Methodenartikel

VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

DOI:

10.3791/59463

⸱

11 mei 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we VirWaTest, wat een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode is voor de concentratie en detectie van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virussen die door mensen en dieren worden uitgescheiden, kunnen waterbronnen besmetten en een risico vormen voor de menselijke gezondheid wanneer dit water wordt gebruikt voor het drinken, voedsel irrigatie, wassen, enz. De klassieke fecale bacterie indicator controleert niet altijd op de aanwezigheid van virale pathogenen, dus de opsporing van virale pathogenen en virale indicatoren is relevant om maatregelen van risicobeperking vast te stellen, met name in humanitaire scenario's en in gebieden waar door water overgedragen virale uitbraken frequent zijn.

Op dit moment zijn er verschillende commerciële tests beschikbaar die de kwantificering van fecale indicator bacteriën (FIB) mogelijk maken om te testen op het punt van gebruik. Dergelijke commerciële tests zijn echter niet beschikbaar voor de opsporing van virussen. Voor de opsporing van virussen in milieuwater monsters moet een aantal liters in kleinere volumes worden geconcentreerd. Bovendien vertrouwt de opsporing van virussen eenmaal geconcentreerd op methoden zoals nucleïnezuur extractie en moleculaire detectie (bijv. polymerase-kettingreactie [PCR]-gebaseerde assays) van de virale Genomes.

De hier beschreven methode maakt de concentratie van virussen uit 10 L watermonsters, evenals de extractie van virale nucleïnezuren op het punt van gebruik, met eenvoudige en draagbare apparatuur. Dit maakt het testen van watermonsters op het punt van gebruik voor verschillende virussen mogelijk en is nuttig in humanitaire scenario's, evenals in elke context waarin een uitgerust laboratorium niet beschikbaar is. Als alternatief kan de methode het concentreren van virussen aanwezig zijn in watermonsters en de verzending van het concentraat naar een laboratorium bij kamertemperatuur voor verdere analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de eerste fasen van humanitaire noodsituaties zijn de toegang tot schoon water, sanitaire voorzieningen en hygiëne van cruciaal belang voor het voortbestaan van de betrokkenen. Daarom is het bewaken van de waterkwaliteit een prioriteit om uitbraken van water te voorkomen. Het is bekend dat verontreinigd water vaak de oorsprong van ziekten is, maar het is vaak moeilijk om de bronnen van virale uitbraken zoals het hepatitis E-virus (HEV) te bepalen, zelfs met de beschikbaarheid van conventionele laboratoriummethoden. De controle van de waterkwaliteit is gebaseerd op de kwantificering van FIB1,2,3,4. Er is echter uitgebreid gedocumenteerd dat er geen correlatie is tussen de afwezigheid van FIB en de aanwezigheid van virale watergedragen pathogenen zoals Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) of HEV5,6. Het gebruik van de water kwaliteitscriteria op basis van FIB kan dus leiden tot een onderschatting van de Risico's die verbonden zijn aan de aanwezigheid van watergedragen virale pathogenen. De surveillance van indicator virussen, zoals humane adenovirussen (hadv), of specifieke pathogenen zou nuttig zijn bij het bepalen van de blootstelling aan virale pathogenen en het identificeren van de potentiële bron van menselijke infectie7,8, 9,10 en bij de validering van de werkzaamheid van sanitaire maatregelen11.

Tot nu toe waren de opsporing van virussen in deze scenario's gebaseerd op vakkundig personeel en complexe logistiek. VirWaTest (virwatest.org) is gericht op de ontwikkeling van een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode voor de concentratie en de daaropvolgende opsporing van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.

De virusconcentratie is gebaseerd op het principe van biologische flocculatie van 10 L watermonsters, waardoor virussen worden teruggewonnen in kleinere volumes12,13. De vlokken worden verzameld en toegevoegd aan een buffer die de virussen lyseert en voorkomt de nucleïnezuren van afbraak wanneer ze bewaard bij kamertemperatuur gedurende niet meer dan 2 weken.

De nucleïnezuur extractiemethode is gebaseerd op het gebruik van magnetische deeltjes waaraan de nucleïnezuren worden geadsorreven. Ze kunnen worden overgebracht van de ene spoel buffer naar de andere en uiteindelijk in de elutie buffer met behulp van een magnetische pipet waaraan de deeltjes hechten. Viraal nucleïnezuur suspensies verkregen kunnen worden verzonden naar een referentielaboratorium waar de detectie kan worden uitgevoerd met behulp van moleculaire methoden op basis van PCR. Voor elke extractie van nucleïnezuur worden twee verschillende hoeveelheden getest om enzymatische remming uit te voeren, ontstaan door het monster. Als alternatief, met minimale beschikbaarheid van apparatuur, kunnen PCR-tests worden uitgevoerd op het punt van gebruik. Het gehele proces is ontworpen om onafhankelijk van een stroomtoevoer te worden uitgevoerd (Figuur 1).

Een kwantitatieve PCR-test voor het opsporen van HAdV, uitgescheiden door de mens en gevonden in afvalwater monsters in hoge concentraties, is aangepast om te worden uitgevoerd op het punt van gebruik. HAdV worden gebruikt als menselijke fecale virale indicatoren. Een PCR voor de kwantificering van ms2 bacteriofaag is ook aangepast sinds ms2 wordt gebruikt in virwatest als procesbeheersing. De methode kan worden aangepast voor de opsporing van een virus van belang.

Na de ontwikkeling, de VirWaTest methode is toegepast door de gebruikers in twee verschillende instellingen in de Republiek van Centraal-Afrika (RCA) en Ecuador, het verstrekken van feedback over de toepassing van het protocol in reële situaties.

Voor onze kennis is dit de eerste procedure die de concentratie en opsporing van virussen op het punt van gebruik mogelijk maakt, onafhankelijk van elke voeding, grote apparatuur en Vries-/koelingcondities. Het wordt aanbevolen om twee replicaten van elk watermonster te verzamelen om robuuste resultaten te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding en verpakking

Opmerking: de te verpakken materialen/apparatuur staat in tabel 1. Gebruik handschoenen om de reagentia te hanteren die nodig zijn voor de procesbeheersing, de concentratie reagentia, de nucleïnezuurextractie reagentia en de detectie reagentia. Draag een beschermende bril om de reagentia te hanteren die nodig zijn voor de extractie van nucleïnezuur.

  1. Procescontrole
    1. Bereid ms2 bacteriofaag Stock Culture (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) met 1 x 1010 Pfu/ml in het laboratorium volgens de ISO-procedure 10705-1:199514.
    2. Vervolgens, aliquot 10 μL van de suspensie per buis met 1 x 108 Pfu in 10 ml buisjes en laat het water verdampen bij 37 °c. Gebruik één buis per watermonster.
    3. Bereid bovendien één buisje met 10 mL steriel gedestilleerd water per verzameld monster.
  2. Concentratie reagentia
    1. Gebruik voor de preflocated magere melkoplossing (PSM) de volgende bedragen om 5 10 L watermonsters te concentreren.
      1. Maak een plastic buisje met 5 g magere melk.
      2. Maak een rits plastic zak met 16,66 g zeezouten.
      3. Maak een plastic flesje met 500 mL gedistilleerd water.
    2. Bereid de reagentia die nodig zijn voor de pH-aanpassing. Gebruik de volgende bedragen om de pH van de PSM en van 5 10 L watermonsters aan te passen.
      1. Voeg 5 g citroenzuur 1-hydraat toe aan een plastic buisje van 10 mL.
        Let op: citroenzuur veroorzaakt ernstige irritatie wanneer het in aanraking komt met de ogen. Als dit gebeurt, spoel het oog voorzichtig met water gedurende enkele minuten. Als de irritatie aanhoudt, een arts raadplegen.
      2. Zet 2 g natriumhydroxide in een plastic buisje van 10 mL.
        Let op: natriumhydroxide kan ernstige brandwonden en oogbeschadigingen veroorzaken. Na inslikken de mond spoelen. Geen braken opwekken. Als het in aanraking komt met de ogen, voorzichtig afspoelen met water gedurende enkele minuten. Vervolgens, deskundig medisch advies inwinnen.
      3. Breng 25 mL steriel gedestilleerd water in een plastic bakje.
      4. Plaats 50 mL steriel gedestilleerd water in een plastic bakje.
    3. Bereid het monster conditionerings zakje dat wordt gebruikt voor de flocculatie, de conserverings oplossing die wordt gebruikt om de nucleïnezuren te behouden en het neutraliserende sachet om het afgedankte water en de materialen te neutraliseren. Gebruik de volgende bedragen voor elk 10 L-watermonster dat moet worden getest.
      1. Zet 15 g zeezouten en 8 g citroenzuur 1-hydraat in een rits plastic zakje voor het conditionerings zakje.
      2. Voeg 2 mL lysisbuffer (tabel met materialen) en 0,3 ml nucleïnezuur conserveringsmiddel (Inhoudsopgave) toe aan een buisje van 5 ml.
        Let op: lysisbuffer bevat guanidine thiocyanaat en Triton X-100. Contact met zuur bevilt giftig gas, en het is schadelijk bij inslikken, geïnhaleerd of in aanraking komt met de huid. Na inslikken de mond spoelen. Geen braken opwekken. Als het in aanraking komt met de huid, wassen met veel water. Vervolgens, deskundig medisch advies inwinnen. Het conserveringsmiddel voor nucleïnezuur veroorzaakt huid-en oogirritatie en is schadelijk bij inslikken. Als het in aanraking komt met de huid of de ogen, spoelen met overvloedig water gedurende enkele minuten. In ieder geval, vooral bij inslikken en zich onwel voelen, deskundig medisch advies inwinnen.
      3. Zet 40 g wasmiddel poeder in vier rits plastic zakken.
        Let op: poeder reinigingsmiddel veroorzaakt oogirritatie. Als het in aanraking komt met de ogen, spoelen met overvloedig water gedurende enkele minuten. Als de irritatie aanhoudt of bij inslikken, een arts raadplegen.
  3. Reagentia voor nucleïnezuur extractie
    1. Plaats 50 μL magnetische deeltjes (tabel met materialen) en 1 ml ethanol 96% in een buisje van 5 ml die de bindende buffer vormen.
      Let op: de magnetische deeltjes buffer bevat natrium azide, die een giftig gas vormt wanneer het in contact komt met zuren of zware metalen ionen en giftig is bij inname of wanneer het in aanraking komt met de huid. Indien ingenomen of in aanraking met de huid, spoel de mond of de huid met overvloedig water en deskundig medisch advies inwinnen. Ethanol is een licht ontvlambare vloeistof en damp en veroorzaakt ernstige oogirritatie. Verwijderd houden van hitte, hete oppervlakken, vonken en andere ontstekingsbronnen. Als het in aanraking komt met de huid of de ogen, spoel dan af met overvloedig water. In geval van inname van grote hoeveelheden water en/of bij inademing, ga naar buiten in de frisse lucht. In ieder geval, deskundig medisch advies inwinnen.
    2. Voeg respectievelijk 500 μL, 600 μL en 200 μL wasbuffers 1, 2 en 3 (tabel met materialen) toe aan drie buisjes van 2 ml.
      Let op: wasbuffers bevatten teruggehydrolyseerd thiocyanaat en teruggehydrolyseerd chloride, die schadelijk zijn bij inademing of inslikken en de huid en ogen irriteren. Contact met zuren vrijkomen zeer giftig gas. Als ze in aanraking komen met de huid of ogen, spoel dan af met overvloedig water. Na inslikken de mond met overvloedig water afspoelen. Geen braken opwekken. Altijd deskundig medisch advies inwinnen.
    3. Voeg 120 μL elutie buffer (tabel met materialen) toe aan een buis van 0,5 ml.
  4. Reagentia voor HAdV en MS2 detectie
    Opmerking: twee verschillende nucleïnezuurextractie reacties kunnen gelijktijdig in elke PCR-test worden geanalyseerd als een 8-well Thermocycler wordt gebruikt. Voor alle PCR-assays, bereid moleculaire biologie water aligeciteerd in 1,5 mL buizen.
    1. HAdV-detectie
      1. Bereid een mengsel met 10 μL 22,5 μM AdF voorwaarts primer, 10 μL van 22,5 μM AdR reverse primer en 5 μL 11,25 μM AdP-sonde (tabel 2).
      2. Voeg 2,5 μL van de mix toe aan buizen 1 tot en met 8 van een buis strook. Laat het drogen bij kamertemperatuur, sluit de buizen en houd ze beschermd tegen het licht.
      3. Snijd de strook die het verdeelt in twee strips: buizen 1-5 en buizen 6-8.
      4. Bereid een seriële verdunning van DNA-suspensies die de nucleotide-sequentie van de versterkte HAdV-regio bevatten. Lucht drogen 1 μL suspensies met 1 x 105, 1 x 107en 1 x 109 GC/ml in buizen 6-8.
        Opmerking: Houd de buizen met de primers, sonde en de Luchtgedroogde suspensies beschermd tegen licht.
    2. MS2-detectie
      1. Bereid een mengsel met 10 μL 25 μM pecson-2F voorwaartse primer, 10 μL 25 μM pecson-2R omgekeerde primer en 2,5 μL 25 μM PecP-2 sonde (tabel 2).
      2. Voeg 2,25 μL van de mix toe aan buizen 1 tot en met 8 van een buis strook. Laat het drogen bij kamertemperatuur, sluit de buizen en houd ze beschermd tegen het licht.
      3. Snijd de strook die het verdeelt in twee strips: buizen 1-5 en buizen 6-8.
      4. Ga verder zoals in stap 1.4.1.4 maar gebruik een standaard suspensie ontworpen voor MS2 in plaats daarvan.

2. virale concentratie

Opmerking: gebruik handschoenen te allen tijde tijdens de monsterverzameling, reagens voorbereiding, flocculatie, vlokken-inzameling en afvalverwijderings procedures. Draag een beschermende bril tijdens de reagens bereidings procedure.

  1. Monsterverzameling
    1. Verzamel een watermonster van 10 L in een vlakke bodem emmer met deksel. Verzamel voor elk monster minimaal twee replicaten.
      Opmerking: het is belangrijk om duidelijke emmers te gebruiken om de pellet te visualiseren. Als het watermonster gesuspendeerd materiaal bevat (bijv. zand, algen), laat het dan sediment en verzamel vervolgens het water supernatant in een nieuwe emmer.
    2. Registreer het verzamelde volume, evenals de locatie en de afhaaldatum, voor elk watermonster.
    3. Zet een magneetroerder aangesloten op een batterij onder een emmer ondersteuning en plaats de emmer met het watermonster op zijn steun.
      Let op: Zoek een vlakke ondergrond op een frisse plek en bewaar de emmers met de watermonsters van direct zonlicht.
  2. Bereiding van reagentia
    1. pH-aanpassing reagentia
      1. Giet het citroenzuur poeder en de natriumhydroxide pellets in de potten met respectievelijk 25 en 50 mL gedistilleerd water.
      2. Schud voorzichtig met de hand totdat het citroenzuur en het natriumhydroxide volledig zijn opgelost.
        Let op: giet het water niet over de natriumhydroxide pellets. Giet in plaats daarvan de natriumhydroxide pellets over het water.
    2. Preflocated magere melk
      1. Plaats een opbergtas op een magneetroerder en giet er 500 mL gedistilleerd water in. Laat een roer magneet in de zak vallen en zet de magneetroerder aan.
      2. Giet de inhoud van een zeezout zakje en een magere melk buis in de opbergtas en roer gedurende 5 minuten op middelhoog toerental om ze op te lossen.
      3. Voeg 3 mL citroenzuur toe aan de PSM-oplossing met behulp van een Pasteur-pipet om ervoor te zorgen dat de pH tussen 3,4 en 3,6 ligt. Meet de pH van de PSM-oplossing met behulp van pH-indicator stroken. Voeg kleinere hoeveelheden citroenzuur en natriumhydroxide toe naarmate de pH dichter bij 3,5 komt.
      4. Schakel de magnetische roerder uit en zorg ervoor dat de vlokken zichtbaar zijn. Gebruik een zaklamp om de flocs te visualiseren.
  3. Flocculatie
    1. Laat een roer magneet in het watervallen, stel de magnetische roerder op de maximumsnelheid in en zet hem aan. Zorg ervoor dat de roer magneet begint te draaien.
    2. Voeg 10 mL gedistilleerd water toe aan een procescontrole buis. Inverteer de buis een paar keer om de virale voorraad te hydrateren en giet de oplossing in het water.
    3. Giet de inhoud van één monster conditionerings zakje in het water en roer gedurende 5 min.
    4. Meet de pH van het watermonster met behulp van pH-indicator stroken. Voeg enkele druppels citroenzuur of natriumhydroxide toe aan het watermonster om ervoor te zorgen dat de pH tussen 3,4 en 3,6 ligt. Voeg kleinere hoeveelheden citroenzuur en natriumhydroxide toe naarmate de pH dichter bij 3,5 komt.
    5. Voeg 100 mL van de PSM-oplossing toe met een 100 mL verpakking.
    6. Sluit de emmer met het deksel, zet de magnetische roerder op minimale snelheid, en laat het water roeren voor 8 uur.
    7. Schakel de magnetische roerder uit en laat het water nog minstens 5 uur staan om de vlokken te laten vestigen.
  4. Floc collectie
    1. Bouw een sifoning-systeem bestaande uit een pipet controller, twee pipetten en een plastic buis om het water supernatant te zuigen voor het ontladen van het water op de flocs.
      1. Bevestig een 10 mL tape-end pipet aan de pipet controller. Bevestig de pipetpunt vervolgens aan de plastic buis.
      2. Verwijder het filter van een 10 mL pipet met open punt met een pincet en bevestig de pipet aan de plastic buis.
    2. Plaats een lege emmer op de vloer.
    3. Dompel de punt van de pipet met open punt onder in het water. Zorg ervoor dat u het dicht bij het wateroppervlak houdt om te voorkomen dat de flocs worden verstoord. Zuig het water supernatant tot het de tape-end pipet bereikt.
    4. Knijp de plastic buis aan het uiteinde vast op de pipet met de tape en maak deze los van de pipet.
    5. Plaats de buis in een lege emmer. Laat de druk op de buis los om het water in de lege emmer te laten stromen.
    6. Knijp de plastic buis om de waterstroom te stoppen wanneer het waterniveau op het moment is om de roer magneet te bereiken en beweeg de pipet weg van de emmer.
    7. Schud de emmer om de vlokken te hervatten en giet ze in een opstaande plastic zak van 500 ml. Laat de vlokken zich 1 uur meer vestigen.
    8. Zuig de water supernatant voorzichtig op met een pipet van 50 mL en een handmatige pipet controller, waarbij de flocs niet storend worden.
    9. Aspireren de vlokken met behulp van een 100 ml pipet en breng ze over naar een 50 ml gegradueerde centrifugebuis. Noteer het uiteindelijke volume van het monster concentraat en breng 1 mL ervan over in een buisje van 5 mL met de conserverings oplossing, met behulp van een Pasteur-pipet.
      Opmerking: het is belangrijk dat de centrifugebuis is afgestudeerd, zodat het uiteindelijke volume van het geconcentreerde monster zo nauwkeurig mogelijk en geregistreerd kan worden gemeten.
    10. Voer de nucleïnezuur extractie in het veld. U ook de conserverings oplossing met de virussen bewaren bij 20-30 °C gedurende maximaal 15 dagen of deze naar een referentielaboratorium verzenden voor verdere analyse.
  5. Afvalverwijdering en hergebruik van materiaal
    1. Voeg de inhoud van een neutraliserend middel zakje toe aan de emmer met het afgedankte water. Meng het water, en laat het nog 30 min.
    2. Gooi het behandelde water weg als algemeen afval.
    3. Plaats de pipetten en de plastic buis in de emmer. Vul de emmer met water en giet de inhoud van één neutraliserend middel zakje.
    4. Was ze minstens 30 minuten om ze te steriliseren en spoel ze met overvloedig schoon water om eventueel overgebleven neutraliserend middel te verwijderen.

3. nucleïnezuur extractie

Opmerking: gebruik handschoenen en draag altijd een beschermende bril tijdens de nucleïnezuur extractieprocedure.

  1. Magnetische pipet bewerking
    1. Raak vertrouwd met de werking van de magnetische pipet voordat u de extractie uitvoert.
  2. Nucleïnezuur extractie
    1. Verdeel de buisjes met de reagentia die nodig zijn voor de extractie in een rek van links naar rechts: bindings buffer, wasbuffers en elutie buffer. Stel het juiste aantal buisjes in volgens het aantal monsters of replicaten dat wordt geanalyseerd.
    2. Breng 1 mL monster concentraat over in de buis met de bindings buffer met behulp van een wegwerp Pasteur-pipet. Inverteer de buis 8x tot 10x om de oplossing te homogeniseren.
    3. Inbroed de oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur tijdens het continu mengen, hetzij met behulp van een op zonne-energie aangedreven orbitaal of handmatig.
    4. Verzamel de magnetische deeltjes met behulp van de magnetische pipet en een schone tip, die kan worden hergebruikt voor de drie wasbuffers.
    5. Laat de magnetische deeltjes in de buis met 500 μL wasbuffer 1. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.
    6. Breng de magnetische deeltjes over in de buis met 600 μL wasbuffer 2. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.
    7. Breng de magnetische deeltjes over in de buis met 200 μL wasbuffer 3. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.
    8. Laat de magnetische deeltjes in de buis met de elutie buffer los en gooi de punt weg.
    9. Inincuberen de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten tijdens het continu mengen, met behulp van de orbitale zonne-energie.
      Opmerking: het mengen van de magnetische deeltjes in de elutie buffer is een cruciale stap. In geval van gebrek aan een orbitaal, continu mengen met de hand tijdens de incubatietijd.
    10. Vervang de punt op de magnetische pipet door een nieuwe en verzamel de magnetische deeltjes uit de elutie buffer. Zorg ervoor dat u de magnetische deeltjes uit de elutie buffer volledig verwijdert, omdat ze de moleculaire detectiemethoden kunnen verstoren.
    11. Gooi de punt weg met de daaraan gehechte deeltjes. Ga verder met de PCR-analyse, verzend de elutie buffer naar een referentielaboratorium of bewaar de elutie buffer bij 4 °C voor verdere analyse.

4. virale detectie met een batterij-aangedreven acht-buis real-time Thermo cycler

Opmerking: gebruik handschoenen en draag altijd een beschermende bril tijdens de nucleïnezuur detectieprocedure. Vervang de handschoenen voor nieuwe bij het uitvoeren van een nieuw PCR-experiment om kruisbesmetting te voorkomen.

  1. HAdV kwantitatieve PCR
    1. Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 2, 4 en 5.
    2. Voeg 4 μL PCR-mix toe aan buizen 1-5.
    3. Voeg 14 μL nucleïnezuur extractie toe van Monster A tot buis 1 en 14 μL van monster B tot buis 3.
    4. Voeg 2 μL geëxtraheerde nucleïnezuren toe van Monster A tot buis 2 en 2 μL van monster B tot buis 4. Sluit de vijf-buis strip.
    5. Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buizen 6, 7 en 8.
    6. Voeg 4 μL van deze mix toe aan buizen 6, 7 en 8, en sluit ze.
    7. Plaats beide stroken in de thermocycler en selecteer de juiste uitvoering (tabel 3).
    8. Gooi de waterbuis weg en houd het geëxtraheerde nucleïnezuur in de vriezer, indien mogelijk, of, zo niet, op een verse plek beschermd tegen licht in het geval er een tweede test moet worden uitgevoerd.
    9. Reinig de micropipetten, het rek, het werk materiaal en alle materiaal goed met een nucleïnezuur reiniger en gooi de plastic zak met de gebruikte tip, handschoenen en buizen weg.
      Let op: nucleïnezuur Remover is een zeer licht ontvlambare vloeistof en stoom. Adem de spray nevel niet in en Vermijd contact van de vloeistof met de ogen of de huid. Anders onmiddellijk spoelen met overvloedig water en deskundig medisch advies inwinnen.
    10. Verzamel de resultaten en analyseer de verkregen gegevens.
  2. MS2 kwantitatieve PCR
    1. Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 2, 4 en 5.
    2. Voeg 4 μL PCR-mix en 0,5 μL reverse transcriptase-enzym toe aan buizen 1-5.
    3. Voeg 14 μL nucleïnezuur extractie toe van Monster A tot buis 1 en 14 μL van monster B tot buis 3.
    4. Voeg 1 μL geëxtraheerde nucleïnezuren toe van Monster A tot buis 2 en 1 μL van monster B tot buis 4. Sluit de vijf-buis strip.
    5. Voeg 15,5 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 5, 6, 7 en 8 en sluit ze af.
    6. Voeg 4 μL PCR-mix en 0,5 μL reverse transcriptase-enzym toe aan de buisjes 6, 7 en 8.
    7. Plaats beide stroken in de thermocycler en selecteer de juiste uitvoering (tabel 3).
    8. Ga verder zoals beschreven in de stappen 4.1.8 naar 4.1.10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Methodeontwikkeling

Deze procedure is ontwikkeld in het laboratorium van virussen verontreinigingen van water en voedsel met de samenwerking van GenIUL en Oxfam Intermón. Het bestaat uit drie verschillende stappen. De eerste, de virale DEELTJESCONCENTRATIE, is een aanpassing van een mageremelkflocculatie methode die eerder werd beschreven12,17,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De VirWaTest methode maakt de concentratie van virussen en nucleïnezuur extractie van watermonsters op het punt van gebruik door niet-ervaren gebruikers. Het is een betaalbaar, snel en eenvoudig protocol. De concentratie is gebaseerd op het principe van organische flocculatie met behulp van magere melk, waarbij de lage pH-en hoge geleidbaarheids condities het gebruik van magere melkeiwitten in vlokken tot de virussen maken. Wanneer de vlokken sediment, het is gemakkelijk om ze te verzamelen, waardoor het mogelijk om te c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VirWaTest was een onderzoeksproject gefinancierd door het HIF (humanitair innovatiefonds) programma van ELHRA (het verbeteren van leren & onderzoek voor humanitaire hulp). De auteurs erkennen de WASTEAMS die vriendelijk in deze studie hebben samengewerkt. De analyse van samples in Ecuador werd gefinancierd door Oxfam Ecuador en Dirección de Recheran de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas is een Serra-Hunter Fellow aan de Universiteit van Barcelona.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001Bevat Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reacties
8-Microtube Strips with CapsdD Biolab840637Laag profiel, dunne wanden, Aangepast voor Kwantitatieve en Kwalitatieve PCR
Batteries and Power Adapters for Magnetic StirrerGenIUL900011674Inclusief 12V auto-voedingsadapter
Bucket SupportGenIUL900011648Aluminium ondersteuning
Bucket, 10 LCater4You10LTRPolypropilene, Tamperproof, Heldere kleur
Centrifuge Tube, 50 mLLabBoxCTSP-E50-050Polypropylene, Steriel, Gegradueerd, Met Rok
Citric Acid 1-Hydrate, 500 gPanReac AppliChem1410181211Zuiver, Farma Kwaliteit, 1 Kilogram
Clear PET BottleLabBoxFPET-500-088Heldere Kleur, PET, Dop Niet Inbegrepen
Difco Skim Milk, 500 gBecton Dickinson232100Gedehydrateerd
DNA/RNA Shield, 250 mLZymo ResearchR1100-250DNA/RNA Behoud Medium, 250 mL
Easy9 Pipette ControllerLabBoxEAS9-001-0010.3 μm filter, Pipetten van 0.1 tot 100 mL, Autoclaveerbare siliconen pipettenhouder
Eppendorf Tube, 0.5 mLEppendorf0030121023Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mLEppendorf0030120094Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mLdD Biolab999542Polypropyleen, Steriel, Gegradueerd
Ethanol 96% V/V, 1 LPanreac AppliChem361085-1611Voor UV, IR & HPLC
Laboratory TweezersLabBoxFORS-007-002Dun, Gebogen Uiteinde, L= 120 mm
Magnetic StirrerGenIUL900017000Batterijgevoed
MarkerdD Biolab929203Zwart, Extra Fijne Tip, Waterbestendig, Sneldrogend, Voor Plastic en Glaswerk
Micro Rota-Rack for MicrotubesdD Biolab377824 Modules, L x B x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR CyclerCoyote Biosciences, ChinaMini-8Portable, Werkt met 12V Voedingen of Externe Batterijen, Twee kanalen, Capaciteit voor 8 Buizen
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292Reagentia voor maximaal 48 Isolatie, Bewaar bij Omgevingstemperatuur
Open Tip Serological Pipette, 10 mLDeltalab900136NSteriele, Individueel Verpakt (Papier/Plastic)
PE Screw Cap PP28LabBoxTP28-004-020Voor PET Flessen
pH Indicator StripLabBoxWSPH-001-001Bereik pH 2.8 tot pH 4.4, 50 Strips per Pakket
Plastic Test TubeQuimikals300913Inclusief Dop
Polyethylene Pasteur PipetteLabBoxPIPP-003-500Gegradueerd, 7 mL Totaal Volume, Niet-Steriele
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mLDeltalab409726Schroefdop, Steriele, Gegradueerd tot 100 mL
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mLDeltalab409526GSchroefdop, Steriele, Gegradueerd tot 50 mL
Powder Powder Detergent--Reguliere Poederzeep voor het wassen van kleding
Power Cables for Magnetic StirrerGenIUL900011692Verbinding tussen batterijen en magnetische roerders
QuickPick Magnetic ToolBioNobile24001Handgereedschap voor magnetische deeltjes
QuickPick Tips in BoxBioNobile24296RNase-Vrij, Autoclaveerbaar, 96 Eenheden
QuickPick XL gDNA Magnetic ParticlesBioNobileSN511003.2 mL
Sea SaltsSigma-AldrichS9883-500GEen kunstmatige zoutmix die de samenstelling van de opgeloste zouten van oceaanwater nauw benadert
Silicone TubingLabBoxSILT-006-005Rol van 5 Meters, Binnen ø x Buiten ø= 6 x 10 mm
Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5%VWR Chemicals28244295Pellets, 1 Kg
Solar Rotary PlatformSOL-EXPERT Group70020Acrylaat Plaat, 10 RPM, Ondersteunt tot 300 Gram
SOLIScript 1-step Probe KitSolis BioDyne08-57-00250Bevat Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) en 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzym), 250 Reacties
SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction KitBioTools21.141-4197Inclusief BioTools's BAW Buffer (Was Buffer 1), BAV3 Buffer (Was Buffer 2 en 3) en BRE Buffer (Elutie Buffer).
SpinBar Octhaedral Stirring MagnetdD Biolab045926Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blauw
Tape-End Serological Pipette, 10 mLDeltalabPN10E1Steriele, Individueel Verpakt (Papier/Plastic)
Tape-End Serological Pipette, 50 mLDeltalab900043Steriele, Individueel Verpakt (Papier/Plastic)
Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid RemoverBioTools22001-4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
  3. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
  4. World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
  5. Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
  6. Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
  7. Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
  8. Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
  9. Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
  10. Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  11. Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
  12. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  13. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
  14. International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
  15. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
  16. Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
  17. Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
  18. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Virusdetectievirale concentratieextractie van nucle nezurenVirWaTest methodemagnetische deeltjesPCR assayshumane adenovirussenMS2 controle

Gerelateerde artikelen