Synthese, Functionalization en karakterisatie van Fusogenic poreuze Silicon nanodeeltjes voor Oligonucleotide levering

Byungji Kim; Michael  J. Sailor

doi:10.3791/59440

Methodenartikel

Synthese, Functionalization en karakterisatie van Fusogenic poreuze Silicon nanodeeltjes voor Oligonucleotide levering

DOI:

10.3791/59440

⸱

16 april 2019

Byungji Kim¹ , Michael J. Sailor¹^,²

¹Materials Science and Engineering Program, University of California, San Diego, ²Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We laten zien dat de synthese van fusogenic poreuze silicon nanodeeltjes voor effectieve in vitro en in vivo oligonucleotide levering. Poreuze silicon nanodeeltjes worden geladen met siRNA vormen de kern, die is bedekt door fusogenic lipiden door middel van extrusie te vormen van de shell. Targeting deel functionalization en karakterisering van het deeltje worden opgenomen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de komst van gentherapie, de ontwikkeling van een effectief in vivo nucleotide-nettolading uitvoeringssysteem geworden van parallelle invoer. Fusogenic poreuze silicon nanodeeltjes (F-pSiNPs) hebben onlangs aangetoond dat hoge in vivo gene werkzaamheid te wijten aan de hoge oligonucleotide laden capaciteit en unieke cellulaire opname traject dat endocytose vermijdt zwijgen. De synthese van F-pSiNPs is een multi-stap proces dat omvat: (1) laden en afdichten van oligonucleotide payloads in het silicium poriën; (2) gelijktijdige coating en dimensionering van fusogenic lipiden rond de poreuze silicon kernen; en (3) vervoeging van targeting peptiden en wassen als u wilt verwijderen van de overtollige oligonucleotide, silicium puin en peptide. Van het deeltje grootte uniformiteit wordt gekenmerkt door Dynamische lichtverstrooiing en de structuur van de kern-shell kan worden gecontroleerd door transmissie-elektronenmicroscopie. De opname van de fusogenic is gevalideerd door het laden van een lipofiele kleurstof, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI), in de fusogenic lipide dubbelgelaagde en behandelen naar cellen in vitro te observeren voor plasmamembraan kleuring endocytotische lokalisaties. De doelgerichtheid en in vivo gene silencing efficacies waren eerder gekwantificeerd in een muismodel van Staphylococcus aureus -pneumonie, waarin de targeting peptide wordt verwacht om te helpen de F-pSiNPs naar huis naar de plaats van de infectie. Buiten de toepassing ervan in S. aureus -infectie, kan de F-pSiNP-systeem worden gebruikt voor elke oligonucleotide voor gentherapie van een breed scala van ziekten, met inbegrip van virale infecties, kanker en auto-immune ziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gentherapie moduleert specifieke genexpressie om te verkrijgen van een therapeutische resultaat. Tal van hulpmiddelen voor gene modulatie hebben ontdekt en bestudeerd, met inbegrip van RNA zuur interferentie (RNAi) met behulp van oligonucleotides (bijvoorbeeld korte Mengend RNA (siRNA)¹^,², microRNA (miRNA)³^,⁴), DNA plasmiden⁵^,⁶, nucleasen (bijvoorbeeld zink vinger, TALENS)⁷^,⁸, en⁹^,^10....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. synthese van poreuze silicon nanodeeltjes (pSINPs)

Let op: Wees altijd voorzichtig bij het werken met waterstoffluoride (HF). Alle gidsen van veiligheid volgens het veiligheidsinformatieblad (SDS) volgen, omgaan met een HF-bevattende chemicaliën in een zuurkast en dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE; dubbele handschoenen met butyl handschoenen aan de buitenkant, butyl schort met laboratoriumjas onder, gezicht schild met veiligheidsbril onder). Alle universiteiten en R & D labs vereisen specifieke opleiding op HF veiligheid voorafgaand aan gebruik. Probeer niet om te werken met HF zonder voorafgaande goedkeuring van ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een succesvolle synthese van fusogenic pSiNPs moet produceren een homogene, enigszins ondoorzichtig oplossing (Figuur 3a). Falen om de verhouding en de concentratie van pSiNPs te optimaliseren: siRNA: CaCl₂ kan leiden tot samenvoeging bij het laden van (Figuur 3b). De deeltjes zijn warm geperst door 200 nm membranen, de gemiddelde hydrodynamische diameter van de pSiNPs van de fusogenic gemeten door DLS moeten ongeveer .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synthese van poreuze silicon nanodeeltjes is afgebeeld in Figuur 5. De kritische stap in de synthese van fusogenic pSiNPs is in de laden stap (stap 3). Als de fusogenic-nanodeeltjes zijn aggregeren na synthese (Figuur 3), de reden kan worden veroorzaakt door het volgende: (1) calciumchloride voorraad homogeen niet bereid was, dus stap 3.1.2 moet zorgvuldig gevolgd of geraffineerd; of (2) de verhouding tussen pSiNP: siRNA: CaCl₂ of de concentratie van .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MJS is een wetenschappelijke grondlegger van Spinnaker Biosciences, Inc., en heeft een aandelenbelang in het bedrijf. Hoewel deze subsidie is vastgesteld voor het beheer van de belangenconflicten op basis van het algemene toepassingsgebied van het project en zijn potentiële voordelen voor Spinnaker Biosciences, Inc., kunnen de onderzoeksresultaten opgenomen in deze bijzondere publicatie niet noodzakelijkerwijs betrekking hebben op de belangen van Spinnaker Biosciences, Inc. De bepalingen van deze overeenkomst zijn herzien en goedgekeurd door de University of California, San Diego overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling. Andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health door contract # R01 AI132413-01.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Poeder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propaan (chloridezout) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Poeder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Poeder
Aluminiumfolie	VWR International, LLC	12175-001
Calciumchloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Watervrij, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Elke computer met PCI-kaartsleuf is acceptabel
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Waterstoffluoride (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Zuiverheid: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Voorbeeldprogramma beschikbaar op: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposomenextrusieset met verwarmingsblok	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugaal Filtereenheid	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Fosfaatgebufferd zout (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinumspiraal	VWR International, LLC	AA10285-BU
Kaliumhydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicion wafer	Siltronix	Op bestelling
siRNA	Dharmacon	Op bestelling	IRF5, zin 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ en antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Doelpeptide (CRV)	CPC Scientific	Op bestelling	sequentie CRVLRSGSC; gemaakt cyclisch door een disulfidebinding tussen de zijketens van de twee cysteïneresidu's
Teflon etch cel	Interface Performance Materials, Inc.	Op bestelling
UltraPure DNase/RNase-Free Gedistilleerd Water	Thermo Fisher Scientific	10977015

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5(2004).
Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dynamische Lichtverstrooiing Transmissie elektronenmicroscopie Liposoomextrusie Confocale Microscopie Peptideconjugatie siRNA laden Zetapotentiaalmeting Hydrodynamische Diameter

Synthese, Functionalization en karakterisatie van Fusogenic poreuze Silicon nanodeeltjes voor Oligonucleotide levering

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen