Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Planten hebben een robuust immuunsysteem ontwikkeld om pathogenen te zien en te beschermen tegen ziekte. Dit artikel beschrijft twee testen die kunnen worden gebruikt voor het meten van de sterkte van de immuunactivering in Arabidopsis thaliana na behandeling met elicitor moleculen. Gepresenteerd eerst is een methode voor het vastleggen van de snel geïnduceerde en dynamische oxidatieve burst, die kan worden bewaakt met behulp van een Luminol gebaseerde assay. De tweede is een methode die beschrijft hoe de door immuungeïnduceerde remming van zaailing te meten. Deze protocollen zijn snel en betrouwbaar, vereisen geen gespecialiseerde training of apparatuur, en worden op grote schaal gebruikt om de genetische basis van de immuniteit van de plant te begrijpen.
Inleiding
Om te waarnemen en te verdedigen tegen pathogenen, planten hebben geëvolueerd membraan-gebonden patroon erkenning receptoren (PRRs) dat geconmaald microbiële moleculen buiten de cel bekend als microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs)1detecteren. De binding van mamps aan hun verwant PRRS initieert eiwit kinase-gemedieerde immuun signalering resulterend in breedspectrum ziekte resistentie2. Een van de vroegste reacties na activering van PRR is de fosforylering en activering van integraal plasma membraan respiratoire BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) eiwitten die de productie van extracellulaire reactieve zuurstof soor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. detectie van ROS burst in Arabidopsis Leaf discs na immuun elicitatie
- Plantengroei en-onderhoud.
- Voor het synchroniseren van de kiemkracht, van Arabidopsis zaden door ongeveer 50 zaden op te schorten in 1 ml steriele 0,1% agar [w/v] en op te slaan bij 4 °c (geen licht) gedurende 3-4 dagen.
Opmerking: Stratify een wild type achtergrond besturingselement (bijvoorbeeld, Col-0) en genotypen met hoge en lage immuunoutputs (bijvoorbeeld cpk28-1 en bak1-5, respectievelijk) om te dienen als interne controles. - Zaaizaden op de bodem en ontkieren onder standaard kortdurende condities (22 °C, 10 uur licht, 150....
- Voor het synchroniseren van de kiemkracht, van Arabidopsis zaden door ongeveer 50 zaden op te schorten in 1 ml steriele 0,1% agar [w/v] en op te slaan bij 4 °c (geen licht) gedurende 3-4 dagen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Mutant cpk28-119,25 en bak1-517,18 planten werden gebruikt om de verwachte resultaten voor genotypen met hoge en lage immuunresponsen aan te tonen, respectievelijk in oxidatieve burst en SGI assays ten opzichte van een wild-type achtergrond besturingselement (Col-0). Om de dosisafhankelijke effecten te beoordelen, werd een 10-voudige peptide verdunningsre.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft twee methoden voor het aszeggen van patroon-geactiveerde immuunresponsen in Arabidopsis, het aanbieden van kwantitatieve benaderingen voor het evalueren van immune output zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. In combinatie, patroon-geactiveerde ROS en SGI kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van vroege en late reacties op microbe perceptie, respectievelijk.
De belangrijkste beperking van de oxidatieve burst-assay is variabiliteit. Om redenen .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Het werk in ons lab wordt gefinancierd door de Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, de Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader ' Fund en Queen's University. KS en wordt ondersteund door tandem Ontario Graduate beurzen en NSERC Canada Graduate beurzen voor master's Students (CGS-M).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 20-20-20 Meststof | Plant Prod | 10529 | Meng 1 g/L in water en breng het elke 2 weken aan op planten voor optimale groei. |
| 4 mm Biopsie Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | Een kurkboorset met een oppervlakte van 0,125 cm^2 kan ook worden gebruikt. |
| 48-Well Steriele Platen met Deksel | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytische Weegschaal met Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Elke standaard analytische weegschaal kan worden gebruikt voor groeiremmingstests, maar een directe computeruitvoer is optimaal. |
| BioHit mLine Mechanische 12 Multikanaals Pipet (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Elke multikanaals pipet kan worden gebruikt, evenals een enkele pipetteerder indien nodig. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Bewaar 10 mM stockpeptide bij -80C in buisjes met lage eiwitbinding. Na ontdooien, bewaar 100 uM werkstock bij -20C. |
| Pincet | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Oplossen in zuiver water. Bewaren bij -20C en uit de buurt van licht. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Oplossen in DMSO. Bewaren bij -20C en uit de buurt van licht. |
| Murisage en Skoog Basale Zouten | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Bewaren bij 4C. |
| Grond | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Andere grondsoorten kunnen ook worden gebruikt om Arabidopsis te kweken. Meng met water bij het vullen van potten. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader met LUM Module | Molecular Devices | Moet een offerte aanvragen | Elke plate reader die luminescentie kan detecteren, kan worden gebruikt voor deze tests. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Bewaren bij kamertemperatuur. |
| Witte Polystyreen 96-Well Platen | Fisher Scientific | 07-200-589 |
Referenties
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Per....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
