Method Article

Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

DOI:

10.3791/59461

⸱

April 23rd, 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de functionele synaptic multipliciteit geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het centrale zenuwstelsel, een paar van neuronen vaak vormen meerdere synaptic contacten en/of functionele neurotransmitter release sites (synaptic multipliciteit). Synaptic multipliciteit is plastic en veranderingen in de gehele ontwikkeling en in de verschillende fysiologische omstandigheden, wordt een belangrijke determinant voor de werkzaamheid van synaptische transmissie. We schetsen hier, experimenten voor het inschatten van de mate van multipliciteit van synapsen eindigt op een bepaalde postsynaptisch neuron geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten. Specifiek, wordt spanning-clamp opname gebruikt voor het vergelijken van het verschil tussen de amplitude van spontane excitatory postsynaptisch stromingen (sEPSCs) en miniatuur excitatory postsynaptisch stromingen (mEPSCs). De theorie achter deze methode is dat afferent "inputs" die veelheid vertonen grote, actiepotentiaal-afhankelijke sEPSCs als gevolg van de synchrone release die bij elke synaptic contactpersoon optreedt zal tonen. Daarentegen zal de actiepotentiaal-zelfstandige release (die asynchroon is) kleinere amplitude mEPSCs genereren. Dit artikel schetst een aantal experimenten en analyses te karakteriseren van het bestaan van synaptic multipliciteit en bespreekt de vereisten en beperkingen van de techniek. Deze techniek kan worden toegepast om te onderzoeken hoe verschillende gedrags-, farmacologische of milieu interventies in vivo invloed op de organisatie van synaptic contactpersonen in verschillende hersengebieden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synaptische transmissie is een fundamenteel mechanisme voor de communicatie tussen de neuronen, en vandaar, hersenfunctie. Synaptische transmissie is ook labiele en haar werkzaamheid in een activiteit-afhankelijke manier zo goed zoals in reactie op f signalen1kunt wijzigen. Behandeling van synaptische functie is dus een belangrijke focus van het onderzoek neurowetenschap. Geheel-cel patch klem electrofysiologie is een veelzijdige techniek waarmee ons te begrijpen, bedenken experimentele designs en data-analyses, diepgaande biofysische en moleculaire mechanismen van synaptische transmissie. Een veel gebruikte aanpak, misschien vanwege de eenvoud....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven worden goedgekeurd door het Comité Animal Care van de University of Western Ontario overeenkomstig de Canadese Raad op Animal Care Guidelines (AUP #2014-031).

1. oplossingen

  1. Snijden van oplossing
    1. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de segmenteringshulplijnen oplossing.
    2. Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
    3. Voor 1 x segmenteringshulplijnen oplossing, los van de NaHCO3, glucose en sacharose in ddH2O, en voeg de voorraad van 20 x. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 315-320 mOsm e....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bovenstaande protocol beschrijft een methode voor het gebruik van geheel-cel patch klem electrofysiologie te onderzoeken van de mate van synaptic multipliciteit, met behulp van de muis hypothalame neuronen als voorbeeld. Dit segment voorbereiding techniek moet opleveren gezonde levensvatbare cellen die geen een gezwollen membraan of de nucleus (Figuur 1). Elke stap in het protocol is belangrijk voor de gezondheid van het weefsel en de kwaliteit van de opnamen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een belangrijke voorwaarde voor een succesvolle patch klem electrofysiologie experiment is het verkrijgen van gezonde segmenten/cellen. Ons beschreven protocol is geoptimaliseerd voor hypothalame segmenten die PVN neuronen bevatten. Andere hersenen gebieden mogelijk bewerkt oplossingen en snijden methoden21,22,23,24. Voor de opname, het is van cruciaal belang alleen te aanvaarden stabiele opnam.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.S. ontving Ontario Graduate beurs. Wi ontving een nieuwe detective Fellowship van geestelijke gezondheidsonderzoek Canada. Dit werk wordt ondersteund door de exploitatiesubsidies aan W.I van de natuurwetenschappen, Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) en de Canadian Institute voor gezondheidsonderzoek (PJT 148707).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309659
10 bladeFisher Scientific/others35698
22 bladeVWR/others21909-626
22 μM syringe filtersMilipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
Angled sharp scissorsHarvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
Double edge bladeVWR74-0002
Filter paperSigma/others1001090
Fine paintbrushFisher/various15-183-35/various
Gas Dispersion TubeVWRLG-8680-120
IsofluraneFresenius Kabi/othersM60303
Krazy gluevariousvarious
Mini analysisSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor IncModel 5600
ParafilmSigmaPM-996
Pasteur pipetteVWR14672-200
ph meterMettler ToledoFE20-ATC
Rubber bulbVWR82024-550
Scalpel handle No. 3Harvard Instruments72-8350
Scalpel handle No. 4Harvard Instruments72-8356
Single edge bladeVWR55411-050
Vibratome slicerLeicaVT1200S
Water Purification SystemMilliporeMilli-Q Academic A10
Well plate lidFisher/various07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-APSigma275875
BAPTAmolecular probesB1204
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
glucoseSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-gluconateSigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
Molecular biology grade waterSigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-gluconateSigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
PicrotoxinsigmaP1675
SrClSigma255521
sucroseBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

Related Articles