studies toonden het gebruik van crispr/Cas9 technologie aan om Dystrofine genexpressie te herstellen door nauwkeurige gencorrectie of Mutant Exon deletie in kleine en grote dieren5,6,7. Long et al.8 meldde de methode voor het corrigeren van de Dystrofine-genmutatie in DMDMDX -muis kiembaan door homologie-gestuurde reparatie (HDR) op basis van crispr/Cas9 genoom editing. El Refaey et al.9 meldde dat raav de Mutante Exon 23 in dystrofische muizen efficiënt kon accijns. In deze studies werden grna's ontworpen in de Intron 20 en 23 om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te veroorzaken, die de Dystrofine-expressie gedeeltelijk herstelde na DNA-herstel via niet-homologe eindverbindende (nhej). Nog spannender, Amoasii et al.10 meldde onlangs de werkzaamheid en haalbaarheid van raav-gemedieerde crispr Gene Editing in het herstellen van Dystrofine expressie in Canine modellen, een essentiële stap in toekomstige klinische toepassing.

DMD veroorzaakt ook stamcel aandoeningen11. Voor spier schade, residentiële spier stamcellen vullen stervende spiercellen na spier differentiatie. Echter, de opeenvolgende cycli van letsel en reparatie leiden tot verkorting van telomeren in spier stamcellen12, en vroegtijdige uitputting van stamcel groepen13,14. Daarom kan een combinatie van autologe stamceltherapie met genoom bewerking om Dystrofine expressie te herstellen een praktische benadering zijn voor de behandeling van DMD. De CRISPR/Cas9 technologie biedt de mogelijkheid om autologe genetisch gecorrigeerde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) te genereren voor functionele spier regeneratie en verdere complicaties van DMD te voorkomen zonder immuunafstoting te veroorzaken. Echter, iPSCs hebben een risico van tumorvorming, die kan worden verlicht door de differentiatie van iPSC in myogene voorlopercellen.

In dit protocol beschrijven we het gebruik van het niet-integrerende Sendai-virus om dermale fibroblasten van DMDMDX -muizen te herprogrammeren in ipscs en vervolgens Dystrofine-expressie te herstellen door crispr/Cas9 genoom verwijdering. Na validatie van Exon23 deletie in iPSC door genotypering, we onderscheiden genoom-gecorrigeerde iPSC in myogene voor ouders (MPC) via MyoD-geïnduceerde myogenic differentiatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle behandelings-en chirurgische procedures voor dieren zijn uitgevoerd door een protocol dat is goedgekeurd door het Comité voor institutionele dierenverzorging en-gebruik van Augusta University (IACUC). Muizen werden gevoed standaard dieet en water ad libitum.

1. isolatie van primaire muizen fibroblasten van volwassen DMDMDX -muizen

  1. Euthanaatie volwassen DMDMDX muizen (mannelijk, 2 maanden oud) door co2 verstikking en Thoracotomie volgens iacuc goedgekeurd door Medical College of Georgia, Augusta University. Snijd de staart met een steriel scalpel in een steriele toestand onder de laminaire kap. Spoel de staart met 70% ethanol gedurende 5 minuten en was vervolgens met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een 6 cm schaal.
  2. Schil de staart huid af met een scherpe incisie van de basis naar de staart uiteinde langs de staart huid en schil de staart huid vervolgens zachtjes met een pincet. Breng de huid op een grootte van 1 mm3 met behulp van een steriel scalpel en verplaats het fijngehakte huid weefsel naar een 6 cm schaal in dulbecco's minimale essentiële medium/Ham's F12 (DMEM/F12) met 0,1% Collagenase IV en 1 U/ml dispase.
  3. Verteren het huid weefsel in een kweek schaal voor 2 uur bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 .
  4. Mantel een 6-goed plaat met fibronectine en 0,2% gelatine (1 mL fibronectine in 199 mL 0,2% gelatine; Tabel met materialen) en incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur.
  5. Dissociate het verteerde huid weefsel met een pipetpunt van 1 mL en breng het weefsel en de supernatant over in een steriele 15 mL conische centrifugebuis. Centrifuge bij 217 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 1,5 ml fibroblast medium (tabel met materialen).
  6. Kweek de pellets inclusief onvolledig verteerd huid weefsel uit stap 1,5 op de 6-put plaat gecoat met fibronectin en 0,2% gelatine uit stap 1,4 in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Vervang het medium 24 h na de initiële plating om niet-bevestigde cellen te verwijderen, en verander het medium elke 48 h.

2. herprogrammering van muizen huid fibroblasten in iPSCs

  1. Twee dagen voor transductie, verteerbaar muis dermale fibroblasten uit stap 1,6 met de cel loslating oplossing (tabel van de materialen) in een 37 ° c incubator met een bevoficeerde atmosfeer van 5% Co2 gedurende 5 min.
  2. Tel cellen met een hemacytometer en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 217 x g .
  3. Zaadcellen met een dichtheid van 1 − 2 x 105 cellen per put op een 6-well plaat en cultuur met fibroblast medium (tabel van de materialen) in een incubator van 37 °c met een bevoficeerde atmosfeer van 5% Co2.
  4. Op de dag van de transductie (dag 0), de cellen inschatten en het volume berekenen van elk virus dat nodig is om de doel multipliciteit van infectie (MOI) van 5, 5 en 3 (d.w.z. KOS MOI = 5, HC-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) volgens het commerciële handboek te bereiken.

figure-protocol-1

  1. Ontdooit drie Sendai-buizen in een waterbad van 37 °C voor 5 − 10 s en voeg de berekende volumes van elk van de drie Sendai-buizen toe aan 1 mL fibroblast-medium (tabel met materialen).
  2. Verwijder het fibroblast-medium uit stap 2,3 en voeg het herprogrammeeringsvirus mengsel toe aan de putjes die de cellen bevatten. Incuberen de cellen 's nachts in een incubator van 37 °C met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2.
  3. Vervang het medium met verse fibroblast medium 24 h na transductie. Cultuur de cellen voor een week met middelgrote uitwisseling om de andere dag.
  4. Oogst geïnfecteerde muizen fibroblasten op dag 7 na transductie met 0,05% trypsine/EDTA en plaats op gerechten die eerder zijn bekleed met fibronectin en 0,2% gelatine.
  5. Cultuur de besmette muis fibroblasten uit stap 2,6 met volledige muis embryonale stamcel (ES) groeimedium (tabel van de materialen) in een 37 ° c incubator met een bevochtigen atmosfeer van 5% Co2 en verander het medium dagelijks.
  6. Observeer vanaf de 8e dag de plaat om de dag onder een omgekeerde Microscoop om de verschijning van celklonten te identificeren met de morfologie van muis ES.

3. met behulp van alkalische fosfatase Live Stain en flow flowcytometrieonderzoeken te kwantificeren herprogrammering efficiëntie

  1. Verwijder de kweekmedia van elke put en spoel af met DMEM/F-12 voor 2 − 3 min.
  2. Breng 2 mL 1x alkalische fosfatase (AP) levende vlek werkoplossing (1:500 verdunning in DMEM/F-12) aan op de aanhanger cellen en incureer in een incubator van 37 °C met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2 gedurende 30 minuten.
  3. Aspireren de AP Live Stain en was tweemaal met PBS voor 5 min elk.
  4. Verwerk de cellen met de cel loslating oplossing (tabel met materialen) in een incubator van 37 °c met een bevoficeerde atmosfeer van 5% Co2 gedurende 5 min. Voer flow Cytometrie uit om de herprogrammatie efficiëntie te bepalen.

4. selecteren en oogsten van ES-achtige cellen

  1. Bestudeer de kolonies uit stap 2,8 onder een omgekeerde Microscoop.
  2. Markeer de kolonies aan de onderkant van de schaal met een object markering met zelf inkt.
  3. Pas ingevette kloon ringen toe om de gemarkeerde celkolonies te bedekken. Voeg gedurende 5 minuten 100 μL 0,05% trypsine/EDTA toe aan elke kloon ring bij 37 °C en breng de verteerde cellen vervolgens over met de pipetpunten van 100 μL naar 48-goed-kweek platen met mES-groeimedium.
  4. Incuberen de cellen in 48-goed cultuur platen in een incubator van 37 °C met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2. Passage van de cellen tot 6 cm schotel wanneer ze bereiken 70% samenloop.
  5. Herhaal de stappen 4,3 en 4,4 meerdere malen totdat uniforme slaapzaal-vormige klonen worden verkregen.

5. invriezen ipscs voor cryopreservatie

  1. Dissociëren de geselecteerde iPSCs uit stap 4,5 met trypsine, versene, en Chick plasma (TVP; Tabel met materialen) oplossing bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 gedurende 30 min.
  2. Verzamel de cellen in een steriele 15 mL conische buis en centrifugeer op 217 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Zuig het supernatant op en onderbreek de celpellet in 2 mL muis ES bevroren medium (tabel metmaterialen) om 1 ml per cryovial te verkrijgen.
  4. Voeg cellen toe aan cryoflesjes en Vries met behulp van een Vries container die de kritische, herhaalde-1 °C/min koelsnelheid biedt die nodig is voor cryopreservering bij-80 °C 's nachts.
  5. Breng bevroren flesjes over in een vloeibare stikstof tank.

6. immunofluorescentie kleuring voor stamcel markers in iPSCs

  1. Zaad iPSCs uit stap 5,1 gekweekt met mES medium in een 8-well kamer Slide bekleed met poly-D-Lysine/laminin (tabel van de materialen) op de juiste dichtheid te bereiken tussen 1 − 2 x 104 cellen per put en incueren in een 37 ° c incubator met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2 voor 48 h.
  2. Dompel de glaasjes in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en dompel de dia's in PBS twee keer gedurende 5 minuten bij elkaar.
  3. Inbroed delen met een muis IgG-blokkerende reagens (tabel met materialen) en 5% geit serum voor 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Verdun de primaire antilichamen in eiwit verdunningsmiddel (Mouse-anti-SSEA1, 1:100, konijn-anti-nanog, 1:500; konijn-anti-POU klasse 5 Homeobox 1 [OCT4], 1:500; konijn-anti-sry-Box 2 [SOX2], 1:500; konijn-anti-Lin-28 homo A [Lin28A], 1:400) (tabel van Materialen). Breng antilichamen aan op de cellen en incuberen bij 4 °C 's nachts in een bevoficeerde kamer.
  5. Gooi de primaire antilichaam oplossing weg en was de dia's 3x in PBS.
  6. Breng tweede antilichamen aan (Alexa488-geconjugeerd geit-anti-muis antilichaam en Alexa555-geconjugeerde geit-anti-konijn, 1:400 elk) in M.O.M. proteïne verdunningsmiddel op dia's en inincuberen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Was de dia's 3x in PBS en monteer secties met afdekmedium met 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  8. Maak Foto's met een confocale Microscoop.

7. onderzoek naar de pluripotentie van iPSCs in vivo

  1. Dissociëren de iPSCs van stap 5,1 in enkele cellen met behulp van TVP-oplossing in een 37 ° c incubator met een bevoficeerde atmosfeer van 5% CO2 gedurende 30 minuten.
  2. Tel cellen met een hemacytometer en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 217 x g .
  3. Zuig het supernatant op en regeer de pellet met mES medium in een steriele centrifugebuis van 1,5 mL met een concentratie van 5 x 105 cellen/30 μL voor celtransplantatie.
  4. Verwijder het haar van beide achterpoten van immunodeficiënte muizen met behulp van haar tondeuses.
  5. Anesthetiseer muizen met ketamine (100 mg/kg) en reinig de injectieplaats met 75% alcohol.
  6. Injecteer 30 μL iPSC-suspensie uit stap 7,3 intramusculair in de gastrocnemii met een naald van 31 G.
  7. Twee weken na de injectie, oogst de muis gastrocnemii en insluiten in optimale snijtemperatuur (OCT) compound, snap bevriezen en gesneden in 5-μm secties15,16.
  8. Repareer secties in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en spoel de dia's vervolgens twee keer in PBS gedurende 5 minuten.
  9. Blokkeer de cellen met 5% geit serumproteïne verdunent voor 1 uur bij kamertemperatuur.
  10. Voeg het verdunde primaire antilichaam toe (konijn anti-AFP, 1:50; konijn anti-SMA, 1:50; konijn anti-TH, 1:50) op de glaasjes en incuberen bij 4 °C 's nachts in een bevoficeerde kamer.
  11. Gooi de primaire antilichaam oplossing weg, was de cellen 3x (5 min/Wash) in PBS, voeg een 1:400 verdund Alexa555-geconjugeerd geit-anti-konijn antilichaam toe aan glijbanen en inincuberen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Spoel dia's 3x (5 min/Wash) in PBS en monteer secties met een bevestigings medium dat DAPI bevat.

8. bouw van crispr/Cas9 lentivirale vector gericht op intron flankerende Dystrofine Exon 23

  1. Ontwerp twee paar grna oligos gericht op intron-geflankte Dystrofine Exon 23 via http://crispor.tefor.net/crispor.py.
    Opmerking: de ontworpen paren zijn als volgt:
    i22sense: 5 '-CACCGTtaagcttaggtaaaatcaa-3 '
    i22anti-Sense: 5 '-AAACTtgattttacctaagcttaaC-3 '
    i23sense: 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 '
    i23anti-Sense: 5 '-AAACAgaaggtatgacacattactC-3 ').
  2. Digest en defosforylaat 5 μg linviraal CRISPR plasmide (Lenti-CRISPRv2-Blast [een geschenk van Mohan Babu] en Lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [een geschenk van Kristen Brennand]) (tabel met materialen) met BsmB1/Esp3I gedurende 30 minuten bij 37 °c. Voeg voor 5 μg plasmiden 3 μL BsmB1-enzym, 3 μL snelle alkalische fosfatase, 6 μL 10x-enzym Digest-buffer en 0,6 μL 100 mM DTT bij een reactie van 60 μL) toe.
  3. Laad de reacties op een 0,8% agarose gel. Voer de gel gedurende 30 minuten uit bij 100 − 150 V.
  4. Reinig verteerd plasmide in-gel met behulp van een gel-extractie Kit (tabel met materialen) en elueer in 20 μL H2O.
  5. Fosforylaat en anneal elk paar van de gRNA oligonucleotiden bevattende 1 μL van elk oligonucleotide bij 100 μM, 1 μL van een ligatie buffer van 10x T4, 0,5 μL T4 polynucleotide kinase (PNK), 6,5 μL ddH2O bij 37 °c gedurende 30 min, en vervolgens 95 °c gedurende 5 min en vervolgens helling d eigen tot 25 °C bij 5 °C/min.
  6. Ligate a 1:200 verdunning van de gegloeide gRNA oligonucleotiden in de plentiCRISPR v2-Blast of plentiGuide-Hygro-iRFP670. Meng 50 ng van BsmB1/Esp3I verteerde vectoren met 1 μL verdunde oligo duplex en 5 μL 2x ligase buffer plus 1 μL ligase in een 11 μL reactiesysteem en incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Voer de transformatie uit met 3 μL ligatie product in 50 μL bevoegde cellen (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
  8. Verdeel de getransformeerde competente cellen in een agar-plaat met 100 μg/mL carbenicilinin en inincuberen bij 31,5 °C gedurende 18 uur.
  9. Kies kolonies met 10 μL steriele pipetpunten en-cultuur in 5 mL geweldige Bouillon (tafel van de materialen) met 100 μg/ml carbenicilinaan bij 31,5 °c, 185 rpm in een shaker-incubator voor 21 uur.
  10. Reinig het plasmide DNA met behulp van de mini-prep en MIDI-prep Kits (tabel van materialen).
  11. Controleer de mini-prep plasmiden door beperking spijsvertering. Voeg voor het reactiesysteem van 20 μL 1 μg plasmide DNA, 2 μL Digest-reactiebuffer (tabel met materialen) en 1 μl restrictie-enzym mengsel (0,5 μl KpnI-hf en 0,5 μl AGEI-HF voor plentiCRISPR v2-Blast-i22; 0,5 μl noti-hf en 0,5 ΜL EcoRI-HF voor plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23). Inincuberen van het reactiesysteem voor 1 uur bij 37 °C.
  12. Laad de reacties op een 0,8% agarose gel. Voer de gel gedurende 30 minuten uit bij 100 − 150 V.
    Opmerking: de juiste banden voor plentiCRISPR v2-Blast-I22 moet 622 BP en 12,2 KB, en de juiste banden voor plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23 moet 2,6 KB en 7,1 KB.

9. lentivirale vector verpakkingen

  1. Cultuur 7 x 105 293ft cellen in 5 ml DMEM media met 10% foetaal runderserum in een schotel van 6 cm 's nachts bij 37 °c, 5% Co2.
  2. Bereid een cocktail (1 μg plenticrispr v2-Blast-I22 of plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng van psPAX2 verpakkings plasmide, 250 ng van pMD2. G envelop plasmide en 5 μl transfectie-reagens a [tabel van de materialen] in 100 μL van gereduceerde serum mem-media).
  3. Bereid een mengsel van 5 μL transfectie reagens B (tabel van de materialen) in 100 μL van gereduceerde serum mem-media.
  4. Voeg 100 μL transfectie reagens B-mengsel toe aan plasmide mengsel uit stap 9,2 en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Voeg het DNA-lipide complex (uit stap 9,4) druppelsgewijs naar de 293ft cellen. Incuberen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2.
  6. Voeg virus productie Enhancer (500x) (tabel van de materialen) aan elk gerecht de volgende dag en incuberen voor 24 h bij 37 ° c, 5% Co2.
  7. Verzamel de komende twee dagen medium uit cellen met pipetten en filtreer het medium door een filter van 0,45 μm om de cellen te verwijderen.

10. concentratie en zuivering van linvirale vectoren

  1. Precipitaat lentivirale vector in het medium van stap 9,7 's nachts bij 4 ° c met 5x polyethyleenglycol 4000 (PEG4000, 8,5% eindconcentratie) en 4 M NaCl (0,4 M eindconcentratie).
  2. Centrifugeer de virale media met de PEG4000-oplossing bij 2.095 x g en 4 °c gedurende 30 minuten, verwijder het supernatant en gooi het weg.
  3. Respendeer de pellets met 500 μL serum gereduceerde MEM media (lentivirus titer: Lenti-CRISPR v2-gRNAi22:1,56 x 108, Lenti-IRFP670-gRNAi23:1,3 x 108, Lenti-crispr v2-controle: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-Control: 5,9 x 107 ). Bewaren bij-80 °C tot gebruik.

11. deletie van Exon 23 in muis iPSCs met twee Guide Rna's (gRNAs) in combinatie met Cas9

  1. Plaat de muis iPSCs uit stap 4,5 in een 24-put plaat gecoat met fibronectin en gelatine.
  2. Nadat de cellen 50% samenvloeiing bereiken, schakelt u over op het verse kweekmedium (volledige muis embryonale stamcel groeimedium) dat 8 μg/mL polybrene bevat).
  3. Voeg 100 μL van de lentivirale deeltjes oplossing uit stap 10,3 met inbegrip van Lenti-CRISPR v2-gRNAi22, Lenti-iRFP670-gRNAi23 en Control (lege Vector: Lenti-CRISPR v2, Lenti-iRFP670) aan muis iPSCs. Incuberen cellen gedurende 3 dagen bij 37 °C met 5% CO2.
  4. Selecteer stabiel geïnfecteerde cellen met media die 2,5 μg/mL blasticidin en 100 μg/mL hygromycine B bevatten door de minimale concentratie van blasticidin en hygromycine B te bepalen die nodig is om de niet-geïnfecteerde cel te doden.
    Opmerking: un-geïnfecteerde cellen worden gedood door blasticidin en hygromycine B.
  5. Verruim de geselecteerde muis iPSCs met 0,5 mL TVP-oplossing elk goed (24-goed plaat) en inincuberen van cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  6. Dissociëren de iPSCs in enkele cellen door pipetteren, cellen tellen met een cel telkamer en vervolgens verdunnen over 150 verteerde enkelvoudige cellen met mES medium in 10 cm schaal voor cultuur bij 37 °C met 5% CO2.
  7. Na ongeveer 10 dagen, kies enkele kolonies onder een omgekeerde Microscoop met 10 μL steriele pipetpunten (96 kolonies moeten worden geplukt).
  8. Breng de verzamelde kolonies in 50 μL TVP-oplossing elk goed (96-goed bord, één kolonie elk goed), verteren bij 37 °C gedurende 30 minuten, en zaai vervolgens de geverteerde cellen in 2 96-goed cultuur platen om de cultuur te behouden (een voor genotypering).
  9. Incuberen in een CO2 -incubator bij 37 °c tot 70% Confluent.

12. identificatie van iPSC-kolonies met exon23 deletie

  1. Verwijder het medium in 96-well plate wanneer de celkolonies 70% samenloop bereiken.
  2. Voeg aan elk goed 25 μL lysisreagens (tabel met materialen) met proteïinase k-oplossing (1 ml proteïnase k in 100 ml lysisreagens) toe en breng het lysaat over naar een 96-goed PCR-plaat.
  3. Sluit de PCR-plaat af en inbroed de platen gedurende 30 minuten bij 55 °c, en vervolgens bij 95 °c gedurende 45 min om de cellen te lyseren en de proteïnase K te denatureren.
  4. Voer PCR-reactie uit met 2 μL lysaat uit stap 12,3. Voeg voor de PCR-reactie van 20 μL 2 μL lysaat, 10 μL van 2x DNA-polymerase premix (tabel van materialen), 7 μl DNase-vrij water en 1 ΜL DMD-Exon 23 primers (tabel 1) toe.
  5. Gebruik de volgende parameters voor PCR-reactie: 98 °C gedurende 1 minuut, 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 30 sec. en een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut.
  6. Laad de PCR-reactie op een 2% agarose gel. Voer de gel gedurende 30 minuten uit bij 100 − 150 V.
  7. Inspecteer de gel onder UV-licht (de afdek efficiëntie is 3/94).

13. gebruik van het Tet-on MyoD activeringssysteem om iPSC direct te differentiëren in myogene voorlopercellen (MPC)

  1. Verpak de LV-TRE-VP64-Mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 en LV-TRE-VP16 muis MyoD-T2A-dsRedExpress2 (een geschenk van Charles Gersbach) (tabel met materialen) zoals eerder beschreven voor Lenti-CRISPRv2-blast en Lenti-grna-iRFP670 vectoren in secties 9 en 10.
  2. Infecteren muis iPSC met lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 of lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 zoals eerder beschreven voor Lenti-CRISPRv2-blast en Lenti-gRNA-iRFP670 vectoren in stappen 11.1 − 11.3.
  3. Selecteer cellen met 1 μg/mL puromycine na drie dagen infectie om een zuivere getransduceerde celpopulatie te verkrijgen.
  4. Voeg 3 μg/mL doxycycline toe aan kweekmedia (10% FBS DMEM) aan MPC-differentiatie. Vervang vers medium, aangevuld met doxycycline, elke twee dagen.

14. kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR voor het evalueren van dynamische spier differentiatie en DMD Exon 22-24-expressie

  1. Extract cellulaire RNA na 0, 3, 6, en 10 dagen na behandeling met doxycycline met behulp van RNA isolatie reagens, eerbieding transcriberen RNA in cDNA met behulp van eerste streng cDNA synthese Kit (tabel van materialen).
  2. Voeg voor het qPCR-reactiesysteem van 20 μL 1 μL cDNA, 10 μL PCR-reactiebuffer (tabel met materialen), 8 μl DNA H2O en 1 μl mengsel van voorwaartse en omgekeerde primers (Glyceraldehyde-3-fosfaat DEHYDROGENASE [gapdh], skeletspieren [ACTA1], OCT4 en DMD-exon22, DMD-exon23 en DMD-exon24, Zie tabel 1).
  3. Gebruik de volgende parameters voor PCR-reactie: 50 °C gedurende 2 min, 95 °C gedurende 2 min, 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 1 minuut, smelt curve 65,0 °C tot 95,0 °C, toename 0,5 °C.

15. immunofluorescentie kleuring van myosin Heavy Chain 2 (MYH2) en Dystrofine eiwit expressie

  1. Plaat doxycycline-geïnduceerde, Lenti-TRE-MyoD gemodificeerde cellen van stap 13,4 op 8-well cultuur dia's.
  2. Repareer de cellen in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en spoel de dia's vervolgens twee keer in PBS gedurende 5 minuten.
  3. Blokkeer de cellen met 5% geit serumproteïne verdunent voor 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Voeg konijn-anti-Dystrofine antilichaam (1:300) en Mouse-anti-MYH2 antilichaam (1:100) toe aan de glijbanen, inbroed bij 4 °C 's nachts in een bevoficeerde kamer.
  5. Gooi de primaire antilichaam oplossing weg, was de cellen 3x (5 min/Wash) in PBS, voeg 1:400 verdunde Alexa488-geconjugeerde geit-anti-konijn antilichamen en Alexa555-geconjugeerd geit-anti-muis antilichaam toe aan glijbanen en inincuberen voor 45 min bij kamertemperatuur.
  6. Was de dia's 3x (5 min/Wash) in PBS en monteer secties met een bevestigings medium met DAPI.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Oprichting van DMDMDX -huid fibroblasten afgeleid IPSC. We toonden de efficiëntie van het genereren van muis iPSCs van DMDMDX muizen afgeleide huid fibroblast met behulp van de integratie-vrije herprogrammering vectoren. Figuur 1a toonde aan dat de verschijning van embryonale stamcel (ESC)-achtige kolonies op drie weken na infectie. We evalueren de efficiëntie van iPSC-inductie door Live alkalische fosfatase (AP) vlek; Afb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een destructieve en uiteindelijk fatale erfelijke aandoening die wordt gekenmerkt door een gebrek aan Dystrofine, wat leidt tot progressieve spieratrofie1,2. Onze resultaten tonen de herstelde Dystrofine genexpressie in DMDMDX IPSC-afgeleide myogene voorlopercellen door de aanpak van crispr/Cas9-gemedieerde exon23 deletie. Deze aanpak heeft drie voordelen.

Eerst genereerden we iPSCs van DMD

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Tang en Weintraub werden deels ondersteund door NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chirurgische instrumenten
31-gauge naaldVerschillend 
Scherpe insnijdingVerschillend 
Steriele scalpelsVerschillend 
PincetVerschillend 
Fibroblast medium (voor 100 mL compleet medium)BedrijfCatalogusnummerVolume
2-Mercaptoethanol (55 mM)Gibco21-985-0230.1 mL
Antibioticum Antimycotisch Slution 100xCORNINGMT30004CI1 mL
Dulbecco's Aangepast Eagle's Medium - hoge glucoseSIGMAD642987 mL
Fetaal bovien serum GekarakteriseerdHyCloneSH30396.0310 mL
L-Glutamine oplossingSIGMAG75131 mL
MEM Niet-essentiële aminozuren oplossing (100x) Gibco111400761 mL
TVP oplossing (voor 500 mL compleet oplossing)BedrijfCatalogusnummerVolume
KippenserumGibco16110-0825 mL
EDTASigma-AldrichE6758186 mg
Fosfaat-gebufferde zoutoplossingtot 500 mL
Trypsine (2,5%)Thermo150900465 mL
mES groeimedium(voor 500 mL compleet oplossing)BedrijfCatalogusnummerVolume
2-Mercaptoethanol (55 mM)Gibco21-985-0230.5 mL
Antibioticum Antimycotisch Slution 100xCORNINGMT30004CI5 mL
Dulbecco's Aangepast Eagle's Medium - hoge glucoseSIGMAD6429408.5 mL
Fetaal bovien serum GekarakteriseerdHyCloneSH30396.0375 mL
L-Glutamine oplossingSIGMAG75135 mL
Muis recombinant Leukemie Inhibitory Factor (LIF), 0,5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS210511500 μL
MEK/GS3 Inhibitor SupplementEMD Millipore CorpCS210510-500UL500 μL
MEM Niet-essentiële aminozuren oplossing (100x) Gibco111400765 mL
Het ES-celmedium mag niet langer dan 4 weken worden bewaard en met remmers niet langer dan 2 weken.
mES bevroren medium(voor 50 mL compleet oplossing)BedrijfCatalogusnummerVolume
Dimethyl sulfaat (DMSO)SIGMAD26505 mL
Dulbecco's Aangepast Eagle's Medium - hoge glucoseSIGMAD642924.9 mL
Fetaal bovien serum GekarakteriseerdHyCloneSH30396.0325 mL
Muis recombinant Leukemie Inhibitory Factor (LIF), 0,5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS21051150 μL
Naam van materiaal/apparatuurBedrijfCatalogusnummerRRID
0,05% Trypsine/0,53 mM EDTACORNING25-052-CI
4% ParaformaldehydeThermo scientificJ19943-k2
Accutase-oplossingSIGMAA6964Celdetacheringsoplossing
AgeI-HFNEBR3552L
Alexa488-geconjugeerd geitenanti-muisantilichaamInvitrogenA32723AB_2633275
Alexa488-geconjugeerd geitenanti-konijnantilichaamInvitrogenA32731AB_2633280
Alexa555-geconjugeerd geitenanti-konijnantilichaamInvitrogenA32732AB_2633281
anti-AFPThermo scientificRB-365-A1AB_59574
anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XPCST19245SAB_2734735
anti-DystrophineThermoPA5-32388AB_2549858
anti-LIN28A (D1A1A) XP   CST8641SAB_10997528
anti-MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
anti-Nanog-XPCST8822SAB_11217637
anti-Oct-4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
anti-Sox2abcamab97959AB_2341193
anti-SSEA1(MC480) CST4744sAB_1264258
anti-TH (H-196)SANTA CRUZ sc-14007AB_671397
Alkaline fosfatase live-kleuring (500x)ThermoA14353
Blasticidine SSigma-Aldrich203350
BsmBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
CarbenicillineMillipore205805-250MG
Collagenase IV Worthington Biochemical CorporationLS004189
Competent CellsTakaRa636763
CutSmart NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermoA16517
DirectPCR Lysis Reagent (cell)VIAGEN BIO

Referenties

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244(2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Cas9 genbewerkingherstel van dystrofine expressieDuchenne spierdystrofienon homologe eindverbindingdeletie van exon 23MyoD ge nduceerde differentiatieherprogrammering met Sendai vectorPCR validatieagarosegelelektroforese

Gerelateerde artikelen