Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs

13.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59472

⸱

15 mei 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk beschrijft de synthese en karakterisering van een op pomalidomide gebaseerde, bifunctionele homo-PROTAC als een nieuwe benadering voor het induceren van alomtegenwoordige en afbraak van de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), het doelwit van thalidomide analogen.

Samenvatting

De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, alle door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van multipel myeloom, induceren alomtegenwoordig en afbraak van de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3) via de cereblon (CRBN) E3 ubiquitine ligase voor proteasomale afbraak. IMiDs zijn recentelijk gebruikt voor het genereren van bifunctionele proteolyse gericht op chimeras (Protac's) om andere eiwitten op te richten voor alomtegenwoordige en proteasomale afbraak door de CRBN E3 ligase. We ontwierpen en synthetiseerden homobifunctionele Protac's op basis van pomalidomide en analyseerden hun vermogen om zelfgeleide alomtegenwoordige en afbraak van CRBN te induceren. Hier fungeert CRBN als beide, de E3 ubiquitine ligase en het doelwit op hetzelfde moment. De homo-PROTAC compound 8 DEGRADEERT crbn met een hoge potentie met slechts minimale resterende effecten op IKZF1 en IKZF3. CRBN inactivatie door compound 8 had geen effect op de levensvatbaarheid van de cel en de proliferatie van verschillende multipel myeloom cellijnen. Deze homo-PROTAC abrogates de effecten van IMiDs in multipel myeloomcellen. Daarom kunnen onze homodimere pomalidomide-gebaseerde verbindingen helpen om de endogene substraten en fysiologische functies van CRBN te identificeren en het moleculaire mechanisme van IMiDs te onderzoeken.

Inleiding

De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, allemaal goedgekeurd voor de behandeling van multipel myeloom, binden aan de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), een substraat adapter voor cullin4A-RING E3 ubiquitine ligase (CRL4crbn)1,2,3. Binding van imids verbetert de affiniteit van CRL4crbn voor de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3), leidend tot hun alomtegenwoordige en afbraak (Figuur 1)4,5, 6 , 7 , 8. Aangezien IKZF1 en IKZF3 essentieel zijn voor multipel myeloomcellen, resulteert hun inactivatie in groeiremming. SALL4 werd onlangs gevonden als een extra imid-geïnduceerde Neo-substraat van crbn die waarschijnlijk verantwoordelijk is voor de teratogeniciteit en de zogenaamde contergan catastrofe in de jaren 1950 veroorzaakt door thalidomide9,10. Caseïne kinase 1α (CK1α) is daarentegen een lenalidomide-specifiek substraat van CRBN dat betrokken is bij het therapeutische effect in myelodysplastisch syndroom met chromosoom 5q deleties11.

Het vermogen van kleine moleculen om een specifiek eiwit voor afbraak te targeten, is een spannende implicatie voor de moderne Geneesmiddelenontwikkeling. Hoewel het mechanisme van thalidomide en zijn analogen werd ontdekt na hun eerste gebruik bij de mens, werden zogenaamde PRoteolyse targeting Chimeras (protac's) ontworpen om specifiek te richten op een eiwit van belang (POI) (figuur 2)12,13,14,15,16,17,18. Protac's zijn heterobifunctionele moleculen die bestaan uit een specifieke ligand voor de POI verbonden via een linker aan een ligand van een E3 ubiquitine ligase zoals crbn of von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induceren de vorming van een voorbijgaande ternaire complex, dat de POI naar de E3 ubiquitine ligase leidt, resulterend in de alomtegenwoordige en proteasomale afbraak. De belangrijkste voordelen van Protac's ten opzichte van conventionele remmers is dat de binding aan een POI voldoende is in plaats van de remming ervan en daarom kunnen Protac's zich mogelijk richten op een veel breder spectrum van eiwitten, waaronder die welke als niet-Versleep baar werden beschouwd, zoals transcriptiefactoren15. Bovendien, chimerische moleculen handelen katalytisch en hebben daarom een hoge potentie. Na ubiquitine Transfer naar de POI, de ternaire complex dissocieert en is beschikbaar voor de vorming van nieuwe complexen. Zo zijn zeer lage PROTAC concentraties voldoende voor de afbraak van het doelwit eiwit23.

Hier beschrijven we de synthese van een geconjugeerde homo-PROTAC (compound 8) van pomalidomide-pomalidomide, die crbn aanwervent voor de afbraak van zichzelf24. De E3 ubiquitine ligase CRBN fungeert als zowel de recruiter en het doelwit op hetzelfde moment (Figuur 3). Om onze gegevens te valideren, hebben we ook een negatieve binding Control gesynthetiseerd (compound 9). Onze gegevens bevestigen dat de nieuw gesynthetiseerde homo-PROTAC specifiek is voor CRBN-degradatie en slechts minimale effecten heeft op andere eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van PROTAC moleculen

Let op: Raadpleeg voor gebruik alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSD'S). Een aantal van de chemicaliën die in deze syntheses worden gebruikt, zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alstublieft alle geschikte veiligheidspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen.

  1. Bereiding van tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamaat (samenstelling 1)
    1. Voeg 1, 1 '-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) en een katalytisch bedrag van 4-(Dimethylamino) pyridine (5 mg) aan een mengsel van BOC-GLN-OH (2,46 g, 10 mmol) in THF (50 mL) in 100 mL ronde bodem kolf met roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm tijdens het roeren gedurende 10 uur totdat er een heldere oplossing wordt gevormd.
    2. Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een roterende verdamper, voeg EtOAc (200 mL) toe en breng het over in een scheitrechter. Was de organische laag met H2O (50 ml) en pekel (50 ml) en droog hem over na2dus4.
    3. Filtreer de oplossing door een korte pad silicagel (5 cm diameter en 5 cm hoogte) en eluaat met een verder volume (200 mL) van EtOAc.
    4. Damp het oplosmiddel in en droog het verkregen kleurloze vaste stof in vacuo.
  2. Bereiding van tert-butyl N-(1-methyl-2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamaat (samenstelling 2)
    1. Combineer compound 1 (2,28 g, 10 mmol) met gemalen Kaliumcarbonaat (2,76 g, 20 mmol) en DMF (25 ml) in een rondbodemkolf van 100 ml. Voeg met behulp van een spuit iodomethane (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) toe en rust de kolf uit met een geperforeerde rubberen septum. Plaats het reactievat in een bad met ultrasone trillingen voor 2 uur.
    2. Verdun het reactiemengsel met EtOAc (100 mL) en breng het over in een separatoire trechter. Was de organische laag met 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml) en pekel (25 ml), en droog hem over na2dus4.
    3. Filter en damp het oplosmiddel in. Reinig het product per Kolomchromatografie over silicagel (kolom diameter 6 cm en 20 cm hoogte) met behulp van petroleumether/EtOAc (2:1).
  3. Bereiding van 2-(2, 6-dioxopiperidin-3-yl) 4-fluoroisoindoline-1, 3-dione (Compound 3)
    1. Combineer 3-fluorophthalic anhydride (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) en een oplossing van natriumacetaat (0,50 g, 6,0 mmol) in ijsazijn (20 ml) in een rondbodemkolf van 50 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm het mengsel bij 120 °C gedurende 6 uur.
    2. Giet na het afkoelen het paarse mengsel op H2o (100 ml) en roer gedurende 10 min. Verzamel de gevormde vaste stof door filtratie, was met h2o (3 × 5 ml) en petroleumether (3 × 5 ml) en droog in vacuo.
  4. Bereiding van 4-Fluoro-2-(1-methyl-2, 6-dioxopiperidin-3-yl) isoindoline-1, 3-dione (Compound 4)
    1. Combineer 3-fluorophthalic anhydride (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) en een oplossing van natriumacetaat (0,50 g, 6,0 mmol) in ijsazijn (20 ml) in een rondbodemkolf van 100 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm het mengsel bij 120 °C gedurende 6 uur.
    2. Giet na het afkoelen het paarse mengsel op H2o (100 ml) en roer gedurende 10 min. Verzamel de gevormde vaste stof door filtratie, was met h2o (3 × 5 ml) en petroleumether (3 × 5 ml) en droog in vacuo.
  5. Bereiding van tert-butyl N-[2-[2-[2-[[2-] (2, 6-dioxo-3-piperidyl)-1, 3-dioxo-isoindolin-4-yl] amino] ethoxy] ethoxy] ethyl] carbamaat (samenstelling 7)
    1. Laad een ronde bodem kolf van 50 mL met tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl] carbamaat (5, 0,41 g, 1,65 mmol), samenstelling 3 (0,41 g, 1,50 mmol), droge DMF (10 ml) en Dierwt (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Uitrusten met een roer stang en een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 10 uur.
    2. Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met H2O (50 ml) en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter, en concentraat in vacuo.
    3. Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 60 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:1 tot 1:2).
  6. Bereiding van homodimeer (compound 8)
    1. Combineer de α, ω-diamine linker 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dierwt (1,05 ml, 6,00 mmol) en een oplossing van 3 (0,83 g, 3,00 MMOL) in droge DMSO (20 ml) in een ronde bodem kolf van 50 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 18 uur.
    2. Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met H2O (50 ml) en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter en concentraat in vacuuem.
    3. Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 50 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:2) naar EtOAc.
  7. Bereiding van heterodimer (compound 9)
    1. Los samengestelde 7 (0,83 g, 1,65 mmol) op in droge l2cl2 (10 ml). Voeg trifluorazijnzuur (10 mL) toe en roer het gele mengsel bij 40 °C gedurende 2 uur in een gesloten ronde bodem kolf van 50 mL.
    2. Verwijder de vluchtige stoffen en coverdampen met CH2cl2 (4x 5 ml). Droog het residu in vacuuem gedurende 10 uur.
    3. Het materiaal in droge DMF (20 mL) opnieuw oplossen. Voeg samenstelling 4 (0,44 g, 1,50 mmol) en dipea (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) toe en rust de kolf uit met een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 10 uur.
    4. Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met verzadigde NaHCO3 (50 ml), h2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), h2O (50 ml), en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter en concentraat in vacuo.
    5. Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 50 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:2) naar EtOAc.
    6. Elucidate en verifieer de molecuulstructuur (figuur 5a compound 8, 5b compound 9) door 1H NMR en 13C NMR spectra in DMSO-d6 op een nucleaire magnetische resonantie (NMR) Spectrometer. Controleer dat de zuiverheid van beide verbindingen hoger is dan 97% door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), het toepassen van een diode array detectie (DAD) bij 220 – 500 nm.

2. functionele validering van PROTAC moleculen

  1. Western Blot-analyse van CRBN-afbraak door Protac's
    Opmerking: de effecten van samengestelde8en samengestelde9op CRBN eiwit niveau werden getest door Western Blot analyse. Bovendien kan de impact op IKZF1-en IKZF3-niveaus ook worden bevestigd (Figuur 6).
    1. Monstervoorbereiding
      1. Los verbindingen 8 en 9, lenalidomide (len), pomalidomide (POM), MG132 en mln-4924 in DMSO bij een concentratie van 10 mm, aliquot en bewaar bij-80 °c tot verder gebruik.
      2. Zaad 1 x 106 MM1S cellen in een 6-put plaat met 2,5 ml media en behandel cellen met 100 nm of 1 μM samengestelde 8 of 9 voor 24 uur.
      3. Oogst cellen na de behandeling en centrifugeer bij 700 x g, 5 min, 4 °c. Was celpellet met koud 1x PBS om de resterende media te verwijderen, te centrifugeren bij 700 x g, 5 min, 4 °c en supernatant weg te gooien. Herhaal deze stap één keer.
      4. Lyse cellen in lysisbuffer (25 mM tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1x protease & fosfatase inhibitor cocktail) gedurende 10 min op ijs, centrifugeer bij 320 x g gedurende 10 min, 4 °c. Oogst supernatant en bepaal de eiwitconcentratie door een bicinchoninïnezuureiwitassay (BCA-test) volgens het Protocol van de fabrikant.
      5. Denatuur eiwitten (15 – 30 μg/monster) met 1x LDS laad buffer (5% 2-mercaptoethanol) en kook 10 min, 75 °C.
    2. SDS-PAGE
      1. Fix gel sandwich met een 10% scheiding gel [4 mL 3x gel buffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), pH 8,45), 4 mL acrylamide 30%, 2,52 mL glycerol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μl 11% ammonium PERSULFAAT (APS), en 9,75 ΜL TEMED] en een 4% stapelen gel [1,992 mL 3x gel buffer, 0,792 mL 30% acrylamide, 3,168 mL H2O, 36 μL 11% APS en 6 ΜL TEMED] in een elektrode assemblage-eenheid. Verwijder kammen, spoel putten met kathode buffer (100 mM tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) en laad monsters.
      2. Vul de anode-buffer (100 mM tris/HCl, pH 8,9) in de tank. Load eiwit monster uit stap 2.1.1.4 en voer SDS-PAGE uit op 70 V, 20 min, gevolgd door 115 V, 150 min bij constante spanning.
    3. Immunoblotting en detectie van CRBN, IKZF1 en IKZF3
      1. Activeer PVDF-membraan (0,45 μm) in 100% methanol gedurende 1 min. evenwichts membraan en scheidende gel in 1x overdrachts buffer [10x overdrachts buffer (192 mM Glycine, 25 mM tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% methanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
      2. Monteer de blotting cassette volgens het Protocol van de fabrikant. Transfer gel bij 180 mA voor 90 min.
      3. Was membraan 3x in 1x TBS-T (25 mM tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Blok membraan in 5% niet-vetgedroogde melk (NFDM), TBS-T voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was membraan 3x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur.
      4. Incuberen membraan met primair antilichaam voor CRBN (1:500 in 5% BSA, TBS-T) met zacht schudden bij 4 °C, 's nachts.
      5. Was membraan 3x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Inbroed membraan met anti muis (1:10.000 in 5% NFDM, TBS-T) of anti-konijn (1:5.000 in 5% NFDM, TBS-T) secundair antilichaam gekoppeld aan mierikswortelperoxidase HRP (1 uur bij kamertemperatuur.)
      6. Was membraan 2x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer met 1x TBS.
      7. Inincuberen membraan voor 2 minuten met HRP substraat oplossing volgens de protocollen van de fabrikant en detecteren chemiluminescentie in een chemiluminescentie detectie-apparaat.
      8. Was membraan 1x in 1X TBS voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Voor het vrijkomen van antilichamen, strip membraan in commercieel verkrijgbare strip buffer voor 15 min. was membraan 3x in 1X TBS voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur.
      9. Reblokkeer membraan in 5% niet-vetgedroogde melk, TBS-T voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was membraan 3x in 1x TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur en reprobe met IKZF1, IKZF3 of tubuline volgens stap 2.1.3.4.
  2. Competitie experimenten met MG132, MLN4942 of pomalidomide
    Opmerking: om te bevestigen of crbn via het ubiquitin-proteasoom traject is afgebroken, hebben we competitie experimenten uitgevoerd met de proteasoomremmer MG132 en een neddylation activerende enzym (NAE) remmer MLN4942 (Figuur 7).
    1. Zaad 1 x 106 MM1S cellen per put in een 6-well plaat. Voorbehandelen van cellen met 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, of lenalidomide (100x), en incuberen 1 h bij 37 °C, 5% CO2.
    2. Voeg 100 nM compound 8 toe voor 3 uur bij 37 °c, 5% Co2.
    3. Oogst cellen voor Western Blot volgens stap 2.1.1.
  3. Levensvatbaarheid van de cel in multipel myeloom cellijnen
    Opmerking: deze test wordt gebruikt om de impact op de levensvatbaarheid van de cel te testen en bovendien het effect van IMiDs op multipel myeloomcellen te antagoniseren door voor behandeling van de cellen met compound 8 (Figuur 8, figuur 9a, B).
    1. Zaad 5 x 104 MM1S cellen per put in een 96-goed bord in biologische triplicaten voor levensvatbaarheid assay. Voor Western Blot analyse, zaad 1 x 106 MM1S cellen per put in een 6-put plaat in biologische triplicates.
    2. Behandel cellen met DMSO of 100 nM, 1 μM of 10 μM samengestelde 8, samengestelde 9 of pomalidomide en inincuberen voor 24 h, 48 h of 96 h bij 37 °C, 5% Co2. Behandel voor reddingsexperimenten cellen met 100 nM-verbinding 8 voor 3 uur, vóór of na toevoeging van 1 μM pomalidomide en inincuberen voor 96 h.
    3. Meet 96-well plate luminescentie met een lichtgevende cel levensvatbaarheid Assay, volgens het Protocol van de fabrikant op een plaat lezer of oogst cellen uit de 6-well plaat voor Western Blot analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier beschrijven we het ontwerp, de synthese en de biologische evaluatie van een homodimere pomalidomide gebaseerde PROTAC voor de afbraak van CRBN. Onze protac communiceert gelijktijdig met twee crbn-moleculen en vormt ternaire-complexen die zelf-alomtegenwoordige en proteasomale afbraak van crbn induceren met slechts minimale resterende effecten op pomalidomide-geïnduceerde Neo-substraten IKZF1 of IKZF3.

Uit een reeks eerder g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het ontwerp van dergelijke homo-Protac's zoals hier beschreven voor CRBN is gebaseerd op de specifieke affiniteit van pomalidomide aan CRBN, die met succes is gebruikt in talrijke heterobifunctionele Protac's en resulteerde in de ontwikkeling van PROTAC 8 als een zeer selectieve CRBN-Degrader. De specificiteit van ons molecuul is al bevestigd door Proteomic analysen24. Voor genetisch gemedieerde knock-out, uitsluiting en validatie van bijwerkingen is uitdagend en tijdrovend. Boven...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen potentieel financieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether programma KR-3886/2-1 en SFB-1074 tot J.K.; FOR2372 naar M.G.)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,1'-CarbonyldiimidazolTCI chemicalsC0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)Sigma-Aldrich385506Verbinding 6
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 %Alfa AesarA12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 %Acros148270250Toxisch
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABCell signaling15103S
Anti-CRBN-antilichaam geproduceerd in konijnSigmaHPA045910
Anti-konijn IgG HRP-gekoppeld antilichaamSigma7074S
AmmoniumpersulfaatRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI chemicalsB1649
RundserumalbumineSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo luminescente celviabiliteitstestPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, anhydrous, 99.8 %Acros348435000Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 %Acros348445000Extra Dry over Molecular Sieve
GlycineSigma-Aldrich15523-1L-R
Geit anti-muis (HRP-geconjugeerd)Santa Cruz biotechnologysc-2005
Halt Protease & Fosfatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) MabCell signaling14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm)MerckIPVH000010
Jodomethaan, 99 %Sigma-AldrichI8507Zeer giftig
MethanolSigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot elektroforetische transfercelBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658004
MLN4942biomol (cayman)Cay15217-1
Monoklonaal anti-α-Tubulin-antilichaam geproduceerd in muis (B512)SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 %Alfa AesarA11801
Gedroogde melkpoeder zonder vetPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene PlateThermo Scientific136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
NatriumdodecylsulfaatCarl Roth183.1
NatriumchlorideSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDCarl Roth2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamateSigma-Aldrich89761Verbinding 5
TricinCarl Roth6977.4
Trizma baseSigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL sprayAdvanstaK-12049-D50

Referenties

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830(2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cereblon-degradatiePomalidomide-gebaseerde PROTAC'sHomo-PROTAC verbinding 8CRBN-inactiveringWestern blot-analysecellevensvatbaarheidsassaymultipel myeloomcellenIKZF1 IKZF3-degradatieproteasoomremmingNMR-structuurbevestiging
Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.