Multi-Locus variabele-nummer tandem-herhaling analyse van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri door multiplex PCR en capillaire elektroforese

Summary

De multi-Locus variabele-aantal tandem-repeat analyse (MLVA) assay hier gepresenteerd maakt goedkope, robuuste en draagbare hoge-resolutie genotypering van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri. Beginnend bij zuivere culturen, gebruikt de assay multiplex PCR en capillaire elektroforese om tien-loci MLVA-profielen voor downstreamtoepassingen te produceren.

Abstract

Yersinia ruckeri is een belangrijk pathogeen van gekweekte zalmachtigen wereldwijd, maar eenvoudige hulpmiddelen geschikt voor epizootiologische onderzoeken (infectie tracing, enz.) van deze bacterie ontbreken. Een multi-Locus variabele-nummer tandem-repeat analyse (MLVA) test werd daarom ontwikkeld als een gemakkelijk toegankelijk en eenduidig instrument voor het met hoge resolutie genotypering van teruggewonnen isolaten. Voor de hier gepresenteerde MLVA-assay wordt DNA geëxtraheerd uit gekweekte Y. ruckeri monsters door het koken van bacteriële cellen in water, gevolgd door het gebruik van supernatant als sjabloon voor PCR. Primer-paren gericht op tien variabele-nummer tandem-repeat (VNTR) loci, afgewisseld door de Y. ruckeri genoome, worden gelijkelijk verdeeld over 2 5-Plex PCR-reacties die onder identieke fiets condities lopen. Voorwaartse primers worden geëtiketteerd met een van de drie fluorescerende kleurstoffen. Na ampliconlengte voor temp bevestiging door gel elektroforese, worden PCR-producten verdund en onderworpen aan capillaire elektroforese. Van de resulterende elektroferogram profielen, pieken die elk van de VNTR loci zijn grootte-genoemd en gebruikt voor het berekenen van VNTR herhaling graven in silico. Resulterende tien-cijferige MLVA-profielen worden vervolgens gebruikt voor het genereren van minimale spanning bomen waardoor epizootiologische evaluatie door clusteranalyse. De zeer draagbare uitvoergegevens, in de vorm van numerieke MLVA-profielen, kunnen snel worden vergeleken tussen Labs en geplaatst in een spatiotemporele context. De hele procedure van gekweekte kolonie tot epizoötiologische evaluatie kan worden voltooid voor maximaal 48 j. ruckeri isolaten binnen één werkdag.

Introduction

Yersinia ruckeri, een gram-negatieve bacterie en lid van de yersiniaceae familie, veroorzaakt Yersiniose in gekweekte zalmachtigen vissen wereldwijd¹. Het is gemakkelijk gediagnosticeerd van besmette vis door teelt op vele soorten agar media, maar tot voor kort was er weinig bekend over de bevolkingsstructuur en epizootiologie van Y. ruckeri over de hele wereld en in verschillende habitats (gastheer soorten, enz.). Bestaande serotype systemen voor Y. ruckeri zijn inconsistent, gebrek aan wederzijdse compatibiliteit en bieden een lage epidemiologische resolutie. Sommige moleculaire studies op de bacterie zijn uitgevoerd, met technieken zoals multilocus sequentie typen (mlst), gepulseerde veld gel elektroforese (PFGE) of whole-genoom sequentie (WGS) analyse^{2,3,4 ,5}. MLST biedt echter geen voldoende hoge resolutie voor routine infectie tracering, terwijl PFGE arbeids veeleisend is en resultaten oplevert die niet gemakkelijk overdraagbaar zijn in laboratoria. Terwijl de WGS-analyse een nabije eindresolutie zou opleveren, zou het opzetten en uitvoeren van dergelijke analyses een voorwaarde zijn voor technische-en bioinformatica capaciteiten die nog steeds beperkt blijven tot een relatief klein aantal laboratoria.

Multi-Locus variabele-nummer tandem-repeat analyse (mlva) vertegenwoordigt een eenvoudig en gemakkelijk toegankelijk moleculair type gereedschap, dat een genetische resolutie biedt in sommige gevallen die bijna overeenkomen met die van WGS-analyse^6,7. De techniek is gebaseerd op herhalings getalvariatie in geselecteerde variabele-nummer tandem-repeat (VNTR) loci, resulterend in uitvoergegevens die zeer transporteerbaar zijn, waardoor vergelijking van geprofileerde isolaten naar online databases en over Labs eenvoudig is. Hoewel mlst blijft de gouden standaard voor epidemiologische typen van veel bacteriële pathogenen, een toenemend aantal studies identificeren een significant hogere discriminerende kracht van mlva^8,9,10. Er zijn ook verschillende protocollen gepubliceerd die gericht zijn op vispathogene bacteriën, zoals Francisella noatunensis, edwardsiella en Renibacterium salmoninarum^{11,12, 13}.

Het ten-loci MLVA-protocol dat hier werd gepresenteerd, dat onlangs de basis vormde voor een uitgebreide Y. ruckeri populatie studie¹⁴, omvat extractie van DNA uit agar-gekweekte kolonies, multiplex PCR en capillaire ELEKTROFORESE (CE), gevolgd door downstream in silico-toepassingen. Voor elk onderzocht isolaat worden twee multiplex PCRs, beide met vijf fluorescently gelabelde primer paren (6FAM, NED of VIC), elk gericht op individuele VNTR-gebieden, parallel uitgevoerd onder identieke omstandigheden. Na verificatie van de PCR-amplicons door gelelektroforese (GE) worden PCR-producten vóór de CE-analyse verdund en pieken die de respectieve VNTR loci vertegenwoordigen, worden van de resulterende electropherogrambestanden de grootte genoemd. Samen met Locus-specifieke formules accounting voor kleine, sequentie-specifieke verschillen in CE migratiepatronen, VNTR CE grootte aanroepen worden vervolgens gebruikt voor het berekenen van VNTR REPEAT tellingen die worden samengevoegd in tien-cijferige MLVA-profielen. Deze worden gebruikt als input voor epizoötiologische evaluaties (bijvoorbeeld door clusteranalyse in minimum spanning tree (MST) diagrammen).

Protocol

Let op: voor het geheel van het protocol is het raadzaam om alle natte laboratorium procedures sterilely uit te voeren door het gebruik van Labjassen, wegwerphandschoenen en steriele reagentia en apparatuur. Het is ook raadzaam om PCR-reacties te bereiden in een aparte ruimte (pre-PCR) die niet wordt gebruikt voor PCR-amplificatie en/of behandeling van PCR-producten (post-PCR). Bewaar alle reagentia zoals aanbevolen door de fabrikant. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de gebruikte reagentia, apparatuur en software.

1. bacteriële teelt en extractie van genomisch DNA

1. Zaaien Y. ruckeri zuivere culturen op elk geschikt agar-type (de auteurs gebruikten 5% runderbloed agar) en incuberen bij 22 °c gedurende 1-2 dagen, of 15 °c gedurende 3-4 dagen.
2. Kies van elke agar-plaat één representatieve kolonie met een inoculatie-lus en breng deze over naar 1,5 mL centrifugebuizen met 50 μL ultrapurificeerd water. Onderbreken, Vortex kort, en inincuberen gedurende 7 minuten op een verwarmingsblok bij 100 °C.
3. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 16 000 x g en gebruik een pipet om het supernatant voorzichtig over te brengen naar een lege centrifugebuis van 1,5 ml. Ga door naar de volgende stap met behulp van de supernatant als template DNA of Bewaar bij-20 °C tot die tijd.

2. multiplex PCR Setup en fiets condities

Opmerking: Elke multiplex PCR-reactie (twee per Y. ruckeri -isolaat) moet 12,5 μL van 2X multiplex PCR plus Master mix, 0,1 tot 0,2 μM van elk geschikt primer paar (tabel 1) en 3 μL template DNA bevatten, aangepast aan een laatste reactievolume van 25 μL door toevoeging van RNase-vrij water. Streef ernaar om de licht blootstelling van de fluorescentiet gelabelde voorwaartse primers minimaal te houden (bijv. door de opslag buizen in aluminiumfolie te wikkelen).

1. Voor elk van de twee multiplex PCR-testen (tabel 1), bereiden Master mixen zoals hierboven beschreven (zonder template DNA) volgens het aantal monsters plus één positieve en één negatieve controle. Bovendien, toestaan 10% overschot volume. Vortex de bereide meester mengt zachtjes bij lage snelheid.
2. Verdeel 22 μL van elk Master mengsel afzonderlijk in afzonderlijke putjes op PCR-strips of-platen, naargelang het aantal monsters, en voeg 3 μL van de sjabloon toe aan elk putje (voor respectievelijk positieve en negatieve controles gebruikt u DNA van een geverifieerde Y. ruckeri spanning en ultrapurificeerd water). Kort afdichten en centrifugeren.
3. Voer alle monsters uit op een PCR-thermische cycler met het volgende programma: (i) 5 min bij 95 °C (II) 30 cycli van 0,5 min bij 95 °C, 1,5 min bij 60 °C, en 1 minuut bij 72 °C, en (III) 60 min bij 68 °C, gevolgd door koeling tot 4 °C voor onbepaalde tijd. Het programma zal in minder dan 3 uur worden voltooid.

3. PCR Amplicon bevestiging door gel elektroforese

1. Bereid volgens de aanbevelingen van de fabrikant een volume van 1,5% (w/v) agarose-gel in 1x tris-borate-EDTA-buffer (TBE) geschikt voor het aantal te testen PCR-reacties. Voeg vóór het gieten 5 μL fluorescerende nucleïnezuur kleurstof toe per 50 μL gel-oplossing en meng. Gebruik trays en kammen waar nodig voor het gieten, waardoor een passend aantal putten vrij is voor DNA-referentie ladders.
2. Na het instellen, dompel de gel in 1x TBE-buffer in een GE-systeem. Meng 5 μL PCR-product samen met 2 μL lading kleurstof en breng over naar de gel putten. Voeg 5 μL DNA-ladder toe in lege putten ter referentie.
3. Voer de gel op 110 V per 15 cm voor ongeveer 1 uur en gebruik een UV-gebaseerd gel Imaging/visualisatie systeem om de aanwezigheid van meerdere (maximaal vijf) banden die PCR-amplicons vertegenwoordigen te controleren (zie voorbeeld in Figuur 1). Gooi de gel weg. Ga verder met de volgende stap of bewaar resterende PCR-producten bij 4 °C tot verdere verwerking.

4. capillaire elektroforese Setup en run voorwaarden

1. Verdun PCR-producten 1:10 (v/v) in gezuiverd water na bevestiging van de PCR-amplicons. Afdichting, meng en centrifugeer kort.
2. Als u in een zuurkast werkt, bereidt u een volume Master mix voor van 9 μL formamide en 0,5 μL standaard per PCR-product (voor een overschot van 10%). Vortex kort en verdeel 9,5 μL in putjes op een plaat die geschikt is voor het beschikbare CE-systeem, alvorens 0,5 μL verdund PCR-product toe te voegen. Afdichting, meng en centrifugeer kort.
   Let op: Voorzichtig behandelen. Het mengen van formamide met water genereert mierenzuur, wat giftig is.
3. Gebruik een PCR-thermische cycler, denatureren de monsters bij 95 °C gedurende 3 minuten voor de koeling tot 4 °C voor onbepaalde tijd. Centrifugeer kort en laad de plaat op een gekalibreerd CE-systeem volgens de instructies van de fabrikant.
4. Voer fragment analyse CE uit met reagentia die geschikt zijn voor het apparaat naar keuze en de volgende instellingen: 60 °C; 5 s injecties bij 1,6 kV (32 V per cm); 32 min uitvoeringstijd bij 15 kV (300 V per cm). CE-fragment analyse van 24 putjes op een 24-capillair (50 cm) duurt meestal ongeveer 50 min.

5. VNTR grootte aanroepen, herhaal Count berekening en MLVA profilering

Opmerking: Stap 5,1 beschrijft Y. ruckeri VNTR CE grootte aanroepen van elektroferogram bestanden, met behulp van de specifieke software vermeld in de tabel van de materialen. Raadpleeg de software handleiding voor meer informatie en het oplossen van problemen. Voor het gebruik van andere software raadpleegt u de juiste handleidingen.

1. Importeer CE-resultaat bestanden (twee per Y. ruckeri -isolaat). Stel de analysemethode in op Microsatellite standaard en selecteer de juiste productkeuze onder maat standaard, voordat u op de knop analyseren drukt. Controleer de juiste identificatie van grootte standaard fragmenten door de formaat match editor en corrigeer alle zichtbaar foutieve toewijzingen.
   1. Nadat u de te lezen sample (s) hebt geselecteerd, klikt u op de knop Toon plots en drukt u op CTRL + A om de weergave van de formaat tabelin te schakelen. Houd in het bovenste deelvenster CTRL ingedrukt terwijl u klikt op de vijf pieken die de VNTR amplicons vertegenwoordigen (gebruik de zoomfunctie indien nodig).
      Opmerking: Voor elk van de multiplex-PCR-producten toont het elektroforen gram vijf pieken verdeeld over de drie gebruikte kleurstoffen (zie 5 ' kleurstof etikettering van voorwaartse primers in tabel 1 en de twee voorbeelden in Figuur 2).
   2. Druk op CTRL + G om de formaat tabelte filteren, alleen de kenmerken van de vijf gemarkeerde pieken weer te geven en voor elke VNTR Locus (met verwijzing naar tabel 1) voor de downstream-toepassing de CE-grootte aanroepen op te nemen.
2. Om rekening te houden met partijdige ampliconlengte voor temp mobiliteitspatronen tijdens de CE, berekent u nauwkeurige VNTR-herhalings tellingen volgens de onderstaande formule, waarbij VNTR CE-formaat aanroepen samen met Locus-specifieke variabelen worden ingeschakeld (Zie tabel 1). Voor efficiëntie is het raadzaam om dit proces te automatiseren (bijvoorbeeld door een spreadsheet sjabloon te gebruiken).
   
3. Ronde berekende VNTR-herhalingen tellen af naar het dichtstbijzijnde gehele getal en worden samengevoegd tot tien cijferreeksen, die elk het MLVA-Profiel van een enkele Y. ruckeri -isolaat vertegenwoordigen.

6. minimale spanning boom cluster analyse van MLVA gegevens

Opmerking: Stap 6 beschrijft het maken van MST-diagrammen van Y. ruckeri mlva-gegevens, met behulp van de specifieke software die wordt vermeld in de tabel met materialen. Raadpleeg de software handleiding voor meer informatie en het oplossen van problemen. Voor het gebruik van andere software raadpleegt u de juiste handleidingen.

1. Maak een nieuwe database en kies ervoor om de MLVA-plugin te activeren.
2. Importeer Y. ruckeri mlva-profielen en metagegevens door gegevens van het type teken te selecteren, gevolgd door import velden en-tekens (verdere Subselectie afhankelijk van de opslagindeling). Wanneer u hierom wordt gevraagd, geeft u import regels op volgens de inhoud van het importbestand: in de kolom doeltype classificeren VNTR REPEAT telt als tekenwaarde: VNTR, en de diverse metagegevens als vermeldsinformatie: iteminfo veld .
   Opmerking: Voor vergelijking en context is het ook mogelijk om de volledige gegevensset (Open Access) te importeren, samen met het originele papier dat het huidige MLVA-protocol¹⁴in gebruik heeft. MLVA-profielen en metagegevens over de diverse verzameling van Y. ruckeri isolaten (n = 484) gecontroleerd in die studie is beschikbaar via het aanvullende materiaal (tabellen S1 en S2) door middel van de volgende link: https://AEM.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files
3. Open in het deelvenster experiment type de vermelding VNTR en stel de minimum-en maximumwaarden voor elke VNTR-Locus in op respectievelijk 0 en 100. Stel onder algemene instellingenhet aantal decimale cijfers in op 0 en selecteer getallen onder gegevenstype. Controleer om afwezige waarden als nul te beschouwen.
4. Selecteer geïmporteerde monsters bestemd voor MST-clusteranalyse en klik op de knop nieuwe vergelijking maken (in vergelijkings venster).
   1. Indien gewenst voor de visuele presentatie van het MST, wijst u de monsters toe aan gekleurde groepen (bijvoorbeeld volgens een bepaalde metagegevenseigenschap) door gebruik te maken van de verschillende opties die beschikbaar zijn in het deelvenster groepen .
      Opmerking: Groepen kunnen ook achteraf worden gemaakt/gewijzigd, na de volgende stappen.
   2. Selecteer Geavanceerde clusteranalyse... en MST voor categorische gegevens om een MST-diagram te genereren op basis van de gekozen voorbeelden.
   3. De visuele presentatie van het MST naar voorkeur verder aanpassen (bijvoorbeeld door het toevoegen van partitioneringsparameters, het labelen van een knooppunt/filiaal, crosslinks, legenda's, enz.). Zie voorbeeld in Figuur 3.
      Opmerking: Een cluster (clonal complex) partitioneringsdrempel van ≤ 4/10 niet-identieke VNTR loci, naast het verbergen van vertakkings verbindingen die > 5/10 niet-identieke VNTR loci vertegenwoordigen, eerder is gebruikt voor MST-clusteranalyse op basis van MLVA-gegevens die zijn gegenereerd met dit protocol¹⁴. Mits de bovengenoemde gegevensset van 484 Y. ruckeri mlva profielen werd geïmporteerd, kunnen deze monsters ook worden opgenomen voor MST clusteranalyse (zoals hierboven beschreven) om een globale en historische context te bieden. Dit zal bijvoorbeeld de identificatie vergemakkelijken van alle monsters die zijn aangesloten bij eerder beschreven van klonen-complexen, evenals die welke nog niet-beschreven kilometerstanden vertegenwoordigen. Afhankelijk van de beschikbare metagegevens kan het resulterende MST-diagram op verschillende manieren worden gecontroleerd, bijvoorbeeld om de uiteindelijke clustering patronen te ontdekken die zijn gekoppeld aan bepaalde eigenschappen (geografie, host, tijd enz.).
   4. Exporteer indien nodig de gefinaliseerde MST in de gewenste indeling met de optie afbeelding exporteren .

Results

Volgens multiplex PCR zoals hier beschreven, wordt in Figuur 1een typisch ge-beeld van de aanwezigheid van meerdere amplicons van elke PCR-reactie weergegeven. Downstream CE-fragment analyse uitgevoerd op geverifieerde PCR-producten zal, voor elke Y. ruckeri isolaat onderzocht, resulteren in twee elektroferogram bestanden die worden gebruikt voor het aanroepen van de grootte van de respectieve VNTR loci (Figuur 2). Uit analyse van 484 diverse Y. ruckeri isolaten, geen overlap in ampliconlengte voor temp groottebereik werd waargenomen tussen VNTR loci geëtiketteerd met dezelfde kleurstof in dezelfde multiplex reactie (tabel 1)¹⁴. Elk van de electrophoretische pieken kan daarom ondubbelzinnig worden geïdentificeerd door kleur.

Na invoer van MLVA-profielen en relevante metagegevens in de voorkeurs software, kunnen MST-diagrammen worden geconstrueerd zoals beschreven voor de toetsing van epidemiologische patronen van belang in het materiaal. Raadpleeg de juiste handleidingen voor aanvullende opties die beschikbaar zijn in de respectieve software. Als voorbeeld toont Figuur 3 vergelijking met MST van mlva profielen voor Y. ruckeri isolaten hersteld van vis in verband met vijf verschillende zalmkwekerijen in Noorwegen.

De consistente herhalings grootten van de ten VNTR loci, evenals hun in vitro en in vivo stabiliteit, zijn eerder geverifieerd in de oorspronkelijke studie op basis van dit protocol¹⁴. Kort, dit werd gedaan met behulp van Sanger sequencing (REPEAT grootte), en door MLVA het typen van meerdere isolaten volgende seriële passages (in vitro) en van binnen individuele ziekte uitbraken (in vivo). Bovendien werd de milieu stabiliteit van de loci na verloop van tijd onderzocht door meerdere ' huis stam ' isolaten te typen die gedurende meerdere jaren zijn teruggewonnen uit aanhoudend besmette zoet waterproductie locaties voor Atlantische zalm.

Figuur 1 : Gel elektroforese die de aanwezigheid van meerdere PCR-producten verifieert. De afbeelding bevestigt de aanwezigheid van meerdere PCR-amplicons in alle 12-Lanes die samples bevatten, met de eerste rijstrook die de gebruikte DNA-ladder weergeeft. De afmetingen van geselecteerde ladder fragmenten zijn aangegeven, evenals de PCR-test en de stam (zie tabel S1 in Gulla et al. 2018¹⁴) van elke rijstrook. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2 : Electropherogrammen tonen pieken overeenkomend met VNTR amplicons. Namen van de verschillende VNTR loci zijn aangegeven, met kleurstof etiketten (VIC = groen; NED = zwart; 6FAM = blauw) tussen haakjes. De twee electropherogrammen (PCR-assay 1 Top; PCR-assay 2 onder) zijn afkomstig van het typen van een enkele Y. ruckeri -isolaat. Oranje pieken (kleurstof LIZ) vertegenwoordigen de grootte standaard gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3 : Voorbeeld minimale spanning boom voor epidemiologische evaluatie. Het diagram is gebaseerd op MLVA profielen van Y. ruckeri isolaten teruggewonnen uit Atlantische zalm in vijf verschillende Noorse boerderijen (1-5; Zie legende) ervaren recidiverende yerisniose uitbraken. Er kan een duidelijke clustering tendens in verband met de oorsprong van de boerderij worden waargenomen. Kruis links tonen alle mogelijke verbindingen met ≤ 1/10 niet-identieke VNTR loci (Zie legenda). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4 : Electropherogram visualiseert haperingen en gespleten pieken. In dit geval worden beide gelijktijdig uitgevoerd, wat niet altijd het geval is. De langere en hogere piek, die de YR1070 VNTR Locus vertegenwoordigt, kan gemakkelijk worden onderscheiden. Het display wordt vergroot en toont alleen blauwe kleurstof pieken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Tabel 1: kenmerken van VNTR Locus. Relevante kenmerken van de ten Y. ruckeri VNTR regio's die zijn gericht op het huidige mlva-protocol.

Discussion

Beide multiplex PCRs gepresenteerd hier zijn relatief robuust verschenen in het gezicht van slechte template DNA-kwaliteit, maar een gebrek aan PCR-versterking werd toch af en toe waargenomen bij het gebruik van sjablonen met extreem hoge DNA-concentraties. Deze problemen werden gemakkelijk opgelost door de templates vóór PCR te verdunen. Andere methoden voor DNA-extractie dan degene die hier werkzaam zijn, kunnen ook worden gebruikt (bijv. commerciële Kits).

Hoewel vijf amplicons worden verwacht van elke multiplex-PCR-reactie, moeten vijf visueel te onderscheiden banden niet altijd van GE worden verwacht, omdat sommige (verschillend gelabelde) VNTR loci binnen dezelfde reactie overlappende grootte bereiken hebben. De uiteindelijke PCR-Verleng tijd van 60 min kan indien nodig worden verkort, maar zal waarschijnlijk resulteren in het toegenomen optreden van gespleten pieken in daaropvolgende CE-elektroforgrammen (zie hieronder). Met name omdat het doel van de GE-stap puur voor kwalitatieve verificatie van PCR-amplicons is, kan de uitvoeringstijd, het voltage en/of het gelrecept als voorkeur worden aangepast. Indien GE in het bijzonder zwakke banden opmerkt, kan het raadzaam zijn de verdunningsfactor van die monsters vóór de CE te verlagen.

Hoewel het hier beschreven CE-protocol werd uitgevoerd op een specifiek commercieel capillair elektroforeseapparaat (Zie tabel van de materialen), kunnen verschillende CE-systemen verschillende monster vereisten hebben, wat op zijn beurt een aantal wijzigingen aan het protocol kan . Raadpleeg de handleiding van de betreffende CE-systeemfabrikant voor instructies over geschikte reagentia/apparatuur, kalibratie etc. voor fragment analyse. Er is ook een mogelijkheid dat de vooringenomen ampliconlengte voor temp mobiliteitspatronen die tijdens de CE-markering zijn waargenomen, relatief kunnen verschillen tussen de CE-systemen en/of machines, zoals eerder is gedocumenteerd voor andere mlva-protocollen^15,16. Als de uiteindelijke (afgeronde) VNTR-herhalings aantallen zich voordoen in een mate waarin dit wordt beïnvloed, betekent dit dat de Locus-specifieke variabelen s en i (tabel 1), die worden gebruikt om het aantal herhalingen van VNTR te bepalen, opnieuw moeten worden gekalibreerd. Dit betreft een lineaire regressie op percelen met een vergelijking van nauwkeurige sequentie groottes versus CE-grootte aanroepen, zoals beschreven door Gulla et al. 2018¹⁴.

Split pieken en stotter pieken, beide bekende artefacten in CE gebaseerd MLVA typing¹⁷, kan worden waargenomen in electropherogrammen tijdens het aanroepen van de grootte (Figuur 4). Hoewel haperingen pieken moeten worden genegeerd, moet de langere piek consistent worden geselecteerd voor downstreamtoepassingen in het geval van gesplitste pieken gescheiden door een enkel basis paar. Bovendien zijn afwezige pieken die duiden op een gebrek aan specifieke VNTR loci zeldzaam, maar kunnen zich voordoen, in welk geval een herhalings telling van ' 0 ' moet worden toegewezen. Als de start cultuur waaruit DNA wordt geëxtraheerd niet zuiver is (d.w.z. meer dan één Y. ruckeri -subtype bevat), kunnen meerdere hoge pieken die overeenkomen met verschillende allelen van dezelfde Locus/loci worden waargenomen na de CE. Secundaire cultivaties moeten dan worden uitgevoerd van enkele kolonies voorafgaand aan nieuwe DNA-extractie voor opnieuw typen.

Zoals vermeld in het Protocol, moet template DNA voor PCR standaard worden geëxtraheerd uit zuivere culturen van Y. ruckeri. In enkele gevallen, echter, eieren-vloeistofmonsters testen positief voor Y. ruckeri door qPCR (CT-waarden < 27) werden met succes mlva direct getypt, zonder voorafgaande kweek, met behulp van een verhoogde hoeveelheid GENOMISCH DNA (geëxtraheerd met commerciële Kit) als sjabloon. Hoewel deze aanpak niet uitgebreid is getest en niet is geverifieerd, geeft dit wel het potentieel van deze MLVA-test aan voor onderzoek van complexe biologische matrices die DNA uit een reeks verschillende organismen bevatten, naast Y. ruckeri.

De gehele MLVA-type procedure die hier wordt gepresenteerd, van DNA-extractie tot epizootiologische evaluatie, kan in één werkdag worden voltooid. Het aantal onderzochte monsters is echter in een sublineaire relatie met de tijd die nodig is voor DNA-extractie, PCR en CE, en de methode is daarom veel meer tijd efficiënt bij het gelijktijdig uitvoeren van meerdere monsters. Dit is niettemin het geval voor de meeste Lab-gebaseerde methoden, en als een instrument voor epidemiologische ondertypen van Y. ruckeri, de combinatie van hoge resolutie, eenvoud en draagbaarheid maakt deze mlva assay superieur aan eerder gepubliceerde protocollen^{4 ,5}. Het is ook gebruikt om te controleren of de beperkte epidemiologische relevantie van Y. ruckeri sero typing¹⁴.

Door middel van een uitgebreid MLVA-gebaseerd bevolkingsonderzoek met 484 Y. ruckeri isolaten teruggewonnen uit een reeks spatiotemporele oorsprong en habitats (gastheer vis, milieu, enz.), ons begrip met betrekking tot de epizoötiologie en de populatie structuur van dit belangrijke vispathogeen werd aanzienlijk verhoogd¹⁴. MLVA typing kon de tracering van klonen gedissemineerde in tientallen jaren, vermoedelijk door het vervoer van vis, evenals de identificatie van lokaal gesloten stammen. Bovendien, terwijl sommige klonale complexen van de bacterie duidelijk zou kunnen worden geassocieerd met ziekte in het bijzonder vissen gastheren (regenboogforel en Atlantische zalm, respectievelijk), anderen werden alleen teruggewonnen uit milieubronnen en/of klinisch onaangetast vis Specimens. De toepasselijkheid van de methode is dus niet alleen beperkt tot het opsporen van infecties, omdat zij ook informatie kan verschaffen over mogelijke relevantie, bijvoorbeeld voor de ontwikkeling van vaccins, de risicobeoordeling en het onderhoud van de nationale bioveiligheid. Het is momenteel actief in gebruik bij het Noorse veterinaire Instituut als een instrument voor het onderzoeken van Y. ruckeri diagnoses in de Noorse aquacultuur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
22°C/15°C incubator	As preferred.	NA
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry	Thermo Fisher Scientific	450007	Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.
Agarose, universal, peqGOLD	VWR	732-2789P/732-2788	Used during gel electrophoresis.
Avant 3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	A30469	Used for capillary electrophoresis fragment analysis.
BioNumerics7 modules	Applied Maths	NA	Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data.
Centrifuge(s)	As preferred.	NA
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry	Thermo Fisher Scientific	A15612	Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611	Loading dye used during gel electrophoresis.
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Centrifuge tubes used during DNA extraction.
Freezer	As preferred.	NA
Fume cupboard	As preferred.	NA
Gel electrophoresis system	As preferred.	NA
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water	Biotium	41003	Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis.
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis.
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use	Thermo Fisher Scientific	SM0373	DNA ladder used during gel electrophoresis.
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Size standard used during capillary electrophoresis.
Heating block	As preferred.	NA
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts.
Milli-Q water	NA	NA	Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house.
Multiplex PCR Plus Kit	Qiagen	206151/206152
PCR thermal cycler	As preferred.	NA
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Separation matrix used during capillary electrophoresis.
Pure culture Yersinia ruckeri	NA	NA	E.g. cryopreserved or fresh.
RNase-free water	Qiagen	NA	In: Multiplex PCR Plus Kit
Tris-borate-EDTA (TBE)  buffer	NA	NA	Standard recipe; produced in-house.
Trypsine soy agar/bovine blood agar	NA	NA	Standard recipe; produced in-house.
UV-based gel imaging/visualisation system	As preferred.	NA
Vortexer	As preferred.	NA